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1、多学科综合,第一章 脑科学研究的方法和手段,多层次的研究,研究水平,整体行为水平：行为学，躯体感觉，视听觉，痛觉等细胞水平：神经细胞培养、生物电活动检测、通路示踪、细胞染色、免疫化学、凋亡检测分子水平的实验：离子通道、受体、酶、遗传物质等,一、形态学方法二、生理学方法三、电生理学方法 四、生物化学方法 五、分子生物学方法 六、脑成像（Brain imaging）技术,一、形态学方法,常规染色和特殊染色束（通）路追踪法 荧光组织化学法原位杂交法 受体定位法神经系功能活动形态定位法,1.常用普通染色方法,TTC染色 HE锇酸染色氯化金浸染 Cajal银浸染色 尼氏染色,HE（苏木素伊红）,锇酸染色
2、是神经科学研究的一种常用而普遍的方法，它本来是用来固定脂质的，由于髓鞘的主要成分是脂质，所以用于有髓神经纤维的染色,锇酸染色,氯化金浸染,运动终板,Ach荧光染色,氯化金浸染,Cajal银浸染色,尼氏染色,多种方法，HE、甲苯胺蓝，焦油紫，硫堇，天青，派洛宁，中性红以及棓花青等碱性苯胺染料均可以使尼氏体着色,2、束（通）路追踪法：研究神经元之间的联系,束路追踪,原理：轴浆运输示踪物质：HRP，荧光染料，各种标记物标记的葡萄糖，放射性核素标记的氨基酸等。观察：根据示踪物质不同，采用组织显色、荧光显微镜或放射自显影等方法。,轴浆运输法利用神经元轴浆运输现象的追踪法. 追踪剂：辣根过氧化物酶(hor
3、seradish peroxoidase, HRP)、荧光染料包括核黄(nuclear yellow)、固蓝(fast blue)及荧光金(fluorogold)、植物凝集素如麦芽凝集素(wheat germ agglutinin, WGA)和菜豆凝集素(phaseolus vulgaris agglutinin)、细菌毒素如霍乱毒素、病毒如活的神经病毒 (胞疹病毒和弹状病毒）,l变性法：利用神经元包体受损或神经轴突离断后远侧轴突的变性，或轴突切断后细胞的反应，来研究纤维的联系。 *物理性方法：刀的切割、电凝、电离破坏、超声破坏等。 *化学性破坏：兴奋性氨基酸（海人酸和鹅高蕈氨酸）、单胺类神经
4、毒（羟多巴胺、羟多巴、双羟色胺）,神经元质膜荧光染料法： 用羰花青（carbocynine）荧光染料，可以染出神经细胞的质膜，并可以在活体或固定的标本上追踪纤维联系。,最新研究进展：华人学者绘制小鼠大脑神经网络图,不同的大脑区域必须相互沟通才能控制复杂的思想和行为，但目前对于这些区域组织成为广阔神经元网络的机制却相对知之甚少。2014年2月27日细胞（Cell）杂志上的一项新研究中，南加州大学董宏伟等研究人员采用神经元示踪技术绘制出了一张小鼠全脑图谱，揭示了大脑皮质中数百条神经元通路。在显微镜下将可见的荧光分子注入到整个小鼠大脑皮质的不同区域，这些小分子沿着“细胞高速公路”运输，标记了大约60
5、0个神经元通路。研究人员采用高分辨率显微镜扫描了这些大脑区域，构建出了皮质连接的图像数据库。,当研究人员分析这些连接时，他们发现大脑皮质是一个高度组织化的网络，由八个子网络构成，它们协调活动反映动物的情感和感觉。并且，子网络之间以一种非常特殊的方式来共享这一信息。“这些研究发现挑战了流行假说：大脑皮质是一个单一的网络，在这一网络中所有一切都密集连接在一起。”接下来，研究人员可将来自这一重要哺乳动物模型系统的解剖数据与大量现有的分子遗传数据合并来鉴别神经细胞基本类型。“确定全脑的结构组织将是朝着揭示脑功能以及在神经系统疾病中功能障碍的结构基础迈出的基本且令人兴奋的一步，”董宏伟说。,我们真的会永
6、远不老吗？从“科学狂人”的抗衰老研究说起,John Craig Venter的身上从不缺乏话题。从单枪匹马与人类基因组计划展开竞争、时代杂志将他与人类基因组计划代表Francis Collins同时选为封面人物，到宣布制造出首个能够自我复制的活细胞“Synthia”，轰动了整个学术界，Venter的每一个举动，在学术界都会引起波澜。前阵子，他又宣称将组建新公司HLI，组建史上最大的基因组数据库，结合基因组学、生物信息学及干细胞疗法，致力于抗衰老研究，并延长人类寿命。,【为什么我们会追求不老和长寿】对于不老和长寿的探索，恐怕是除了“我们是谁”“我们从哪儿来”之外，人们思考的第三个问题了“我们能否
7、一直存在下去”。【对衰老和长寿的基因研究】有一个规律，很多问题，如果解释不了，就说它是由于基因决定的，多半错不到哪里去。也因此，生物学家、医学家们纷纷开始将遗传学和分子生物学结合，从基因的角度开始对长寿和衰老问题的探索。,目前基因方面的研究主要有两个方向，长寿基因和衰老基因。这里说的并不是单一的基因，而是与长寿和衰老有关的多种基因，它们之间的相互作用带来了不老和长寿的结果。衰老的表现为染色体端粒长度的改变、DNA损伤、甲基化等，衰老的终点就是死亡，这些因素也是影响长寿的原因。有科学家认为，端粒（细胞核两端的特殊DNA片段）长度决定生物的寿命，端粒的缩短会导致细胞分裂的停止和死亡的来临。发现端粒
8、的三位科学家获得了2009年诺贝尔生理学或医学奖。目前“长寿基因”和“衰老基因”还不能完全确定，但有学者认为，消除自由基的某些酶类基因、与细胞生长调控有关的某些基因与长寿和衰老相关。对于长寿和衰老基因，科学上还需要继续发现更多的相关基因，理清那些导致衰老、影响长寿的基因群及其之间的联系，才能在理解基因组的基础上，解决衰老、长寿的问题。,【其他长寿和抗衰老的办法】除了基因研究外，还有抗衰老制剂的研究。褪黑素与微量元素是被认为有抗衰老作用的物质。褪黑素的自由基清除能力在众多自由基清除剂中表现特别突出，而微量元素摄入不协调，将导致衰老。还有一种说法，节食能够延长寿命。这背后的生物学原理是：生长激素和
9、胰岛素信号途径在起作用。科学家通过对猴子、酵母菌、果蝇等动物的研究中验证了减少卡路里摄入能够延长寿命的理论。另一些科学家提出引起机体衰老和疾病的是自由基的增多，这也是现实生活中那些宣称“清除自由基，恢复年轻态”的保健品所依赖的理论基础。这些保健品疗效有限，请不要轻易尝试。除了遗传因素之外，人生活的环境、人的心理状况等多方面因素都会影响到寿命。保持愉悦的心情，健康的生活方式，良好的饮食习惯，这样即使躯体不可避免的老化，但还是有年轻的心态，总好过长寿但不快乐，年轻的外表下，却住着一个老灵魂。,对于长寿基因及衰老基因的发掘，也有不赞同的声音。他们认为这违反了伦理道德，假使我们不老不死，那么进化的要领
10、“生存和繁殖”，也会越来越少的被考虑，我们将剥夺后代的生存机会。技术的进步带来的潜在社会问题，还有待进一步去解决。就目前的研究状况来看，长寿不意味着不会永生，科学的帮助下，人们有机会将有限的生命拉长，将有限的生命过得更有质量，实现不老不病的愿望。此时又想到了Venter先生，据悉，Venter曾作为美国海军医疗队的医院参加越战，战场的残酷使他认识到生命和时间的宝贵，他认为人生的每一分钟都应该有所创新。撇开进化的需要不谈，试想有一天，我们不再会变老，没有疾病，寿命很长，我们是否还会像出生即知将死的时候那样，珍惜生命中的每一天，而努力奋斗呢。,3、荧光组织化学法,用特异性抗体显示神经组织化学成分的
11、方法。,基本过程有：固定、制片、反应等三步。 l免疫组织化学反应：有直接法和间接法 l 双重免疫组织化学染色：主要是为了研究两种物质在同一细胞或突起内的共存现象，或含两种不同化学物质的相互关系。,免疫组化,根据二抗标记的不同（荧光素、酶、铁蛋白、胶体金或银标记），免疫组化包括免疫荧光、免疫酶组织化学、免疫金银及铁标记技术,核酸分子杂交技术，检测细胞内mRNA和DNA序列片段，原位研究细胞合成某种多肽或蛋白质的基因表达。基本原理是根据两条单链核苷酸互补碱基序列专一配对的特点，应用已知碱基序列并具有标记物的RNA或DNA片段即核酸探针（probe），与组织切片或细胞内的待测核酸（RNA或DNA片段
12、）进行杂交，通过标记物的显示，在光镜或电镜下观察目的mRNA或DNA的存在与定位。,4、原位杂交法,此项技术需首先制备某种核酸探针，其种类主要有三种：利用大肝杆菌重组带有目的基因的质粒DNA，制成互补DNA探针(cDNA)；应用限制性核酸内切酶消化制成线性DNA模板，在体外转录获得反义RNA探针(cDNA)；依照待测核酸的核苷酸序列，应用DNA合成仪合成寡聚核苷酸探针。cRNA和cDNA的常用标记物有32S、32P、3H等放射性核素和荧光素、生物素、地高辛等非放射性物质。,组织学应用的原位杂交术主要是染色体原位杂交和细胞原位杂交。前者是研究遗传基因、抗原基因、受体基因、癌基因等在染色体上的定位
13、与表达；后者是研究细胞某种蛋白质的基因转录物mRNA在胞质内的定位与表达。核酸分子杂交术有很高的敏感性和特异性，它是免疫细胞化学的基础上，进一步从分子水平探讨细胞功能的表达及其调节机制的，已成为当前神经生物学研究的重要手段。,5、受体定位法：研究受体在神经系统内的定位,配体法：主要在组织切片上进行，利用标记的配体和受体结合以示踪其部位 免疫组织化学法：用针对受体的抗体,6、神经系功能活动形态定位法,脱氧葡萄糖法： 原理是：神经元活动时其能量代谢增加，而其能量代谢主要依赖葡萄糖。在脑内存在脱氧葡萄糖(2-deoxy-D-glucose,2DG)时，神经元可不加区别地将2DG与葡萄糖一起摄入细胞内
14、，两者都是己糖激酶的底物。但2DG在其被磷酸化成2DG-6-PO4后，不能被磷酸己糖异构酶进一步转化为果糖-6-PO4，不能继续在糖酵解循环中代谢。如在2DG上标以同位素。神经元内同位素的堆积程度反映了神经元的活动程度。,c-fos(Fos)法： c-fos是一种原癌基因，属于即刻早期基因类(immediate-early gene).很多刺激条件可通过第二信使引起神经元c-fos的表达增加，形成fos mRNA。由fos mRNA翻译成的Fos蛋白，立即转位至细胞核内，与另一即刻早基因c-jun 所产生的蛋白Jun构成二聚体（第三信使），调节其靶基因的表达，引起一系列的细胞反应。,细胞色素氧
15、化酶法： 神经元线粒体内的细胞色素氧化酶是提供神经元能量的重要酶，细胞色素氧化酶的水平与神经元能量需求密切相关，一般反映慢性刺激的结果。,二、生理学方法,损毁法刺激法周身给药法脑室注射法脑组织培养亚细胞分析神经递质释放量的测定 神经递质的功能测定 行为学方法 最常用的有两种：神经行为学、电生理学,1、神经递质释放量的测定（在体in vivo和离体in vitro),推挽灌流法： 在体研究中枢核团递质释放的有用方法。通过推挽灌流套管，使灌流液直接灌流脑组织，从流出液中分析神经递质的变化。,脑透析术(brain dialysis)： 在特定的脑区内，植入透析探头，用生理溶液灌流时，细胞外液中的神经
16、递质可顺浓度递度从透析管扩散至灌流液中，收集和测定灌流液中神经递质的含量，就能监测该递质的变化过程。脑透析术的装置包括探头、导管、微量灌流泵、样品收集器和定量分析仪。,抗体微探针法：是在玻璃微电极上涂上一层神经肽抗体，用于在中枢神经系统内定位神经肽的释放。,硼硅玻璃与r氨丙基三乙氧硅烷（r-aminopropyltri- etriethoxysilane）反应后在玻璃表面形成一层带有游离氨基的硅氧烷(siloxane)多聚体微粒。该玻璃再用戊二醛(glutaraldehyde)处理，使戊二醛与蛋白质A以共价键方式偶联，蛋白质A再与神经肽抗体结合，制成抗体微探针,脑片灌流法突触体灌流法,2、神经
17、递质的功能测定,微电泳：能将微量的神经递质导入神经元附近，观察其作用。抗体微量注射：特异性的抗体注射在某些部位，可中和神经末梢释放出而进入突触间隙的神经肽，防止其与受体结合。因此，抗体微量注射所引起的功能变化可解释为消除该神经肽的生理效应的结果。生物检测（Bioassay）: 经典的方法.如用水蛭背最长肌测定ACh 的作用，灵敏度达10-10g.,3、行为学方法,l经典条件反射：代表了刺激与强化的关系。l操作式条件反射：是通过动物自身的某个特定操作动作而获得食物或回避有害刺激的反应活动。,Behavioral neuroscience is the study of the neural me
18、chanisms mediating normal and abnormal behaviors. 自主活动动物焦虑检测：实施焦虑因素，如饮食或饮水剥夺，检测反应，可以用于药物筛选。性和生殖行为：进化，神经内分泌作用机制学习记忆摄食行为惊恐反射社会行为 .,自主活动箱实验,动物的自主活动标志着动物中枢神经系统的兴奋状态，当中枢神经系统兴奋时，自主活动加强，抑制时则自主活动减少。观察动物自主活动是评价中枢神经兴奋状态的一项主要指标。多种作用于中枢神经系统的药物都可影响动物的自主活动，因而自主活动的记录是研究中枢神经系统药物的主要方法，而且在新药研究中，观察药物对动物自主活动的影响也是评价药物是否
19、影响中枢神经系统的重要方法,自主活动箱实验,主要技术指标：运动次数,洞板实验,学习记忆的行为学检测,学习记忆功能包括空间学习记忆功能和非空间学习记忆功能。随着对大脑学习记忆机制研究的不断深入以及寻找有效防治认知障碍类疾病方法的需要，使得动物行为学实验成为研究脑高级功能及其他神经科学的不可缺少的重要手段，客观准确地评价实验动物的学习记忆水平已成为神经生物学和神经药理学中非常重要的研究内容。,学习记忆功能检测的常用实验程序,Morris迷宫,1981年，英国心理学家Morris首次设计应用了这种水迷宫及其程序。目的是帮助大脑学习记忆机制的研究。起初实验动物主要为大鼠，此后该迷宫系统成为评估啮齿类动
20、物空间学习和记忆能力的经典程序，广泛运用于神经生物学、药学等领域的基础和应用研究中。,Morris水迷宫,应用:判断动物空间学习记忆能力组成:,观察指标:潜伏期，路径，不同象限的停留时间和长度，搜索策略等,Morris水迷宫,Morris水迷宫,原理 水是啮齿类动物非常厌恶的刺激或环境。鼠在水池中就会急于寻找逃路。它们的习性为在水池四周寻找出口逃避，但深而光滑的垂直池壁阻碍了这种企图。实验中设置的水下平台（用于小鼠的常为水面下1 cm）可提供鼠栖身的场所。但在巨大的水面上，强迫游泳的动物不能看见平台。它们若要快速找到平台而避免淹没就必须利用环境中的线索进行定位。从而检测了鼠记住环境中的线索及其
21、与平台位置关系而对平台进行定位的能力（学习记忆能力）。,Morris水迷宫的优点,由于对年龄相关性空间记忆损害有可靠的敏感性，Morris水迷宫是判断老年小鼠空间学习记忆能力的特别有用的工具。驱动动物逃避的是水刺激，而不需要食物和水的剥夺。因此，避免了剥夺食物和水后给实验动物带来的新陈代谢方面的问题。动物不必接受电休克，这在那些食欲促进任务（appetitive tasks）如辐射状迷宫和T迷宫中是常规的要求。能提供较多的实验参数，系统全面地考察实验动物空间认知加工的过程，客观地反映其认知水平。将实验动物的学习记忆障碍和感觉、运动缺陷等分离开来，减少它们对学习记忆过程检测的干扰。既可以检测空间
22、参考记忆又可以检测空间工作记忆。在用固定平台测试小鼠的空间参考记忆后再将平台的位置改为不固定，就可检测它们的工作记忆能力。显然，寻找不固定平台的认知过程要复杂一些，需要动物对时间和空间上的分离信息加以整合和判断。操作简便，数据误差较小。,Morris水迷宫的不足之处,由于需要监视系统及分析软件，只有少数装备较好的实验室可以实施。实验程序的设计需要考虑的因素较多，同时需要实验者具备一定的神经生理学、认知生理学和数理统计方面的知识，给实验的开展和结果的解释带来困难，同时也限制了该迷宫的深入广泛的应用。由于体力消耗太大，体温也丧失过多，年老体弱鼠完成任务较困难。并非所有鼠株都适合于Morris迷宫测
23、试，如BALB/c不能学会该任务（成绩并不随天数的增加而进步），129/SvJ的学习成绩也偏差。个体间的成绩差异巨大。某些株，如129/SvJ株的小鼠由于有年龄相关性视路病变(visual pathology)，在衰老时完成以视觉为基础的学习记忆任务时就会出现困难。在C57BL/6株，由于严重的秃头症（alopecia）存在，可能使某些小鼠产生抑郁，加上溃疡性皮炎，最终可能影响小鼠的游泳能力而影响实验成绩。对轻微的学习记忆能力的减退，该迷宫程序可能不敏感。所占实验场地过大。,Lashley III水迷宫,Lashley III水迷宫,是一种相对复杂的迷宫。它含有动物必须学会避免的盲端（culs
24、-de-sac）和动物必须做出正确的左或右拐弯的T选择。实验进行5天，每天进行2次测试（上下午各1次）。每天的2次测试被平均。指标包括：学习指数（正确进入数/进入总数）、游向目标时的盲端进入数及T选择错误数、向后进入总数、逃生所用时间等。,八臂放射状旱迷宫,八臂放射状旱迷宫，是Olten和Samnelson在1976年设计的，做为一种评估大鼠空间学习记忆的方法。它可以同时评估实验动物的工作记忆和参考记忆。原理 利用食物作为激励措施而到达目的地，饥饿的动物需要实行特别的搜索顺序或利用最短的时间或最小的错误来寻求奖赏。,八臂放射状旱迷宫,装 置 八臂放射状旱迷宫是由从中央平台伸出的8个相等的臂呈放
25、射状排列组成，8臂中有4臂的末端放有食物，在同一天的整个实验过程中哪些臂中含有食物保持固定不变，但每天之间均有改变。迷宫周围有若干空间线索。实验前大鼠需被剥夺食物和水，实验开始时，大鼠被放在中央平台处后去寻找食物。在实验中大鼠需记住哪些臂已被探索过，食物已被摄取，以避免再次进入，从而在最短的时间内获得最大量的食物。同时，在每天的实验结束后，大鼠还必须放弃当天的记忆信息，以准备适应第二天的实验。,八臂放射状旱迷宫,应用 评估动物工作记忆和参考记忆 工作记忆是指利用一个仅仅在短时间内的保留信息，或称为实验特定信息（trial-specific information）而获得的记忆，它是对实验中可变
26、事物的记忆能力。 参考记忆是对持续存在的信息，或称为任务特定信息（task-specific information）的记忆，它是对实验中不变事物的记忆能力。,八臂放射状旱迷宫,观察指标时间测定和错误积分存在的问题优点：同时评估实验动物的工作记忆和参考记忆不足：气味的影响。包括食物的气味、其他动物的气味以及动物自身的气味。实验动物被限制食物和水，由此会带来的影响。并且不同的食物奖赏也可产生明显的影响；另外，动物种属的不同使其在食物需求上也可导致不同的结论。,穿梭箱实验,试验装置实验箱大小为50cm16cm18cm。箱底部格栅为可以通电的不锈钢棒，箱底中央部有一高1.2cm的挡板，将箱底部分隔成
27、左右两列。实验箱顶部有光源，蜂鸣音控制器。训练时，将大白鼠放入箱内任何一侧，20s后开始呈现灯光和（或）蜂鸣音，持续15s，后10s内同时给以电刺激(100V，O.2mA，50Hz，AC)。最初，动物只对电击有反应，即逃至对侧以回避电击。20s后再次出现条件刺激并继之在动物所在侧施以电刺激，迫使动物跳至另一侧如此来往穿梭。当蜂鸣音或灯光信号呈现时，大白鼠立即逃至对侧安全区以躲避电击，即认为出现了条件反应(或称主动回避反应)。每闲天训练一回，每回100次。约训练45回后动物的主动回避反应率可达8090。此法可同时观察被动和主动回避性反应.此外 从动物的反应次数也可以了解动物系处于兴 奋或抑制状态
28、。,穿梭箱实验,自动记录系统可以输出以下内容：(1)动物序号；(2)遭受刺激次数；(3) 遭受刺激时间；(4) 主动回避反应时间。 以上各值均为在设定的穿梭次数内反应的总和。遭受电激次数是被动回避的次数，该值与设定循环次数之差即为主动回避次数；刺激时间是指动物在被动回避过程受到电刺激的时间和，该值愈小，说明动物被动反应愈敏捷，主动回避时间是指动物在接受条件刺激的时间长短，该值越短，说明动物主动回避反应越迅速,跳台试验,跳台实验属一次性刺激回避反应实验（ONE TRAIL AVOIDANCE TEST）。 装置：试验装置为一长方形反射箱，大小为10cm10cm60cm，用黑色塑板分割成5间。地面
29、铺以栅栏，间距0.5cm，可以通电，每间角落置一高和直径均为4.5cm的平台。,跳台试验,原理 在一个开阔的空间，动物大部分时间都在边缘及角落里活动。在一个方形中心设置一个高的平台，当把动物放在平台时，它几乎立即跳下平台并向四周探索接近边缘指标 潜伏期：记录动物从上平台到第一次下平台的时间操作步骤 一个典型的例子包含三个过程：熟悉过程 学习过程 记忆检测熟悉过程：将动物放在平台上，开始计时，至动物跳下。此时间段为潜伏期。动物探索10s以后，放回笼中学习过程：动物一旦从平台上跳下后，立即受到电刺激，然后放回笼中记忆检测：学习试验24h后，将实验动物重新放回平台上，记录跳下平台的潜伏期。动物跳下平
30、台或持续停留在平台上标志着验的结束（终止时间为60s）。将动物放入反应箱内适应环境3min，然后立即通以36V交流电。动物受到电击，其正常反应是跳回平台以躲避伤害性刺激。多数动物可能再次或多次跳至栅栏上，受到电击后又迅速跳回平台。如此训练5min，并记录每鼠受到电击的次数或叫错误次数（number of errors），以此作为学习成绩。24h后重做测试，此即叫记忆保持测试。记录受电击死亡动物数、第一次跳下平台的潜伏期和3min内的错误次数。,三、电生理学方法,电生理学的方法包括胞外记录、胞内记录、脑内电刺激、电压钳、膜片钳、脑电图等技术。 1、电生理常用仪器 阴极射线示波器:高灵敏度，扫描速
31、度慢 生物电放大器 电子刺激器 贮存和分析电生理实验结果的仪器： 如示波器照相机和计算机。,2、电生理学的常用方法 细胞外记录(Extracellular recording)：把引导电极安放在神经组织的表面或附近引导神经组织的电活动。胞内记录(Intracellular recording)：研究神经元基本生物物理特性的有力手段。EPSP,IPSP,AP(动作电位)脑内电刺激：是研究中枢功能定位的方法之一。,顺行冲动记录法(Orthodromic impulse recording)：就是电刺激某一突触前的细胞体、树突或轴突，在此突触后神经元细胞体上记录此刺激引起的电活动变化。逆行冲动记录法
32、(Antidromic impulse recording)：逆行冲动记录法即电刺激神经元的轴突主干或末梢，在同一神经元胞体记录反相传导的动作电位。,电压钳技术(Voltage Clamp)： 通过插入细胞内的一根微电极向细胞内补充电流，补充的电流量正好等于跨膜流出的反向离子流，这样即使膜通透性发生改变时，也能控制膜电位数值的不变。经过离子通道的离子流与经微电极施加的电流方向相反，数量相等。,SG:信号发生器，FBA:反馈放大器，V监测膜电位,膜(斑)片钳技术（Patch Clamp）： 可以从分子水平研究细胞膜离子通道的功能，是用玻璃微电极吸管和只含个离子通道，面积为几个平方微米的细胞膜通过
33、负压吸引封接起来，由于电极尖端与细胞膜的高阻封接，此片膜内开放所产生的电流流进玻璃吸管，用一极敏感的电流监视器（斑片钳放大器）测量此电流强度，就代表单一离子通道电流。,膜片钳（patch clamp）,内尔(Neher) 萨克曼(Sakmann) （1944-） （1942-） （德国细胞生理学家） （德国细胞生理学家） 合作发明了膜片箝技术，并应用这一技术首次证实了细胞膜上存在离子通道。这一成果对于研究细胞功能的调控至关重要，可揭示神经系统、肌肉系统、心血管系统及糖尿病等多种疾病的发病机理，并提供治疗的新途径。 二人共获1991年诺贝尔奖。,膜片钳,经典记录模式： 贴附式（Cell-atta
34、ched 或 on cell) 内膜向外式(Inside-out) 外膜向外式(Outside-out) 全细胞记录方式(Whole-cell recording),脑电波测定: 用双极或单极引导法，将引导电极放在脑活动区颅骨表面之上，可以记录出能变换方向的微弱电流。通过强力放大记录出来的电位称脑电图（）。,诱发电位: 中枢神经的任何部位对于故意刺激感受器官，感受神经、感觉通路上的任何一点，或与感觉器官有关的任何结构上的一点，所产生的电变化，叫做诱发电位（evoked potential)。,经典的生物化学方法包括：离心电泳层析质谱等由于生物化学方法与药理学、免疫学等其他学科相结合，又发展了：
35、放射免疫(Radioimmunoassay，RIA)放射受体免疫印迹等方面,四、生物化学方法,1、用离心法分离制备突触小体及突出小体膜 突触小体: 是指脑组织在等渗溶液中匀浆时，神经末梢的细胞膜从轴突上自发断裂、封闭而形成的神经末梢单位。它包括突触前膜、突触后膜及致密斑和包围在突触前膜的突触小泡(vesicle内含神经递质)，线粒体及胞浆蛋白质。由于突触小体是神经介质及受体的主要聚集部位，突触小体的制备便成了神经介质及受体的基本制备手段。,离心（centrifuge）,离心技术主要用于各种生物样品的分离和制备，生物样品悬浮液在高速旋转下，由于巨大的离心力作用，使悬浮的微小颗粒（细胞器、生物大分
36、子的沉淀等）以一定的速度沉降，从而与溶液得以分离，而沉降速度取决于颗粒的质量、大小和密度。,离心,离心机种类制备型离心机 普通：（6000rpm以下） 高速冷冻（25000rpm以下） 超速（可达5000080000 rpm ）分析型离心机,离心,制备型离心方法差速沉降离心法 密度梯度区带离心法（简称区带离心法）,2、层析法: 特点：分离生物活性物质时不使其失活，可大量制备。 基本原理：被分离物质与支持物相互作用的紧密程度不同，流洗时被洗脱的难易程度不同。,常用层析方法,离子交换层析凝胶过滤层析亲和层析疏水层析高效液相,离子交换层析,凝胶过滤层析,亲和层析,3、放射免疫(radioimmuno
37、assay,RIA)测定神经介质： 利用抗体(Ab)特异地识别其抗原（Ag）的原理，将抗原标记放射性同位素（*Ag），用来测定与*Ag抗原性相同的物质。,4、放射受体测定受体法： 利用标记能作用于不同靶组织内各种受体的递质和激素，从而达到直接测定配体与其受体形成络合物的过程和理化特性。,5、免疫印迹法（immunoblotting 或western blotting）鉴定生物分子： 是将电泳凝胶分离出来的电泳带移到特殊的滤膜上，再利用标记抗体与滤膜上某一蛋白质或肽的特异结合，使其显色。 优点：一是将传统的电泳凝胶染色法的敏感度提高了1001000倍，二是RIA与相似，能从多种蛋白质中选择鉴定出
38、一种特异的蛋白质，其敏感性可达1ng，同时又能知道这一蛋白质的分子量，这又是RIA无法达到的。,6.电泳,电泳是指带电颗粒在电场的作用下发生迁移的过程。 电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。 电泳技术有很多种方法，介绍最常用的两种：,水平板式电泳槽,垂直板式电泳槽,稳压稳流电泳仪,蛋白质SDS-PAGE电泳,染色结果,琼脂糖凝胶电泳,天然琼脂（agar）是一种多聚糖，主要由琼脂糖（agarose，约占80%）及琼脂胶（agaropectin）组成。琼脂糖是由半乳糖
39、及其衍生物构成的中性物质，不带电荷，而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象。因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳。琼脂糖凝胶电泳常用于分离、鉴定核酸: 如重组质粒的鉴定，DNA酶谱制作等。,凝胶的制备与电泳,样品配制与加样,染色和拍照,五、 分子生物学方法,、神经生物学研究中常用的分子生物学方法基因的分子克隆克隆后的基因在人工体外表达系统或细胞中的表达克隆后的基因作为探针研究基因表达的组织特异性和发育阶段特异性研究基因转录调控区的结构特征有助于理解基因转录调控机制,2、聚合酶链式反应（PCR）： 在神经生物学研究中有广泛的用途，
40、如可应用它发现和分析新基因，测定mRNA,、反向遗传学利用制造体内基因突变的方法研究基因及其产物的功能： 通过制造定向突变改变生物表型的方法与传统遗传学所采用的通过生物表型确定其基因型的方法相反，故称反向遗传学。,、遗传连锁分析法分离遗传病基因： 人类基因组由23条染色体组成，基因组内大约包含510万个基因，其中40%在脑内表达。约有1000多种遗传病具有明显的中枢神经系统症状，占已知遗传病总数的三分之一。,六、脑成像（Brain imaging）技术,利用各种方法和技术来摄取人及动物颅骨和颅内组织结构的摄像，从而了解其异常的技术。可以反映颅骨的密质差异、颅腔以及其他邻近结构。,1、颅骨X射线
41、照相术：以基本的X射线设备和X射线照像技术即可获得颅骨的X射线照片。、同位素脑扫描(Isotope brain scanning)： 检查脑损伤，将特定的同位素标记物给观察对象静脉注射，待标记物进入脑部后，即以射 线扫描仪或r摄像机获得系列扫描图。,、脑超声波(Cerebral ultrasound)、脑血管造影术(Cerebral angiography)、计算机断层扫描术（Computerized tomography, CT）、核磁共振成像(Magnetic resonance imaging, MRI) 7、正离子发射断层扫描术（position emission tomography
42、,PET）：是利用发射正电子的同位素作为标记物，将其引入脑内某一局部地区参与已知的生化代谢过程，利用现代化计算机断层扫描技术将标记物所参与的特定代谢过程的代谢率以立体成像的形式表达出来。可测量脑组织对G的利用和脑的局部血流量,BRAINS from a healthy aged adult (left) and a patient with Alzheimers disease (right) differ markedly. The execess of dark shading in the second image shows that brain activity is impaire
43、d.,Positron Emission Tomography (PET，正电子发射计算机断层显像),O15 Water,FDG orF18 fluorodeoxyglucose,18F-FDG PET脑代谢显像，正常人与老年性痴呆对照，患者双侧顶叶、颞叶皮质对称性低代谢。,18F-DOPA PET脑受体显像，正常人与帕金森氏病脑纹状体多巴胺受体密度影像对照，患者双侧纹状体密度明显减少,CT or CAT scan(Computed Tomography),Magnetoencephalography (脑磁波描计术，MEG),151 Channel MEG,Current flow in n
44、eurons creates local magnetic fields MEG measures local magnetic field changes from the surface of the scalp using superconducting coils or SQUIDs Excellent temporal resolution Better spatial resolution than ERP,MRI vs MEG,Magnetic Resonance Imaging (MRI),fMRI (functional magnetic resonance imaging),Brain activity,Oxygen consumption,Cerebral blood flow,OxyhemoglobinDeoxyhemoglobin,Magnetic susceptibility,T2*,MRI signal intesity,
