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1、农杆菌介导转化法 农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。,农杆菌感染柳树产生冠瘿瘤,原理： 根癌农杆菌和发根农杆菌细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。,因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。 农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，近年来，农杆菌介导转化在一些单子叶植物（尤其是
2、水稻）中也得到了广泛应用。,Story冠瘿瘤病：双子叶植物经常发生，因肿瘤着生地面在近地面的根茎交界处，形似帽状而得名。1907年， Smith & Townsent 农杆菌诱发冠瘿瘤病。1947年， Braun et al. 证实俩者的关系，但发现有的菌株不 致病。提出了假说：tumour-inducing principle,TIP.肿瘤 诱导因子 。60s , 肿瘤组织中含高浓度的氨基酸（octopine , nopaline） 总称冠瘿碱（opine) 。 Petit et al.证实肿瘤组织 合成的冠瘿碱取决于菌株，而且菌株能专一地利用 冠瘿碱作为菌株生存的唯一的碳源和氮源。(证实了
3、TIP),1974年，Zaenen et al, Schell, Van Larebeke et al. 从致瘤农杆菌中分离出一类巨大的质粒 (tumor inducing plasmid)，称为Ti质粒。 Ti=TIP1977年，Chilton et al.分子杂交技术证实肿瘤细胞中存 在外源的DNA ,与Ti质粒的DNA有同源性，是整 合到了植物染色体的农杆菌质粒DNA片段， T- DNA (transferred DNA),其内有致瘤和冠瘿 碱合成酶等基因。1981年，Ooms et al.发现Ti质粒上有致瘤区(virulence region)，Vir区。,Ti质粒是根癌农杆菌细胞核
4、外存在的一种环状双链DNA分子，长度约200kb，平均周长54.175 .4 um，分子质量为（90150）106 Da。在温度低与30的条件下，Ti质粒可稳定地存在于根癌农杆菌细胞内。,Ti质粒除上述上述诱导受侵染的植物组织产生冠瘿瘤外，还具有以下几种重要功能：1、赋予根癌农杆菌附着于植物细胞的能力；2、赋予根癌农杆菌分解代谢冠瘿碱的能力；3、根癌农杆菌的寄主植物范围；4、决定所诱导的冠瘿形态和冠瘿碱的成分；5、参与寄主细胞合成植物激素吲哚乙酸和一些细胞分裂素的代谢活。,1) Ti质粒的结构来自于不同野生型根癌农杆菌的Ti质粒可根据其产生的冠瘿碱类型分为三类：章鱼碱(octopine)类 胭
5、脂碱(nopaline)类 农杆碱（agropine） 类。Ti质粒携带着既能分解又能合成这些化合物的酶类和相应基因，然而冠瘿碱合成基因却不能在根癌农杆菌中表达，它们只有进入植物细胞后才能表达，Ti质粒上的冠瘿碱分解基因产物却能分解冠瘿碱，为宿主细胞提供能源、氮源和碳源。,长度：160-250 kb6大功能区：1)致瘤区，这个区主要合成植物 生长素和细胞分裂素；2)冠瘿碱合成区；3)冠瘿碱分解区；4)Ti质粒接合转移区(tra)；5)毒性区（Vir）；6)DNA复制区（Rep）。,在致瘤区、冠瘿碱合成区的两侧存在着一个24 bp直接重复序列，由这三部分所构成的DNA区域叫做T-DNA。致瘤区+
6、冠瘿碱+左右边界=T-DNA插入植物染色体中的Ti质粒片段只有T-DNA。T-DNA 区域中的这些基因只有在T-DNA插入到植物基因组后才能激活表达.,T-DNA,T-DNA ：Tms1、Tms2、Tmr这3个基因表达植物生长素和细胞分裂素,可调节植物细胞的生长和发育,它们的过量表达刺激植物细胞大量快速增长而形成冠瘿。冠瘿碱合成基因在宿主植物体内合并分泌出来,被Ti质粒上的冠瘿碱代谢基因分解成碳源和氮源，供根癌农杆菌生长所须。,脂碱型根癌农杆菌Ti质粒中T-DNA的左右两侧是一段24bp的重复序列,构成T-DNA的左边界和右边界。在某些章鱼碱型根癌农根癌农杆菌Ti质粒中T-DNA是以两个分开的
7、独立片段形式存在，即T-DNA左边区段和T-DNA右边区段。插入在T-DNA边界序列之间的任何DNA都可被转到植物染色体中。因此Ti质粒可用做外源目的基因的载体。,Vir区（Vir-region）：即毒性区。其长度约为35kb。控制根癌农杆菌附着于植物细胞和Ti质粒进入细胞有关部位，与感染后冠瘿形成有关。Vir区位于T-DNA区左侧，包含义个毒性遗传点（virA、vir、virC、 vir、vir和virG）。vir基因控制着的转移。,virvirvirC virG virvirA,植物细胞受伤后，细胞壁破裂，分泌物中含有高浓度的创伤诱导分子。它们是一些酚类化合物，如乙酰丁酮（acetosyr
8、ingone，AS）和-羟基酰丁香酮（-hydroxacetosyringone，OH-AS）。根癌农杆菌对这一类物质具有趋化性，在植物细胞表面附着后，受这些创伤诱导分子的刺激，Ti质粒vir区毒性基因被激活和表达。,目前已经发现9种信号因子，均为水溶性酚类化合物。其中乙酰丁香酮（acetosyringone，AS）和羟基乙酰丁香酮（OH-AS）的作用较强，儿茶酚、原儿茶酚、没食子酸、焦性没食子酸、二羟基苯甲酸、香草酚和对羟基苯酚处理农杆菌时也对Vir区的基因表达起促进作用。双子叶植物在在农杆菌侵染时可以形成大量的信号因子，而使T- DNA可以成功的转入；而单子叶植物需要加入外源酚类物质，才能
9、激活Vir区的基因，达到转基因的目的。,最先激活表达的是virA基因，它编码感受蛋白，位于细菌细胞膜的疏水区，可接受环境中的信号分子。在virA蛋白的激活下，virG基因表达，virG蛋白经磷酸化由非活性态变为活化状态，进而激活vir区其他基因表达。virA基因virG基因,virD基因产物：virD1蛋白是一种DNA松弛酶，它可使DNA从超螺旋型转变为松弛型状态；virD2蛋白则能切割已呈松弛态的T-DNA，2个边界产生缺口，使单链T-DNA得以释放。VirE基因所表达的virE2蛋白是单链T-DNA结合蛋白。可使T-DNA形成1个细长的核酸蛋白复合物（T-复合体），以此保护T-DNA不被包
10、内外的核酸酶降解。,小结:植物细胞受伤后，细胞壁破裂，分泌物中含有高浓度的创伤诱导分子。它们是一些酚类化合物，如乙酰丁酮（acetosyringone，AS）和-羟基酰丁香酮（-hydroxacetosyringone，OH-AS）。根癌农杆菌对这一类物质具有趋化性，在植物细胞表面附着后，受这些创伤诱导分子的刺激，Ti质粒vir区毒性基因被激活和表达。,最先激活表达的是virA基因，它编码感受蛋白，位于细菌细胞膜的疏水区，可接受环境中的信号分子。在virA蛋白的激活下，virG基因表达，virG蛋白经磷酸化由非活性态变为活化状态，进而激活vir区其他基因表达。其中virD基因产物virD1蛋白
11、是一种DNA松弛酶，它可使DNA从超螺旋型转变为松弛型状态；而virD2蛋白则能切割已呈松弛态的T-DNA，2个边界产生缺口，使单链T-DNA得以释放。VirE基因所表达的virE2蛋白是单链T-DNA结合蛋白。可使T-DNA形成1个细长的核酸蛋白复合物（T-复合体），以此保护T-DNA不被包内外的核酸酶降解。T-复合体依次穿过根癌农杆菌和植物细胞膜及细胞壁。并进入植物细胞核，最终整合进入植物核基因组。T-DNA的转移机理比较复杂，依赖于T-DNA区和vir区共同参与，涉及多个基因表达及一系列蛋白质和核酸的相互作用。,Table1 Summary of vir Gene Products,T-
12、DNA加工和转移Vir基因表达调控的问题，知道VirA和VirG基因诱导其它Vir基因的表达，当VirD操纵元的被诱导表达后，其中的VirD1和VirD2蛋白质具有核酸内切酶的活性(YanofskyMF.1986)，能够在T-DNA边界重复序列的特异位点切开T-DNA单链，因此T-DNA往往以单链形式进入植物细胞。但是在植物细胞中也发现双链T-DNA分子。,切刻位点(nicksite)可作为DNA从5向3合成的起始位点，新的DNA链合成后，T-DNA单链即被替换(displacement)释放出来(图2)。当然这种缺刻也可通过重组系统把T-DNA双链从Ti质粒上解离下来。,缺失研究也表明：右边
13、界重复序列缺失后，T-DNA不能转移，而左边界重复序列的缺失会稍稍降低T-DNA转移频率(TimmermanB1988)，这进一步说明T-DNA单链是在从右边界到左边界5向3替换合成中释放出来的。,右边界的缺失，使得DNA合成不能起始，因而T-DNA不能释放，所以T-DNA不能转移到植物细胞。而左边界的缺失，仅会影响DNA合成过程的终止，可能会降低导致T-DNA单链释放，而不会明显影响T-DNA单链的形成。,可见T-DNA左边界序列作为合成DNA的起始位点的效率比右边界序列低。这种不同不是由于左右边界的24bp重复序列核苷酸不同，而是由于靠近右边界位置有一个转移增强子(transferenha
14、ncer；overdriverPeraltaEG1986)存在。这个T-DNA转移增强序列能极其明显的增加农杆菌中T-DNA链形成，并且这种作用与它的位置、方向及距离均无关系。增强子的缺失能够使农杆菌对宿主植物的毒性降低。Toro等人发现VirC1蛋白能特异性的结合这个增强子，VirC操纵元的突变也能导致农杆菌的毒性减弱。,当T-DNA单链进入植物细胞后，植物细胞如何处理这些单链DNA？Paul等人利用电转移法把单链DNA转化到烟草原生质体中，结果表明，在植物细胞中，单链DNA迅速转变成双链DNA分子。此外单链DNA比双链DNA的转化效率更高。然而T-DNA分子并非以裸露的单链DNA形式进入植物细胞的。T-DNA单链的5端共价的结合着VirD2蛋白质，从而保护T-DNA分子免受外切核酸酶的降解，此外VirD2蛋白质上含有核定位的序列，所以结合在T-DNA5端的VirD2蛋白质象一个“导向仪”(pilot)指引并保护T-DNA进入植物细胞核中。VirE2蛋白质是一种单链结合蛋白质，能够包裹T-DNA单链，和其它T-DNA结合蛋白质共同构成了T-复合体。,冠瘿碱分解区,冠瘿也是在冠瘿碱胞内合并成分泌出来的,被冠瘿碱分解基因分解成根癌农杆菌生长所须的碳源和氮源。,
