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1、海洋微生物的研究,全球80%以上的物种蕴藏于海洋中，由于独特的生存环境(如高压、高渗、高温、低温等复杂多变的生态环境)及海洋生物物种间的生态作用远比陆生物种复杂和广泛，赋予海洋生物表现出独特的活性。,海洋微生物种类数百万-数千万种陆地已知大约十万种，剩余的150万种在海洋当中。,致病性微生物霍乱弧菌： 霍乱，胃肠炎，菌血症创伤弧菌：严重致死性感染，坏疽，休克副溶血性弧菌：食物中毒溶藻弧菌，拟态弧菌引起腹泻、中耳炎等金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌，大肠杆菌等,海洋病毒海洋病毒数量是细菌和真菌总和的15倍，每秒钟1023感染，是海洋生物致病的主要原因。虾类：白斑综合征，感染后死亡50%淋巴囊肿病病毒
2、引起河豚损伤贝类：甲肝病毒富集。 海洋真菌：白假丝酵母菌，镰刀菌,20世纪60年代首次报道甲壳纲病毒，目前甲壳类病毒发现30多种，其中对虾病毒有17种左右。太平洋沿岸国家对虾病爆发。对虾杆状病毒（RV-PJ）、系统外胚层和中胚层杆状病毒（SEMBV）、皮下及造血组织坏死杆状病毒（HHNBV）、中国对虾杆状病毒（PCBV）、白斑综合征相关杆状病毒（WSBV）。,5种病毒引起的对虾个体病状、组织病理学相似。主要是皮下组织、造血组织和结蹄组织。病虾的肝胰腺肿大、发白感染的细胞典型的核肿大，易形成包涵体。肠上皮、真皮等发生病变。,传播途径,水平传播食入途径：病虾、粪便接触途径：表面受损。垂直传播卵巢传
3、播：病毒经卵子传染给子代。,诊断技术直接压片技术、暗视野显微镜技术、病理组织学测定、投射扫描电镜、荧光抗体技术、酶联免疫技术、核酸探针、PCR法防治原则尚无有效治疗办法。主要依靠早期治疗病原体、对虾、环境是虾病三要素。,（1）改善养殖环境：部分收获、减少对虾池中的生物量，增加日常换水。（2）控制消灭病原体：干燥，pH，加热，紫外线和消毒剂（3）提高对虾机体抗病能力的研究引进、建立抗病的品种利用药物饵料提高对虾自身非特异性免疫能力制备有效的病毒疫苗进行预防接种是控制病毒流行病流行的重要手段。转基因手段将某种基因转入虾体内，达到抗病目的。a 表达某种病毒包膜蛋白的基因转入虾体内，使之表达。b 将表
4、达某种核酸酶的基因转入虾体内，该酶可以特异性切割病毒核酸。c 将病毒包膜蛋白的反义RNA基因导入虾体，转录，与病毒的包膜蛋白mRNA结合，阻止mRNA翻译成病毒包膜蛋白。,世界海洋微生物的开发研究截至目前为止，全世界范围内已从海洋动植物、海洋微生物中分离到新型化合物10000多种，其中申请专利的化合物数百种。人们已从微生物中发现了30000一50000种天然产物，其中10000多种具有生物活性，8000多种是抗菌和抗肿瘤化合物。,海洋微生物产生的活性物质,海洋生物是新型药物和其它具有独特药用价值的生物活性物质的重要源泉，其代谢产物多具有新颖的化学结构和独特生理功能，包括苷类、甾醇类、生物碱类、
5、多糖、肽类、核酸、蛋白质、酶类等。,1.抗生素类头孢菌素类氨基糖苷类（1）小诺霉素(Mieronomiein):又名相模霉素，因首先从日本相模湾的小单抱菌株中产生的，抗菌谱近似庆大霉素。,（2）氨基糖苷8510-1抗生素:方金瑞等人从厦门鼓浪屿附近的海底的泥样中分离得到一种链霉菌亚种经发酵提取得8510-1。对绿脓杆菌和一些耐药性革兰阴性菌有较强活性。,（3）天神霉素(istamyeins):目前已从海洋微生物如细菌、放线菌、真菌中分离出大量抗生素、抗病毒、抗肿瘤，酶类抑制剂，如天神霉素由海泥的链霉菌S.tenjimariensis中分得的，该抗生素具有强大的抑制革兰阳性菌和革兰阴性菌活性。,
6、2.抗肿瘤活性物质（1）放线菌 抗肿瘤海洋放线菌最先成为海洋微生物抗肿瘤活性物质研究的焦点,是最有经济价值和生物技术价值的原核生物之一。,从放线菌S. sioyaensisSA-1758中分离的生物碱altmaicidin显示强的体外抗L1210鼠性淋巴白血病和IMC癌细胞。Romero等从海洋放射菌L-13-ACM-092的菌丝体中分离到多肽Thiocoraline,该物质对P-388、A-549和MEL-28有强的细胞毒活性。Imamura等从Pelagiobacter variabilis中得到吩嗪抗生素PelagiomicinsA,B和C,在体内外均显示较强的抗肿瘤活性。Fuchao等
7、于2005年从海洋放线菌Streptomycessp.中分离到化合物chinikomycinA和chinikomycin B,其中A在体外对乳腺癌、黑色素瘤和肾癌具有选择性抑制作用。,Fuchao等于2005年从海洋放线菌Streptomycessp.中分离到化合物chinikomycinA和chinikomycin B,其中A在体外对乳腺癌、黑色素瘤和肾癌具有选择性抑制作用。Rajendra等于2004年从海洋放线菌Streptomycessp.中分离到新化合物Trioxacarcins A对肿瘤细胞株HT-29、SF-268、H-460、LXFA 526L、LX-FL 529L、MCF-7
8、、MEXF514L、PC3M和RXF631L都显示了较强的抗肿瘤活性。Mitchll 从海洋沉积物放线菌Streptomyces aureoverticillatus(NPSOO158)中分离得到1种新颖的大环内酰胺(Aureoverticillactam),研究表明该化合物具有抗肿瘤活性。,（2）海洋细菌的抗肿瘤活性物质日本学者 在日本海的海泥中分离到一株海洋细菌AlteromanasHaloplanktis,它能产生抑制肿瘤细胞的离子载体类代谢产物。K. Custafson等从海洋细菌中分离到大环内酯类化合物Maclolactins,其具有抗肿瘤、抗病毒、抗菌等功能。海洋粘球菌Chondr
9、omyces中发现一类新型缩酚酸肽ChondramidesA-D,对多种人类瘤细胞有极强的细胞毒活性。链霉菌培养物中发现的新代谢物anthranilamides能抑制人结肠癌细胞HCT-116。,从佛罗里达水母体内分离到1种海洋细菌可产生新抗生素Salinamide A、B。-Indomycinone是海洋链霉菌产生的抗肿瘤活性物质,对HCT细胞有微弱的细胞毒性。Kameyama从日本海北部约3300米深的海泥中分离到需要由海水配制培养基的菌株teromonas haloplanktis,它能产生一种新型结构的Siderophore类代谢物(Bisucaberin),它与巨噬细胞、纤维肉瘤10
10、23等肿瘤细胞一起培养时,溶瘤细胞作用明显。,从海洋藻青菌lyngbyamajuscula中提取的化合物curacin A也已证明可作用于纺锤体微管蛋白,抑制癌细胞分裂。UMEZAWA报道海洋微生物潮湿黄杆菌Flavobacterium uliginosum能产生一种胞外多糖(Marinactan),能够增强免疫活性,促进体液免疫和细胞免疫,抑制多种动物移植肿瘤,已用于临床。活性物质Kosinostatin和异醌环素B是从海洋小单胞菌属TP-A0468的培养液中分离得到的一类醌环类抗生素,它对人的骨髓性白血病U细胞有明显的细胞毒性,并对21种人类癌细胞具有抑制作用。,（3）真菌抗肿瘤Verdi
11、er Pinard等从加勒比海真菌Lyngbran1ajHSCtlla中分离得到1种酰胺类化合物CuracinA,其具有抗有丝分裂和抗肿瘤活性。从海藻Sargassumtortile分离出1株真菌Leptosphaeriasp,从中分离得到6种新结构的细胞毒性物质(Leptosins),并具有较强的抗肿瘤功能。王书锦 等从辽宁黄海、渤海地区的海水、海泥及海洋动物体中分离的海洋真菌中获得12株能产生抗肿瘤活性先导化合物的菌株,其中1株海洋拟青霉菌具有抗菌抗肿瘤活性。,FENICAL等 从Exserohilum rostratum的培养液中分离得到4种新型化合物RostratinsA-D(1-4)
12、,它们能杀伤HCT-116细胞,该小组还从海洋Fusarium属真菌发酵物中获得3种新的二倍半萜neomangicolsA、B和C,其中A和B具有抑制人克隆癌细胞HCT-116的活性。江红等 在筛选新免疫抑制剂的过程中,从海洋青铜小单孢菌Micromonospora chalcea F IM 02-523发酵液提取到脂肽类化合物FW523,经纯化得到5个组分。组分3( FW523-3)与抗肿瘤抗生素rakicidin B同质,但它具有与紫杉醇相当的抗肿瘤活性和与环孢菌素相当的免疫抑制活性。,3.酶及酶的抑制活性QR(醌还原酶)是一种致癌物质解毒酶,化合物B和C作为QR的激活剂也表现出了中等强度
13、活性。另外,化合物B对细胞色素P450 1A表现出抑制活性,其IC50值为3.0M,化合物C对雌激素生物合成中起重要作用的芳香酶也表现出了微弱的抑制活性。,4海洋生物毒素海洋中有很多生物体内具有生物毒素,这些生物毒素一方面对人体有害,但另一方面在量少的情况下又是很好的生物药品。海参毒素河豚毒素,5.不饱合脂肪酸廿碳五烯酸 EPA廿十二碳六烯酸 DHAEPO促红细胞生成素（Erythropoietin）6.蛋白质及多肽类蛋白质广布于各种生物组织中，在海洋生物尤其是海洋微生物中也是大量存在。7.胡萝卜素,大多数海洋微生物都无法在常规的实验条件下培养，因此极大地限制了从海洋微生物中分离抗肿瘤活性物质
14、的研究，因此未来研究的重点是加强对海洋微生物基础生物学的研究，深入了解海洋微生物的特殊营养要求，尤其是“不可培养微生物”的培养,大多数海洋微生物不能获得纯培养的原因,基于16S rDNA序列分析的研究方法显示,海洋中的绝大多数微生物都未获得纯培养。Kogure 用直接活菌镜检计数法(direct viable count,DVC)发现海水中90%以上的细菌都是活的,但是在培养基平板上却仅有少数的细菌(0.01%0.1%)能形成可见的菌落。大多数海洋微生物不能获得纯培养的原因可能是多方面的。,实验室的纯培养破坏了微生物细胞之间的交流培养条件与原生态环境差别太大氧化胁迫引起细胞损伤生长缓慢的微生物
15、被忽视,由于种种原因,大多数海洋微生物尚未被培养。近年来,不采用培养手段,而利用分子生物学技术和手段,例如宏基因组学(Metagenomics)的方法来获取海洋不可培养微生物的基因资源已逐渐成为一大研究热点领域。,目前对未培养微生物的主要研究手段,FISH（fluorescence in situ hybridization）非放射性原位杂交技术和微放射自显影(microautoradiography)结合起来,称为FISH-MAR或MICRO-FISH。它的目的是在单细胞水平上,将具有放射性标记的底物的代谢途径与系统信息联系起来,但这种方法受到能被放射性同位素标记的底物的限制。其他技术用稳定
16、碳同位素标记的底物,能与生长细胞中的成分结合到一起,如脂肪酸和DNA,这些被同位素标记的成分最终被重新获取并分析。这些方法能够直接洞察环境中微生物的功能。,宏基因组(Metagenomics)泛指某一自然环境中全部微生物的基因组群(the genomes of the total microbiota found in nature)其研究策略克服了绝大多数环境微生物难于通过一般实验室分离培养的现实。宏基因组技术是将样品中的总DNA提取出来后,用核酸内切酶进行部分消化,再与质粒、黏粒、细菌人工染色体等载体连接,转入宿主细胞,构建成宏基因组文库,再筛选新的活性物质或基因。虽然在目前的海洋微生物培养方面,来自基因组的信息还不是一个主要的因素,但它已经被用来为生活在不同环境中的微生物的分离培养设计不同的培养策略 。,半自动化宏基因组海洋药物开发平台,放线紫红素四环素,但是,要获得对微生物生理学的全面了解,或者研究散落在整个基因组中的基因的代谢途径,还是需要对微生物进行纯培养,因此探讨培养微生物的新技术仍然是非常有必要的。,发展的海洋微生物培养新方法,1向培养基中添加微生物生长所必需的成分2降低培养过程中的毒害作用3稀释培养法4高通量培养法5扩散盒培养法6微囊包埋法,
