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1、IVF实验室的基本操作,实验室操作原则,辅助生殖技术基本操作,培养液的准备,培养液的基本组分无机盐离子-维持pH和渗透压碳水化合物-能量来源蛋白质来源抗生素矿物油有利于维持培养液温度、pH值和渗透压稳定防护屏障,减少污染吸收脂溶性毒素防止液体蒸发,培养液的准备 取卵前一日下午进行,原则:高效、方便、安全、经济 四孔培养皿卵处理精液所需培养液微滴培养受精卵、胚胎胚胎移植液,37 , 5% 或 6%CO2培箱内 平衡过夜,卵母细胞的获取,注射hCG后36-38小时取卵阴道超声探头引导下经阴道穿刺抽吸卵泡核对姓名解剖显微镜下辨认卵冠丘复合物OCCC37, 56%CO2 培养 操作迅速,避光,精液处理
2、,正常精液:同IUI极度少精:增加离心力死精症:低渗肿胀实验附睾穿刺精子:睾丸穿刺或活检精子: 1ml注射器针头挑碎组织,离心悬液附睾、睾丸精子的冷冻,常规受精,习惯症:精液正常, 轻度少、弱精症受精率:6580(MII卵)受精时间:长受精、短受精,卵母细胞浆内单精子显微注射,习惯症:严重少弱精、梗阻性无精、畸精症、既往IVF常规受精失败史、某些不明原因不孕等时间:取卵后2小时剥卵:利用透明质酸酶(80mIU/ml)和机械法剥除颗粒细胞,卵母细胞浆内单精子显微注射,卵母细胞成熟度的评价,GV,MI,MII,卵母细胞浆内单精子显微注射,操作滴的准备:7PVP 加精装针显微注射 受精率:70,受精
3、方式的选择,ICSI的安全性？ 逃避了自然选择过程 垂直传递遗传缺陷 操作过程对配子的损伤严格掌握ICSI习惯症,非男性因素不孕ICSI治疗结局,非男性因素不孕症,ICSI未显现出优势,检查受精,时间:受精后1518小时机械法除去颗粒细胞及放射冠正常受精:两个原核,两个极体,合子形态评价,原核的大小、位置及方向核仁前体的数目、大小、分布胞浆的外观早期卵裂情况,异常受精1PN,发生率 15 卵裂率 74% 染色体二倍体率 5 囊胚形成率 29% (Noyes 2008)机制: 雌雄原核发育不同步 雌雄原核融合 孤雌来源 ICSI多见,异常受精多PN,发生率:IVF 5-8% ICSI 1%发生机
4、制: 2精子进入 第2极体滞留 双倍体卵母细胞,未见原核未受精,估计机制 卵母细胞未成熟 卵母细胞染色体异常卵裂率 10% 染色体二倍体率 3% 优胚率低 (12/38) 囊胚形成 (0/12) (Noyes 2008),受精失败,受精率20% 受精率低下 所有成熟卵均未受精 受精失败常规受精周期 失败率 10 精子功能障碍 卵母细胞成熟障碍 补打ICSI?ICSI周期 失败率 23 严重精子畸形 卵母细胞激活 钙离子载体？机械激活？,胚胎培养,胚胎质量评价,胚胎评价标准 细胞数 碎片:无碎片 碎片50% 卵裂球均匀程度,囊胚的评分体系,4AA,囊胚腔的大小,内细胞团细胞分级,滋养层分级,三位
5、评分法,1:不到整个胚胎的一半2 :超过了胚胎体积的一半3 :完全占据整个胚胎4:扩张囊胚5:孵化囊胚 6:孵化后囊胚,A包裹紧密,大量细胞B结构松散,少量细胞C极少量细胞,A许多细胞紧密结合B少量细胞,结构松散C极少量细胞,2AA,5AA,4BA,4CC,胚胎移植操作,选择需要移植的胚胎,移入移植滴内 35岁以下,首次移植的病人移植2枚胚胎 35岁以上,或非首次移植的病人移植3枚胚胎确认核对患者姓名D3 or D5 移植？,移植液,移植液,移植液和胚胎,气, 20l,气,胚胎移植操作,胚胎冷冻,意义:提高累计妊娠率,幸免多胎,减少卵巢过度刺激风险温度的急剧变化形成冰晶 机械性损伤 溶质性损伤
6、 渗透压损伤 核心:幸免冰晶形成冷冻方法:慢冻速融法 玻璃化冷冻法冷冻保护剂 渗透性保护剂:EG PRON 甘油 非渗透性保护剂:蔗糖 大分子物质,胚胎的冷冻:慢速冷冻,1、5M丙二醇0、1M蔗糖,慢冻速融法,冷冻程序 207 3/min -7 人工植冰 -730 0、3/min -30120 30/min,胚胎复苏,1,2,3,4,0、5M丙二醇0、2M蔗糖 5min,0、2M蔗糖 5min,PBS 5min,1、0M丙二醇 0、2M蔗糖 5min,预防冰晶的再形成 复苏程序: 室温 40s 30水浴 1min,胚胎冻融损伤,复苏胚胎评价:50%卵裂球完整 存活 复苏率90%无损伤胚胎着床率高 部分损伤胚胎着床能力下降,玻璃化冷冻,原理条件:高浓度冷冻保护剂 极快的降温速度载体:开放式 密闭式习惯症:卵母细胞 囊胚优点:复苏率高,其他技术-IVM,未成熟卵母细胞体外成熟(IVM)优点:简便 经济 幸免OHSS体外培养24-48hIVM培养液,感谢您的聆听！,
