生化产品检测与分析课程总结课件.ppt

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1、,一.考试题型介绍二.内容串讲三.每章重点四.习题讲解,总复习,一.考试题型介绍,(一). 名词解释题（310=30）(二). 简答题（65=30）(三)计算题（2-3题,20）(四). 阐述题(102=20),二.内容串讲,第一章 绪论（一）生化产品检测与分析的目的和意义（二）生化产品检测与分析的内容（三）生化产品检测与分析的方法,第二章 生物工程分析的基础知识,（一）样品的采集、制备和保存（二）生物样品预处理的方法（三）误差及分析方法的选择重点：进行样品分析的流程，样品的制备与预处理方法，分析方法的选择原则。从哪些方法来保证测定结果的准确度。,第4章 化学分析法,（一）概述（二）酸碱测定法

2、（三）氧化还原滴定法（四）重量法重点：蛋白质及氨基酸的测定中的凯氏定氮法、还原糖的直接滴定法以及脂类测定的经典方法（索氏提取法）的原理、方法及注意事项。,第5章 紫外-可见吸收光谱法,（一）紫外-可见吸收光谱定义 检测范围（二）朗伯-比耳定律（三）紫外-可见分光光度计（四）分析条件的选择（五）测定方法（六）紫外-可见吸收光谱的应用重点：光的吸收定律；分析条件的选择。生色团、助色团，红移、蓝移的定义。,第6章 荧光分光光度法,（一）荧光的产生（二）激发光谱与荧光光谱（三）荧光分析仪器（四）荧光分析方法特点及应用重点：激发光谱与荧光光谱；具有荧光性质的分子的结构特征，荧光分析方法与紫外可见分光光度

3、法的区别与联系。,第7章 薄层色谱法,（一）概述（二）薄层色谱的基本原理（三）薄层色谱的操作技术（四）薄层色谱法定量分析（五）薄层色谱法在生物工程分析中的应用重点：薄层色谱的基本原理和薄层色谱的操作技术；比移值，分配系数，分离度的含义及应用。,第8章 气相色谱分析法,（一）概述和基本理论（二）定性分析方法（三）定量分析方法（四）气相色谱检测器（五）气相色谱的应用重点：塔板理论，定量方法的分类特点及适应范围、气相色谱仪结构组成和气相色谱检测器的选择和应用。,第9章 高效液相色谱法,（一）高效液相色谱法的特点（二）高效液相色谱的基本理论（三）高效液相色谱的固定相和流动相（四）液相色谱仪（五）高效液

4、相色谱的应用重点：高效液相色谱仪的组成部分及作用原理；检测器的分类及应用范围；固定相和流动相的选择；气相色谱与液相色谱的区别与联系。,第10章 电泳法和高效毛细管电泳法,（一）概述（二）电泳法和高效毛细管电泳法的基本理论（三）电泳仪和高效毛细管电泳仪（四）应用示例重点：电泳法和高效毛细管电泳法的分离模式,第12章 酶法分析,12.1 概述12.2 酶法分析方法和应用示例12.3 酶联免疫分析法,重点:酶法分析的方法和应用范围,第14章 生物传感器,（一）概述（二）酶传感器（三）核酸传感器（四）几种新型生物传感器重点：生物传感器的定义模型和制作的主要方法以及电化学方法中常用的电极类型。,生物工程

5、分析的定义： 是一门研究和讨论生物工程领域所需要的分析检验技术的方法、原理、仪器装置、操作要点以及应用范围等为主要内容的工具学科。,第1章 绪论,三.每章重点,分析化学,化学分析,仪器分析,酸碱滴定,配位滴定,氧化还原滴定,沉淀滴定,电化学分析,光学分析,色谱分析,波谱分析,重量分析,滴定分析,电导、电位、电解、库仑极谱、伏安,发射、吸收，荧光、光度,气相、液相、离子、超临界、薄层、毛细管电泳,红外、核磁、质谱,1.理化检验篇(1)生化产品营养成分的测定(2)水分、矿物元素的测定(3)酶活力的测定,生物工程分析的主要内容:,第1章.绪论,2.仪器分析篇 (1)紫外、可见吸收光谱法 (2)荧光分

6、光光度法 (3) 薄层色谱法 (4)气相色谱法 (5)高效液相色谱法 (6)电泳法和高效毛细管电泳法 (7)生物传感器,第2章 生物工程分析的基础知识,一.样品分析流程: 样品的采集、制备和保存，样品的预处理，成分检验与分析，数据处理，整理报告。二.正确采样，必须遵守的原则：代表性,三.预处理方法分类：1.溶解法2.蒸馏法（1）常压蒸馏（2）减压蒸馏（3）水蒸气蒸馏（4）分馏（5）扫集共蒸馏法3.有机物破坏法 干法灰化 湿法消化:是加入强氧化剂（如浓硝酸、高氯酸、高锰酸钾等），使样品消化，而被测物质呈离子状态保存在溶液中。4.溶剂提取法 溶剂分层法浸泡法盐析 5.色层分离法6.其它的生化分离提

7、纯技术,四.分析方法的评价指标 在研究一个分析方法的好坏时，通常用精密度、准确度和灵敏度三项指标评定。此外还考虑线性和线性范围、耐用性等.1.精密度 是指对同一样品多次测定，每次测定结果与均值的符合程度。2. 准确度 指测定值与真值之间的符合程度。3. 灵敏度 是指化学反应中能检出的最低量。,4. 特异性 指分析测定中对某一成分起反应，其他物质对反应无影响或基本无影响。,二. 提高分析精确度的方法(控制和消除误差的方法),1 正确选取样品的量 2 增加平行测定次数 3 对照实验4 空白实验5 回收实验6 校正仪器和标定试剂7 严格遵守操作规程,（二）回收试验 目的是检测误差，以衡量分析方法的准

8、确度。是在样品中加入一定量被测物质，然后用同样方法测定，测得值与理论值之比乘以100%即为回收率，合格的回收率应为100%5 %。,第4章 化学分析法,4.2 酸碱滴定法,蛋白质系数:表示1份含氮量相当于蛋白质含量的份数. 不同的产品蛋白质其氨基酸构成比例及方式不同，故不同产品的蛋白质系数有差异。,蛋白质的测定方法,*凯氏定氮法,双缩脲比色法,紫外吸收法,Folin-酚比色法,染料染色法,中性醋酸铅,乙酸锌和亚铁氰化钾溶液,硫酸铜和氢氧化钠溶液,还有碱性醋酸铅、氢氧化铝溶液、活性炭等。,糖的测定常用澄清剂的种类,铁氰化钾法,4.3.1 还原糖的测定-直接滴定法(斐林氏容量法),原理 将一定量的

9、碱性酒石酸铜甲、乙液等量混合，立即生成天蓝色的氢氧化铜沉淀；沉淀很快与酒石酸钾反应，生成深蓝色的可溶性酒石酸钾钠铜络合物。 在加热条件下，以次甲基蓝作为指示剂，用样液滴定，样液中的还原糖与酒石酸钾钠铜反应，生成红色的氧化亚铜沉淀； 这种沉淀与亚铁氰化钾络合成可溶的无色络合物；二价铜全部被还原后，稍过量的还原糖把次甲基蓝还原，溶液由兰色变为无色，即为滴定终点； 根据样液消耗量可计算出还原糖含量。, 此法测得的是总还原糖量。 在样品处理时，不能用铜盐作为澄清剂，以免样液中引入Cu2+，得到错误的结果。 碱性酒石酸铜甲液和乙液应分别贮存，用时才混合，否则酒石酸钾钠铜络合物长期在碱性条件下会慢慢分解析

10、出氧化亚铜沉淀，使试剂有效浓度降低。,说明与讨论, 滴定必须在沸腾条件下进行，其原因一是可以加快还原糖与Cu2+的反应速度；二是次甲基蓝变色反应是可逆的，还原型次甲基蓝遇空气中氧时又会被氧化为氧化型。此外，氧化亚铜也极不稳定，易被空气中氧所氧化。保持反应液沸腾可防止空气进入，避免次甲基蓝和氧化亚铜被氧化而增加耗糖量。,滴定时不能随意摇动锥形瓶，更不能把锥形瓶从热源上取下来滴定，以防止空气进入反应溶液中。,样品溶液预测的目的；一是本法对样品溶液中还原糖浓度有一定要求(0.1%左右)，测定时样品溶液的消耗体积应与标定葡萄糖标准溶液时消耗的体积相近，通过预测可了解样品溶液浓度是否合适，浓度过大或过小

11、应加以调整，使预测时消耗样液量在 10 mL 左右；,5.加速灰化的方法:,(1) 改变操作方法 样品初步灼烧后取出坩埚冷却 在灰中加少量热水搅拌使水溶性盐溶解，使包住的碳粒游离出来 蒸去水分干燥灼烧(2) 加HNO3(1:1)或30%H2O2 使未氧化的碳粒充分氧化并且使它们生成NO2和水，这类物质灼烧时完全消失，又不至于增加残留物灰分重量。(3) 加乙酸镁、硝酸镁等，使碳粒不被包裹,同时得作空白实验。,4.5.1 总灰分的测定,灰分测定步骤,在坩埚中称取定量样品在电炉中炭化至无烟 在马福炉中灼烧到灰白色(灰化) 降至200 放入干燥室内冷却称重灼烧1小时 冷却到恒重灰分%=（灰分重量/样品

12、重量 ）100,三.脂类物质提取剂的选择,经典方法,索氏提取器,虹吸管,联接管,4.常用的脂类提取剂有哪些?,5.索氏提取法的原理、仪器构造、优点和操作过程分别是什么？索氏提取法的原理：脂肪不溶于水，易溶于乙醚、石油醚、氯仿等溶液中。用乙醚等有机溶液提取样品中脂肪等再经蒸发除去有机溶剂，经称重就可知粗脂肪的含量。优点：即用易挥发溶剂在索氏提取器里不断地蒸发、冷凝、溶解被提取物、纯溶剂再蒸发、冷凝、溶解被提取物，一直到把被提取物提取干净。这一方法简单、提取完全。 仪器：索氏提取器操作过程：球瓶内放有机溶剂，经水浴加热使溶剂不断蒸发。提取筒内装样品，溶剂蒸气经冷凝器冷凝后不断滴入提取筒内。溶剂在此

13、与样品充分接触，溶解其中的脂肪。经过一定时间后，溶剂不断蒸发，冷凝，样品受到一次次新鲜溶剂的浸泡，直到样品中所有的脂肪完全溶出止。,第5章 紫外-可见分光光度法,5.1 紫外-可见吸收光谱5.2 朗伯-比耳定律5.3 紫外-可见分光光度计5.4 分析条件的选择5.5 紫外-可见吸收光谱的主要用途,电子跃迁有哪几种类型,这些类型各处于什么波长范围?n, n,跃迁，200nmn跃迁，吸收波长为150250nm跃迁，吸收波长处于远紫外区的近紫外端或近紫外区150250nm之间n跃迁，吸收波长250nm800nm之间,n 跃迁 200 nm200400 nm（近紫外区） ，可用于结构鉴定和定量分析。

14、可见吸收光谱：电子跃迁光谱，吸收光波长范围400750 nm ，主要用于有色物质的定量分析,2. 生色团与助色团,生色团： 最有用的紫外-可见光谱是由和n跃迁产生的。这两种跃迁均要求有机物分子中含有不饱和基团。这类含有键的不饱和基团称为生色团。简单的生色团由双键或叁键体系组成，如乙烯基、羰基、亚硝基、偶氮基-NN-、乙炔基、腈基-CN等。助色团： 有一些含有n电子的基团(如-OH、-OR、-NH、-NHR、-X等)，它们本身没有生色功能(不能吸收200nm的光)，但当它们与生色团相连时，就会发生n-共轭作用，增强生色团的生色能力(吸收波长向长波方向移动，且吸收强度增加)，这样的基团称为助色团。

15、,Alg（I0/It)=-lgT= b c A：吸光度，描述溶液对光的吸收程度； b：液层厚度(光程长度)，通常以cm为单位； c：溶液的摩尔浓度，单位molL-； ：摩尔吸光系数，单位Lmol-cm-； 或: Alg（I0/It)= a b c c：溶液的浓度，单位gL- a：吸光系数，单位Lg-cm- a与的关系为：a =/M （M为摩尔质量）,1.朗伯-比耳定律,朗伯-比耳定律是吸光光度法的理论基础和定量测定的依据。应用于各种光度法的吸收测量； 摩尔吸光系数在数值上等于浓度为1 mol/L、液层厚度为1cm时该溶液在某一波长下的吸光度； 吸光系数 a 相当于浓度为1 g/L、液层厚度为1

16、cm时该溶液在某一波长下的吸光度。,紫外可见分光光度计基本组成,光源,单色器,样品室,检测器,显示,二、分光光度计的类型,1.单光束 简单，价廉，适于在给定波长处测量吸光度或透光度，一般不能作全波段光谱扫描，要求光源和检测器具有很高的稳定性。,2.双光束 自动记录，快速全波段扫描。可消除光源不稳定、检测器灵敏度变化等因素的影响，特别适合于结构分析。仪器复杂，价格较高。,第6章 荧光分光光度法,（一）荧光的产生（二）激发光谱与荧光光谱（三）荧光分析仪器（四）荧光分析方法特点及应用重点：激发光谱与荧光光谱；具有荧光性质的分子的结构特征。,荧光与分子结构的关系,（2）共轭效应 * 跃迁 芳香族化合物

17、。共轭双键结构有利于发光。 共轭体系越大,越易产生荧光,荧光效率也增大.,电子跃迁类型大部分荧光化合物电子跃迁的能级是由* 跃迁或n* 电子跃迁而被激发的。,（3） 刚性平面结构,酚酞(无荧光),8羟基喹啉(弱荧光),红色荧光,荧光素,联二苯 = 0.2,芴 = 1.0,3,4-苯并芘,( 强荧光物质),刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。,（4）取代基的影响,给电子基增强荧光： OH,OR,NH2,NHR,NR2,CN吸电子基减弱荧光： COOH,C=O,NO2,NN,Cl,Br,I与体系作用小的取代

18、基影响不明显： SO3R,NH3,SH,F,R。,取代基之间若发生氢键，增强分子平面性和刚性会加强荧光:,测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品池、双单色器系统、检测器。 特殊点：有两个单色器；光源与检测器通常成直角；单色器位置不同；比色皿不同(荧光要用四面透光的),6.3.1 荧光分光光度计,第7章 薄层色谱法,（一）概述（二）薄层色谱的基本原理（三）薄层色谱的操作技术（四）薄层色谱法定量分析（五）薄层色谱法在生物工程分析中的应用重点：薄层色谱的基本原理和薄层色谱的操作技术。,7.2 薄层色谱法的基本原理,1.保留参数（Rf值）用来表征斑点位置的基本参数是保留因子，通常称作比移值，

19、用Rf表示。,原点,S,R,W,Ls,L。,Lr,原点,参比,样品,前沿,3.分配系数K= cS / cm ，表示，即分离达到平衡时，组分在固定相和流动相的浓度之比。4.分离度,7.3.4 流动相与展开体系,1.液-固吸附 在该色谱中，溶质的保留和分离选择性决定于三个因素：,溶解能力,相互作用,一.展开体系:,定量计算外标法：此法是薄层定量最常用的方法。定量时，点样量必须准确，样品与对照品应点在同一块薄层板上。用已知含量的对照品得出样品含量的一种方法。内标法:选一个纯度高、化学性质稳定、在薄层上能与对照品分开的物质作内标物，并准确称取加到被测物中，根据内标物的质量算出被测物的含量。,薄层色谱法

20、分离样品的步骤.,制板,第8章 气相色谱分析法,（一）概述和基本理论（二）定性分析方法（三）定量分析方法（四）气相色谱检测器（五）气相色谱的应用重点：塔板理论，定量方法的分类特点及适应范围、气相色谱仪结构组成和气相色谱检测器的选择和应用。,二. 气相色谱法的定义：,GC是一种以气体为流动相的柱色谱法.根据所用的固定相状态不同,可分为气固色谱和气液色谱.固定相（stationary phase):色谱法中，填入玻璃管内静止不动的一相（固体或液体）称为固定相。如离子交换树脂法中的树脂相。流动相(mobile phase):自上而下运动的一相（一般是气体或液体）称为流动相。色谱柱(chromatog

21、raphy column):装有固定相的管子称为色谱柱。,四、气相色谱仪结构及一般流程,1-载气钢瓶；2-减压阀；3-净化干燥管；4-针形阀；5-流量计;6-压力表；4-针形阀；5-流量计;6-压力表；9-热导检测器；10-放大器；11-温度控制器；12-记录仪；,载气系统,进样系统,色谱柱,检测系统,温控系统,1. 基线与基线漂移,基线：在色谱操作条件下，仅有流动相通过监测器时，由记录仪得到的信号时间曲线。基线漂移：基线随时间定向缓慢地变化。,基线,基线漂移,图8-1 某物质的色谱图,8.2 基本理论,8.2.1 基本概念,2.死时间与死体积,死时间（dead time）：不被固定相吸附或溶

22、解的惰性组分，从进样到出峰的峰顶点之间测得的时间，以tM表示。死体积（dead volume）：死时间内流动相流经色谱柱的体积，又指色谱柱填充固定相后的空隙体积。,图8-2 某组分的色谱图,3.保留时间、调整保留时间、保留体积、调整保留体积,保留时间（retention time）:从进样到组分峰顶点之间测得的时间，用tR表示。调整保留时间（adjusted retention time）：组分的保留时间扣除死时间后的时间。保留体积（retention volume）：从进样开始到监测器中样品浓度最大时，流动相流经色谱柱的体积。调整保留体积（adjusted retention volume）

23、:保留体积扣除死体积后的体积。,图8-3 某组分的色谱图,4.相对保留因子与分配因子,相对保留因子21 （relative retention value）：组分2与基准组分1的调整保留时间之比.12. 分配因子 k,6.分离度,分离度也称分辩率。它是指相邻两色谱峰保留值之差与两峰底宽平均值之比。一般情况下，当R1时，两峰总有部分重叠；当R1时，两峰能明显分离；R1.5时，两峰已完全分离。更大的R值，分离效果会更好，但会延长分析时间。,6.分离度,分离度也称分辩率。它是指相邻两色谱峰保留值之差与两峰底宽平均值之比。一般情况下，当R1时，两峰总有部分重叠；当R1时，两峰能明显分离；R1.5时，两

24、峰已完全分离。更大的R值，分离效果会更好，但会延长分析时间。,分离方程,由上式可得,（二）理论板数和理论塔板高度的计算,理论塔板高度H为使组分在柱内两相间达到一次分配平衡所需要的柱长理论塔板数n组分流过色谱柱时，在两相间进行平衡分配的总次数,一.范第姆特（Van Deemter ）方程式,吸收了塔板理论的有效成果H，并从动力学角度较好地解释了影响柱效的因素给出H与载气线速度u的关系,流速与柱效的关系,最佳流速,8.4 检测器,气相色谱检测器,1.热导池检测器,2.氢火焰离子化检测器,3.电子捕获检测器,4.火焰光度检测器,气相色谱中常用的检测器,1.热导检测器TCD,对可挥发性的有机和无机物都

25、有响应,根据各种物质和具有不同的热导率，采用热敏元件进行测定,1321 热导检测器示意图,返回,灵敏度较低，适应于常量和10-6数量级以上的样品分析。,2.氢火焰离子化检测器FID,检测含碳有机化合物,被测组分出色谱柱后，与氢气混合，进入离子室火焰区，生成正负离子，并向两极移动，形成离子流，经放大后送至记录仪记录,1321 氢火焰离子化监测器示意图,返回,3.电子捕获检测器ECD,对具有电负性的物质，如含卤素、硫、磷、氮的物质有响应，而对非电负性的物质无响应。, 放射源将载气（如N2）电离为游离基和低能电子：N2 N2 + +e电负性的物质进入检测器后，捕获低能电子：AB+e- AB-+E从而

26、使基流下降，产生负讯号-倒峰,1322 电子捕获检测器示意图,返回,4.火焰光度检测器FPD,对含硫、磷的化合物具有响应,含硫有机化合物在富氢焰（H2:O2 3:1）中燃烧：RS+O2 SO2+CO2 SO2+ 8H 2S + 4H2OS + S S 2 （激发态：回到基态时发射394nm的特征光）含磷有机物燃烧形成HPO碎片，发射526nm的特征光。,1323 火焰光度检测器示意图,返回,定量分析方法,1.外标法,2.内标法,3.归一化法,三种方法各有其优缺点和适用范围，应根据实际情况，具体选用。,continue,（4）定量分析方法：外标法(类标准曲线法),将待测组分的纯物质配成不同浓度的

27、标准溶液，使浓度与待测组分接近，然后取固定量的上述溶液进行色谱分析，得到各标准样品的对应色谱图。,某组分的标准物质的色谱图,再在同样的条件下（同样的色谱操作条件和进同样的体积），分析待测试样，得到色谱图。,图1313 某样品的色谱图,以标准样品的色谱峰面积作图，得到一条标准曲线，再在标准曲线上根据待测样品的峰面积查出待测组分的浓度。,图1314 标准工作曲线图,外标法的特点： 操作简单，因而适用于工厂的控制分析和自动分析，但结果的准确度取决于进样量的重现性和操作条件的稳定性。,返回,内标法,方法：准确称取样品，加入一定量的某种纯物质作为内标物，然后进行色谱分析，根据被测组分和内标物在色谱图上相

28、应的峰面积（或峰高）与相对校正因子，求出待测组分的含量。注意：此处所用内标物与外标法中的标准物质不同。内标物一定是样品中不存在的，内标峰应和各组分的峰分开，并尽量接近待测组分。内标物可以是测量相对校正因子时所用的基准物。,图1315某化合物的色谱图,内标法的计算公式,内标法的优点：由于内标法是通过测量内标物及待测组分的峰面积的相对值来进行计算的，因而可在一定程度上消除操作条件的变化所引起的误差。内标法的缺点：在试样中增加了一个内标物，这常常给分离带来一定的困难。,返回,（4）定量分析方法 ：归一化法,要求：样品中的所有组分都能出峰。,图1316 某样品的色谱图,归一化法：把试样中所有组分的含量

29、之和按100%计算，以它们相应的色谱峰面积或峰高作为定量参数，通过下式计算各组分的含量,归一化法特点,优点：简便、准确、操作条件（如：进样量、流速等）变化时，对分析结果影响较小，这种方法常用于常量分析，尤其适用于进样量很少而其体积不易准确测量的液体样品。缺点：经过色谱分离后，样品中所有的组分都要能产生可测量的峰,返回,固定相类型极性固定相：正相色谱 以极性有机基团如胺基（-NH2）、腈基（-CN）、醚基（-O-）等键合在硅胶表面制成的 非极性固定相：反相色谱是C18(ODS)、C8和苯基键合相的填料，,反相色谱是当今液相色谱的最主要分离模式。,流动相的极性小于固定液的极性（正相 ）;流动相的极

30、性大于固定液的极性（反相 ）。,1.流程图,第四节 高效液相色谱仪,为什么要进行梯度洗脱？在进行多成分的复杂样品的分离时，经常会碰到前面的一些成分分离不完全，而后面的一些成分分离度太大，且出峰很晚和峰型较差。为了使保留值相差很大的多种成分在合理的时间内全部洗脱并达到相互分离，往往要用到梯度洗脱技术。,(3) 梯度洗脱,梯度洗脱操作在液相色谱中流速（压力）梯度和温度梯度效果不大，而且还会带来一些不利影响，因此，液相色谱中通常所说的梯度洗脱是指流动相梯度，即在分离过程中改变流动相的组成或浓度。,定义：流动相中含有两种（或更多）不同极性的溶剂，在分离过程中按一定的程序连续改变流动相的配比和极性，以提

31、高分离效果。优点：分离时间缩短，分辨能力增加，峰形改善,a. 紫外检测器基于Lambert-Beer定律，即被测组分对紫外光或可见光具有吸收，且吸收强度与组分浓度成正比。应用最广，对大部分有机化合物有响应。,(6) 检测器,b. 荧光检测器（Fluorescence detector）,高灵敏度、高选择性； 对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应。,用于检测阳离子和阴离子，在离子色谱中应用最多。其检测原理是根据组分在某些介质中电离后所产生的电导的变化而测定该组分的含量。,C.电导检测器（ECD）,D.示差折光检测器 (RID),又称折射率检测器。原

32、理：基于样品组分的折射率与流动相溶剂折射率有差异，当组分洗脱出来时，会引起流动相折射率的变化，这种变化与样品组分的浓度成正比。是通用型检测器,E.蒸发散射光检测器（ ELSD）,ELSD是基于溶质的光散射性质的检测器,因为散射光强只与溶质颗粒大小和数量有关，而与溶质本身的物理和化学性质无关，所以ELSD属通用型和质量型检测器。适合于无紫外吸收、无电活性和不发荧光的样品的检测。与示差折光检测器相比，它的基线漂移不受温度影响，信噪比高，也可用于梯度洗脱。,液相色谱与气相色谱的比较 液相色谱所用基本概念和基本理论基本一致。 液相色谱所用的仪器设备和操作条件与气相色谱不同，所以，液相色谱与气相色谱有一

33、定差别，主要有以下几方面：,（1）应用范围不同 GC仅能分析在操作温度下能气化而不分解的物质。对高沸点化合物、非挥发性物质、热不稳定化合物、离子型化合物及高聚物的分离、分析较为困难。致使其应用受到一定程度的限制，只有大约20%的有机物能用气相色谱分析； HPLC则不受样品挥发度和热稳定性的限制，它非常适合分子量较大、难气化、不易挥发或对热敏感的物质、离子型化合物及高聚物的分离分析，大约占有机物的70 - 80%。,（2）流动相的作用不同气相色谱的流动相载气是色谱惰性的，不参与分配平衡过程，与样品分子无亲和作用，样品分子只与固定相相互作用。液相色谱流动相液体也与固定相争夺样品分子，为提高选择性增

34、加了一个因素。也可选用不同比例的两种或两种以上的液体作流动相，增大分离的选择性。,（4）色谱柱： GC填充柱16m，毛细管柱20100m，螺旋型； HPLC 15cm或25cm，直型。,（3）操作条件：GC需高温；HPLC通常在室温下进行，高压（液体粘度大，峰展宽小）。,(5)分离效率不同HPLC：大于3万塔板/米（GC：103塔板/米）,(6)仪器构造不同HPLC:脱气装置，高压泵GC：汽化室，温控系统,第10章 电泳法和高效毛细管电泳法,(Electrophoresis and High Performance Capillary Electrophoresis, HPCE),毛细管电泳定

35、义,毛细管电泳是带电粒子在电场力的驱动下，在毛细管中按其淌度或分配系数不同进行高效、快速分离的电泳新技术，也称为高效毛细管电泳。,第10章 毛细管电泳 10.1.3 分离模式1 毛细管区带电泳（CZE）,也称为毛细管自由溶液区带电泳 毛细管电泳中最基本的操作模式，应用最广泛，是其它各种操作模式的母体,第10章 毛细管电泳 10.1.3 分离模式2 胶束电动毛细管色谱,胶束电动毛细管色谱:是以电渗流驱动的一种色谱技术胶束电动毛细管色谱 MECC:是以胶束为假固定相的一种电动色谱，是电泳技术和色谱技术的结合,加入高于胶束临界浓度的表面活性剂,第10章 毛细管电泳 10.1.3 分离模式3 毛细管凝

36、胶电泳,CGE 是毛细管自由溶液区带电泳派生出的一种电泳方式 用多孔性的凝胶或其它筛分剂作介质，网状结构，按分子的大小分离,第10章 毛细管电泳 10.1.3 分离模式6 毛细管等电聚焦,CIEF: 建立在不同蛋白质或多肽之间等电点（pI值）差异基础上的分离方法，通过建立pH值梯度。蛋白质的等电点(pI): 指蛋白质分子的表观电荷数为零时的pH值。,第12章 酶法分析,12.1 概述12.2 酶法分析方法和应用示例12.3 酶联免疫分析法,重点:酶法分析的方法和应用范围,1.酶法分析常用的分析方法:初速率法固定时间分析法固定变化分析法平衡分析法酶偶联分析法,2.酶法分析的应用类型,酶活性的测定

37、底物及底物类似物的测定活化剂和抑制剂的分析测定,常规测定酶活力的操作步骤,（1）对样品酶液进行适当稀释（2）进行酶促反应（3）测定反应量：一般是测定反应产物生成量。具体的方法根据被测物质的理化性质而定（4）计算酶活力（u/ml，u/g）,测定反应量,如果反应物或产物光学性质变化明显，可采用紫外光、可见光、旋光或荧光等光学仪器进行测定如果pH或电化学性质变化大，可采用酸碱滴定或电位滴定等方法测定如果底物或产物能与另外的试剂进行显色或产生其它表观性状易检测的反应，则可取出一定的反应样液，通过化学反应显色等方法进行底物或产物变化量的测定。,第14章 生物传感器,（一）概述（二）酶传感器（三）核酸传感

38、器（四）几种新型生物传感器重点：生物传感器的定义模型和制作的主要方法以及电化学方法中常用的电极类型。,1. 生物传感器的模型,14.1概述,是生物传感器的心脏，核心技术,感受器,检测器,2. 定义由感受器对待测物质进行分子识别，发生生物化学变化，产生的信息通过换能器转变成电信号或光信号，由检测器检测出待测物质的含量的一种分析方法。感受器换能器 信号转换器检测器,5. 生物传感器的特点,高选择性。,体积小、可以实现连续在线监测。,响应快、样品用量少，且由于敏感材料是固定化的，可以反复多次使用。,传感器连同测定仪的成本远低于大型的分析仪器，因而便于推广普及。,底物 产物,酶传感器工作原理,14.6

39、 免疫传感器,免疫传感分析 特点：利用抗原、抗体所具有的高灵敏度、高选择性的结合做为分子识别手段进行分析。免疫传感器分类：非标记免疫传感器和标记免疫传感器两类,1 非标记免疫传感器,原理： 抗体与抗原（蛋白质）的结合有高度选择性，当两者结合时，蛋白质分子发生各种性质变化，如携带的大量电荷会产生电位变化，继而引起事先固定了抗原或抗体的各种转换元件电化学及物理参数的改变。,2 标记免疫传感器,标记：以酶、荧光物质、电活性化合物、放射性同位素等为标记物。（1）竞争法：用一定量的标记过的抗原加入到被测的非标记抗原中，此时非标记抗原与标记抗原与传感器表面抗体发生竞争反应，再通过抗原-抗体结合体中“标记”性信号的检测，实现非标记抗原的测量。（2）夹心法：抗原与传感器表面抗体结合后，再加标记抗体与抗原结合，,标记免疫传感器,