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1、一章基因工程药物检验,基因工程药物与一般药物比较：,它是利用活的细胞作为表达系统，所获得蛋白质产品往往相对分子质量较大，并具有复杂的结构；许多基因工程药物是参与人体一些生理功能精密调节所必需的蛋白质，极微量就可产生显著效应。,宿主细胞中表达的外源基因，在转录或翻译、工艺放大等过程中，都有可能发生变化。,一、基因工程药物质量要求,(1)要求提供关于表达体系的详细资料，以及工程菌(或工程细胞)的特征、纯度(是否污染外来因子)和遗传稳定性等资料。(2)提供培养方法和产量稳定性、纯化方法以及各步中间产品的收率和纯度、除去微量的外来抗原、核酸、病毒或微生物等方法。,(3)要求进行理化鉴定，包括产品的特征
2、、纯度及与天然产品的一致性。一般纯度应在95%以上。(4)要求进行外源核酸和抗原检测，规定每剂量DNA含量不超过l00pg，细胞培养产品中小牛血清含量须合格。成品中不应含有纯化过程中使用的试剂，包括层析柱试剂和亲和层析用的鼠IgG。,(5)生物活性或效力试验结果应与天然产品进行比较。(6)基因工程产品的理化和生物学性质与天然产品完全相同者一般不需重复所有动物毒性试验，与天然产品略有不同者需做较多试验，与天然产品有很大不同者则须做更多试验，包括致癌、致畸和对生育力的影响等。(7)所有基因工程产品都必须经过临床试验，以评价其安全性和有效性。,二、基因工程药物的质控要点,(一)原材料的控制(二)生产
3、的控制(三)最终产品的质量控制,1、表达载体和宿主细胞 应提供有关表达载体详细资料，包括基因的来源、克隆和鉴定、表达载体的构建、结构和遗传特性。,(一) 原材料的控制,2、克隆基因的序列 应提供插入基因和表达载体两侧端控制区的核苷酸序列。所有与表达有关的序列均应详细叙述。,3.表达 应详细叙述在生产过程中，启动和控制克隆基因在宿主细胞中的表达所采用的方法及表达水平。,(二)生产的控制,在工程菌的贮存中，要求种子克隆纯而稳定； 在培养过程中，要求工程菌所含的质粒稳定， 始终无突变； 在重复生产发酵中，工程菌表达稳定； 始终能排除外源微生物污染。,1、原始细胞库 应详细记述种子材料的来源、方式、保
4、存及预计使用寿命；应提供在保存和复苏条件下宿主载体表达系统的稳定性证据；采用新的种子批时，应重新作全面检定。,2、有限代次的生产 提供培养生产浓度与产量恒定性的数据；依据宿主细胞-载体系统稳定性，确定最高允许传种代数和细胞倍增数，并应提供最适培养条件的详细资料。,3、连续培养生产 应提供经长期培养后所表达基因的分子完整性资料，以及宿主细胞的表型和基因型特征。,4、纯化 对于收获、分离和纯化的方法应详细记述，应特别注意污染病毒、核酸以及有害抗原性物质的去除。 对整个纯化工艺应进行全面研究，包括能够去除宿主细胞蛋白、核酸、糖、病毒或其它杂质以及在纯化过程中加入的有害的化学物质等。,(三)最终产品的
5、质量控制,应建立有关产品的鉴别、纯度、稳定性和活性等方面的试验方法。,(三)最终产品的质量控制,1.产品的鉴定电泳方法免疫学分析方法受体结合试验高效液相色谱法肽图分析法Edman N末端序列分析法圆二色谱法核磁共振法,(1) 氨基酸成分分析 氨基酸成分分析可为目的产物的纯度检定提供信息。 完整的氨基酸成份分析结果，应包括甲硫氨酸、半胱氨酸及色氨酸的准确值。氨基酸成份分析结果应为三次分别水解样品测定后的平均值。,(2)肽图分析,肽图分析（Peptide Mapping）：肽图分析是根据蛋白质、多肽的分子量大小以及氨基酸组成特点，使用专一性较强的蛋白水解酶作用于特殊的肽链位点将多肽裂解成小片断，通
6、过一定的分离检测手段形成特征性指纹图谱。,肽图分析可作为与天然产品或参考品作精密比较的手段。与氨基酸成分和序列分析结果合并，可作为蛋白质的精确鉴别。,(3)重组蛋白质的浓度测定和相对分子质量测定 蛋白质浓度测定方法主要有凯氏定氮法、双缩脲法、染料结合比色法、福林-酚法和紫外光谱法等。 蛋白质相对分子质量测定最常用的方法有凝胶过滤法和SDS-PAGE法。,(4) 蛋白质二硫键分析 测定方法有: 对氯汞苯甲酸法等 5，5-二硫基双-2-硝基苯甲酸法,2、 纯度分析,(1)目的蛋白质含量测定(2)产物杂质检测,(1)目的蛋白质含量测定 测定蛋白质含量的方法可根据目的蛋白质的理化性质和生物学特性来设计
7、。聚丙烯酰胺凝胶电泳高效液相色谱,(2)产物杂质检测 基因工程产物的杂质包括蛋白质和非蛋白质两类。 蛋白类杂质： 残留宿主细胞蛋白 采用免疫分析的方法,非蛋白质类杂质：,病毒污染检查无菌试验热原质试验残余细胞DNA测定。抗原性物质检查其他外源性物质,常用检测方法：杂质和污染物 检 测 方 法内毒素 鲎试剂、家兔热原法宿主细胞蛋白 免疫分析、SDS-PAGE、CE其它蛋白杂质 免疫分析、SDS-PAGE、 HPLC、CE残余DNA DNA杂交、紫外光谱、蛋白结合蛋白变异 肽谱、HPLC、 IEF、 CE,3.生物活性(效价)测定,生物活性测定是保证基因工程药物产品有效性的重要手段，往往需要进行动
8、物体内试验和通过细胞培养进行体外效价测定。,4.稳定性考察,药品的稳定性是评价药品有效性和安全性的重要指标之一，也是确定药品贮藏条件和使用期限的主要依据。,5、 产品一致性的保证,只有对从原料、生产到产品的每一步骤都进行严格的控制和质量检定，才能确保各批最终产品都是安全有效、含量和杂质限度一致并符合标准。,第三节 基因工程药物的检验,一、基因工程药物常用几种检验方法,(一)化学检定法1. Lowry法则定蛋白质含量2.用电泳法(非还原型SDS-PAGE法)测定纯度3.用高效液相色谱(HPLC)法测定纯度4.用电泳法(还原型SDS-PAGE法)测定相对分子质量5.用等电聚焦电泳法测等电点,(二)
9、肽图分析法,肽图分析（Peptide Mapping）：肽图分析是根据蛋白质、多肽的分子量大小以及氨基酸组成特点，使用专一性较强的蛋白水解酶（一般为肽链内切酶）作用于特殊的肽链位点将多肽裂解成小片断，通过一定的分离检测手段形成特征性指纹图谱。 肽图谱分析是基因工程多肽药物质量控制的重要手段。肽图谱对每一种蛋白质来说是特征的、专一的。通过肽图分析可以鉴别蛋白质，预测其一级结构特征。,(三)外源性DNA残留量的测定,检测残留DNA的方法可采用杂交分析技术、顺序单独分析技术或其他灵敏的分析技术。,(四)宿主细胞蛋白杂质的检测,宿主蛋白是基因工程药物特有的杂质，其含量是质量控制的一项重要指标。目前采用
10、点-免疫结合法测定。,(五)无菌试验 基因工程药物和其他生物制品不得含有杂菌，灭活疫苗不得含有活的本菌、本毒。在制造过程中应由制造部门按各制品制造及检定规程规定进行无菌试验，分装后的制品须经质量检定部门做最后检定。,(六)内毒素试验 基因工程药物内毒素的检定按照中国生物制品规程2000年版的规定进行。,(七)异常毒性试验异常毒性试验是指各制品的特异性毒性试验以外的一般安全试验。目的是通过动物试验检查制品中外源性毒性物质的污染情况以及是否存在意外的不安全因素，以保证人体使用安全。,(八)热原质试验 基因工程药物热原质的检定按照中国生物制品规程2000年版的规定进行。,(九)生物学活性(效价)检定 各种基因工程药物活性(效价)的检定按照中国生物制品规程2000年版的规定进行。,
