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1、第二节 基因突变及菌种选育,一、基因、基因符号以及有关术语,1、基因 是合成多肽或RNA所必需的完整的核苷酸序列。2 、基因组、基因型是指生物单倍体细胞所有基因。 基因组侧重“全部碱基对序列的组成”；基因型是生物基因体现的功能、特性，侧重“某个基因”。,基因座位(gene locus)指各个基因在染色体上所占的位置。,3 、性状是构成一个生物个体的有关结构、形态、物质和功能等各方面特征的总称。4、基因符号常以说明某个基因功能特性的英文词的前3个字母表示（小写），一般用斜体，该基因的功能特性在右上角以/、r / s表示。 组氨酸基因用his（histidine的前3个字母）表示，his -表示组
2、氨酸缺陷型；gal+、gal-分别表示能发酵半乳糖和不能发酵半乳糖； strs、strr分别表示对链霉素敏感和具抗性。,二、基因突变,（一）基因突变的术语突变（mutation） DNA或RNA中核苷酸序列发生了稳定可遗传的变化，导致微生物性状发生改变。基因突变（点突变） DNA链上一对或少数几对碱基发生改变。染色体畸变 DNA的大片段变化（插入，缺失，重复，易位、倒位等）,野生型菌株与突变型菌株 野生型菌株，从自然界分离到的任何微生物在其发生突变前的原始菌株。 突变型菌株，野生型菌株经突变后，性状改变的菌株。正向突变与回复突变 正向突变 突变型菌株 回复突变 回复突变，野生型菌株经突变成为突
3、变型菌株以后，经再一次突变，有时突变型菌株又恢复为野生型菌株原有的性状，则这次的突变被称为回复突变。,野生型菌株（或野生型菌株的表型）,自发突变与诱发突变自发突变，自然条件下发生的突变。诱发突变，用各种人工因素处理细胞，突变率大大增加，这种突变称为诱变。诱变剂，如紫外线、亚硝酸等。突变率，在生长的微生物群体中，每一细胞的某一性状在每一世代中独立发生突变的机率。一般也可简单地用每单位群体在繁殖一代过程中所形成的突变细胞平均数来表示。,（二）基因突变的主要规律,1、自发性和非对应性2、稀有性：环境因素的影响，DNA复制过程的偶然错误等而导致，一般频率较低，通常为10-610-9 。3、诱发性：某些
4、物理、化学因素对生物体的DNA进行直接作用，突变以较高的频率产生。（诱变剂仅起着提高诱变率的作用）4、独立性：某个基因的突变是一独立事件，对其他基因的突变几率没有影响。5、稳定可遗传性6、可逆性,变量实验（fluctuation analysis）Salvador Luria & Max Delbrck（1943）,影印平板法常用于营养缺陷型的鉴别、分离。,若干细菌某一性状的自发突变率,菌 名 突变性状 突变率E. coli 抗T1噬菌体 3108E. coli 抗T3噬菌体 1107 E. coli 不发酵乳糖 11010E. coli 抗紫外线 1105Staphylococcus aur
5、eus 抗青霉素 1107S. aureus 抗链霉素 1109 Salmonella typhi 抗25g/L链霉素 1106 Bacillus megaterium 抗异烟肼 5105,1、形态突变（1）细胞形态鞭毛，芽孢，荚膜有无，L型细菌。（2）菌落形态大小，光滑和粗糙，颜色等，孢子颜色。一般为非遗传型的表型变异， 肺炎球菌失去荚膜：SR 变形杆菌：2%琼脂，长鞭毛，薄膜状菌落；6%琼脂或0.1%碳酸形成单个生长的菌落。,（三）突变的类型（根据突变体表型来分）,2、营养缺陷型（auxotroph） 由于基因突变，而丧失合成一种或几种生长因子的能力，必须在培养基中添加相应的营养成分才能正
6、常生长的突变型。（eg. AA,vitamin）野生型（wild type）：从自然界分离到的任何微生物在其发生营养缺陷型突变前的原始菌株。原养型(prototroph)：一般指营养缺陷型突变株经回变或重组后产生的菌株，其营养要求在表型上与野生型相同。,基本培养基（MM）能够满足野生型菌株生长最低限度需要的培养基。 补充培养基（SM）凡能满足相应的营养缺陷型生长需要的培养基。在MM中加蛋白胨（多种氨基酸)便可以用来培养各种氨基酸的缺陷型；加入酵母浸膏(其中含有多种B族维生素和核苷酸)便可以培养不同的维生素、嘌呤和嘧啶缺陷型。 完全培养基（CM）凡能满足一切营养缺陷型生长需要的培养基。,3、致死
7、突变（1）基因突变导致个体死亡（2）条件致死型 eg. 温度敏感突变型E.coli 37生长，42度下不生长，主要是突变引起了某些重要蛋白质结构和功能的改变。,4、抗性突变型（1）抗药性（耐药性），可作为选择性标记。（2）抗噬菌体。5、抗原突变型 抗原成分（eg. cell wall，鞭毛，荚膜等）的变异， eg. L型细菌，cell wall缺陷导致抗原性改变。6、产量突变型 通过基因突变而产生的在代谢产物产量上明显有别于原始菌株的突变株。如产量显著高于原始菌株者为正变株，反之为负变株。,生物化学统一性法则：,人和细菌在DNA的结构及特性方面是一致的，能使微生物发生突变的诱变剂必然也会作用于
8、人的DNA，使其发生突变，最后造成癌变或其他不良的后果。,化学药剂对细菌的诱变率与其对动物的致癌性成正比。超过95的致癌物质对微生物有诱变作用 ，90以上的非致癌物质对微生物没有诱变作用。,诱变剂的共性原则：,（四）突变株的应用Ames试验,美国加利福尼亚大学的Bruce Ames教授于1966年发明，因此称为Ames试验。,原理：检测鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhmurium）组氨酸营养缺陷型菌株（his -）的回复突变率。,证明Ames试验重要性的应用实例：,60-70年代，一种降低妇女妊娠反应的药物“反应停” 十分流行。 但随后发现畸形儿的出生率明显增高(海豹肢症)，而且
9、生产畸形儿的妇女大多曾服用“反应停”。 采用Ames试验发现这种物质的确具有很强的致突变作用，因此这种药物被禁止使用。 药品开发过程中，必须有“三致”实验的数据，才能够获得批准。 目前，在临床医生的严格指导下，我国众多皮肤科、免疫科和肿瘤科的患者正在接受着“沙利度胺”“反应停”的治疗。,二、基因突变的机制,（一）自发突变的分子机制1、低剂量诱变因素的长期综合效应 外源性诱变因素：各种辐射、环境中低浓度诱变剂、高温、宇宙射线等 内源性诱变因素：各种代谢物（如H2O2、咖啡碱、硫氰化合物）、转座因子2、碱基结构的变化 AT； GC。据统计，碱基对发生自发突变的几率约为10-810-9。T（酮式）变
10、为 T（烯醇式），则TG。,酮式烯醇式互变异构 胺式亚胺式互变异构,3、环出效应,DNA,10,2,3,4,5,6,7,8,9,1,10,2,3,4,5,6,7,8,9,1,10,2,8,9,1,10,2,3,4,5,6,7,8,9,1,序列3和序列7配对成环,碱基结构的变化,（二）诱发变异的机制,1、化学诱变剂引起的突变（1）碱基对直接置换（即一对碱基被另一对碱基所置换,分为转换和颠换。） 如：常用的亚硝酸、羟胺和各种烷化剂（硫酸二乙酯，甲基磺酸乙酯，N-甲基-N硝基-N-亚硝基胍，N-甲基-N-亚硝基脲，乙烯亚胺，环氧乙酸，氮芥等）。 亚硝酸的诱变机制,使碱基发生氧化脱氨，腺嘌呤A变成次黄
11、嘌呤H，胞嘧啶C变成尿嘧啶U。,能引起颠换的诱变剂很少，只是部分烷化剂才有。,腺嘌呤经氧化脱氨后变成烯醇式次黄嘌呤（He），He通过互变异构效应形成酮式次黄嘌呤（HK） 。DNA双链第一次复制，结果Hk在6位上含有酮基，故只能与6位上含有氨基的胞嘧啶C配对。DNA双链第二次复制，其中胞嘧啶（C）正常与鸟嘌呤（G）配对，使A-T G-C ，从而实现转换。当胞嘧啶被氧化成尿嘧啶（U）时，也可实现G-C A-T 。,AT GC,GC AT,碱基置换在编码蛋白的基因中的可能作用：DNA单一密码子的改变产生不同的蛋白。,（2）碱基类似物引起的间接置换（5-BU，5-AU， 8-NG）,5-BU是T的结构
12、类似物， 一般以酮式状态存在，可与A配对；有时以烯醇式状态存在，当DNA进行复制时，就只能与G配对。 G再正常的与C配对，完成A-T转换成G-C。,硝酸与5-BU的诱变机制异同,（2）移码突变（frame-shift mutation）,一种诱变剂引起DNA分子中一个或几个核苷酸的增加或缺失，从而造成突变点以后的全部遗传密码的转录和翻译都发生错误。 例，原黄素、吖啶黄等吖啶类染料均可引起移码突变，增加一个碱基的距离，3.4。,诱变因素在DNA上的初级效应 遗传效应碱基类似物 掺入作用 AT=GC双向转换 羟 胺 与胞嘧啶起反应GCAT的转换 亚硝酸 A、G、C的氧化脱氨作用AT=GC双向转换
13、交 联 缺失 烷化剂 烷化碱基（主要是G） AT=GC双向转换 烷化磷酸基团 ATTA的颠换 丧失烷化的嘌呤 GCCG的颠换糖-磷酸骨架的断裂巨大损伤（缺失、重复、倒位、易位）丫啶类 碱基之间的相互作用（双链变形） 码组移动（或）紫外线 形成嘧啶的水合物 GCAT转换 形成嘧啶的二聚体码组移动（或） 交 联 电离辐射 碱基的羟基化核降解 AT=GC双向转换 DNA降解 码组移动（或） 糖-磷酸骨架的断裂巨大损伤（缺失、重复、倒位、易位） 丧失嘌呤 加热 C脱氨基 CGTA转换 Mu噬菌体 结合到一个基因中间 码组移动,若干诱变剂的作用机制及诱变功能（往往不止单种功能）,（四）突变的修复,*以紫
14、外线照射形成的胸腺嘧啶二聚体的修复为例,1.光复活 经紫外线照射后的微生物立即暴露于可见光下时，可明显降低其死亡率的现象，称为光复活作用。 光复活酶，又称光裂解酶,2.暗修复 主要指切除修复。是细胞内的主要修复系统。,3、重组修复 这是在DNA复制时进行的一种越过损伤的修复。,一般认为，SOS修复系统是紫外线诱发突变的主要原因。,4、SOS修复 指DNA受到严重损伤、细胞处于危急状态时所诱导的一种DNA修复方式。 修复结果只是能维持基因组的完整性,提高细胞的生成率,但留下的错误较多,使细胞有较高的突变率。,三、菌种选育,（一）自发突变与育种 从生产中选育、定向培养优良菌种 （卡介苗(BCG)是
15、法国科学家Calmette和CGuerin经历了l3年时间，把牛型结核分支杆菌接在牛胆汁、甘油、马铃薯培养基上，连续转接了230代，才在1923年成功地获得。） 特点：自发突变频率很低，培育新种的过程十分缓慢,（二）诱变育种 1挑选优良的出发菌株， 2选择简便有效的诱变剂， 3处理单孢子（细胞）菌悬液， 4选用最适剂量， 5充分利用复合处理的协同效应， 6设计或采用高效筛选方案或方法,（三）杂交育种（细胞水平）（四）基因工程,第三节基因的转移和重组,基因重组（gene recombinant） 两个不同个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传分子间的重新组合，形成新遗传型个体的方法。 原核微生物的
16、基因重组 转化（transformation）游离DNA分子 + 感受态细胞 接合（conjugation）细胞与细胞的直接接触 转导（transduction）由噬菌体介导 原生质体融合 （protoplast fusion）,一、转化（transformation）,受体菌（recipient）接受供体菌（donor）裸露的DNA片段，从而获得供体菌部分遗传性状的现象。,范围： 转化现象最早发现于肺炎链球菌，目前了解，许多革兰氏阳性菌和阴性菌均能进行转化，如嗜血杆菌、芽胞杆菌等。大肠杆菌、葡萄球菌、假单胞菌及链霉菌等需经人工处理后才能进行转化。,1、转化的条件（1）供体DNA片段的大小，M
17、W为106-108，同源（一般30%以上即认为同源性较高）、未变性。（2）受体菌的生理状态 感受态 受体菌能吸收外源裸露DNA片段的暂时性生理状态 与菌的特异性、生理状态、菌龄及培养条件等有关； Ca2+、Mg2+；冷热激处理,2、转化过程-肺炎链球菌为例,（1）吸附双链DNA与感受态细胞表面受体结合（数分钟）。（2）吸收转化DNA双链经核酸酶作用，其中一条链降解，另一条链进入细胞。低浓度溶菌酶可提高细胞壁的通透性，从而提高转化率。（3）重组 供体菌单链DNA片段 受体菌染色体组的同源区段配对 受体菌原相应单链被切除 整合、取代、连链（DNA连接酶）杂合DNA区段复制重组子（4）DNA复制与细
18、胞分裂 供体菌部分遗传性状延续。,同源区段配对,复制与分离,3、转化的类型,（1）自然遗传转化 自然感受态的出现是细胞一定生长阶段的生理特性，受细菌自身的基因控制。是自然界基因交换的重要方式。（2）人工转化 人工感受态则是通过人为诱导的方法，使细胞具有摄取DNA的能力，或人为地将DNA导入细胞内。（3）原生质体转化,特殊的转化转染（transfection） 提取噬菌体或病毒的DNA/RNA来转化感受态的受体菌，并产生正常子代病毒或噬菌体。(区别于真核生物的转染),二、接合（conjugation）,通过供体菌与受体菌细胞之间的直接接触，遗传物质自供体菌转移入受体菌（原核微生物遗传物质转移方式
19、，较广泛）。,范围： 革兰氏阴性菌中几乎所有的肠道菌科的细菌，革兰氏阳性菌中的链球菌、枯草杆菌、葡萄球菌、厌氧菌以及链霉菌等。,“U”型管实验（ Bernard Davis，1950 ）证实接合过程需要细胞间的直接接触,U形管中间的滤板，允许培养基的营养物质通过，但细菌无法通过。,F因子（F质粒/致育因子）1、性状含F质粒菌株，有1-4根性菌毛；2、特点F因子可游离于细胞内，也可插入或整合到染色体上（附加体）；3、F因子的分子量通常为5107，上面有编码细菌产生性菌毛（sex pili）及控制接合过程进行的20多个基因。,4、F因子的四种细胞形式,根据细胞中是否存在F因子以及其存在方式的不同，
20、把E.coli分成四种菌株。F菌株：不含F因子，没有性菌毛，但可以通过接合作用接收F因子而变成雄性菌株（F+）；F菌株： F因子独立存在，细胞表面有性菌毛。Hfr（高频重组）菌株：F因子插入到染色体DNA上，细胞表面有性菌毛。F菌株：Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时，形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子，称为F因子。细胞表面同样有性菌毛。,F、 F、 Hfr、 F菌株之间的关系,（1） FF杂交,杂交的结果：供体细胞和受体细胞均成为F细胞，即： FF FF,F菌株的F因子向F-细胞转移，但含F因子的宿主细胞的染色体DNA一般不被转移。,5、接合机制,Hfr菌株的F因子插入到染
21、色体DNA上，因此只要发生接合转移过程，就可以把部分甚至全部细菌染色体传递给F-细胞并发生重组，由此而得名为高频重组菌株。 Hfr+F-Hfr+(F-),（2）Hfr F杂交,Hfr菌株仍然保持着F细胞的特征，具有性菌毛，并象F一样与F细胞进行接合。所不同的是，F因子的先导区（leading region）结合着染色体DNA向受体细胞转移，F因子除先导区以外，其余绝大部分是处于转移染色体的末端，由于转移过程常被中断，因此F因子不易转入受体细胞中，故HfrF杂交后的受体细胞（或接合子）大多数仍然是F。,* 中断杂交实验及染色体图的绘制,携带F因子的菌株称初生F菌株。FF与FF的不同：供体的部分染
22、色体基因随F一起转入受体细胞。, 与染色体发生重组；, 继续存在于F因子上，形成部分二倍体（次生F菌株）；,（3） FF杂交,三、转导（transduction）,通过完全或部分缺陷噬菌体为媒介，将供体菌的DNA片段携带到受体细胞，通过交换与整合，从而使受体菌获得供体菌的部分遗传性状。,细菌转导的类型,普遍性转导局限性转导,完全转导流产转导高频转导低频转导,普遍性转导 由转导噬菌体携带了供体菌基因组中的任何一部分染色体片段，当它感染受体菌时，使后者获得了这部分遗传性状的现象。,完全转导,完全缺陷噬菌体将DNA小片段从供体菌转移到受体菌，并发生基因重组。媒介烈性或温和噬菌体过程 烈性/温和性噬菌
23、体 宿主菌（供体菌） 增殖（在装配时，偶尔出现错误装配，即噬菌体的蛋白衣壳包装有大小与噬菌体DNA相近的宿主DNA片段） 转导噬菌体 供体菌裂解，释放出噬菌体（正常噬菌体+缺陷噬菌体（10-6,完全缺陷） 感染受体菌 转导噬菌体释放出供体菌DNA，与染色体基因重组,完全普遍转导的过程,误包,流产转导,（1）由phage带入的供体菌基因不交换，不整合，不复制，也不迅速消失；（2）只进行转录，转译和性状表达（eg.产酶等）。,局限转导,通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌并表达的转导现象。供体菌基因 （部分缺失噬菌体） 受体菌,局限性转导过程,温和噬菌体感染,整合到细菌染色体
24、的特定位点，宿主细胞发生溶源化,溶源菌因诱导而发生裂解时，在前噬菌体二侧的少数宿主基因因偶尔发生的不正常切割而连在噬菌体DNA上,部分缺陷的温和噬菌体,把供体菌的少数特定基因转移到受体菌中,举例： E.coli 的噬菌体，在其插入位点两侧为gal和bio基因，不正常切割时可包装入噬菌体外壳，形成缺陷噬菌体，再感染时形成局限性转导。,1、低频转导（low frequency transduction，LFT）,温和噬菌体裂解时的不正常切割：包含gal或bio基因（几率一般仅有10-6）缺陷噬菌体在宿主细胞内能够象正常的DNA分子一样进行复制、包装，提供所需要的裂解功能，形成转导颗粒。但没有正常噬
25、菌体的溶源性和增殖能力，感染受体细胞后，通过DNA整合进宿主染色体而形成稳定的转导子。,2、高频转导（high frequency transduction，HFT）,gal,106,gal,噬菌体感染E.coli,噬菌体误切割,LFT裂解物噬菌体（辅助噬菌体）感染E.coli,双重溶源菌,LFT裂解物,50%,50%,2、高频转导（high frequency transduction，HFT）,形成阳性转导子,形成噬菌斑,gal,gal,gal,HFT裂解物感染E.coli（gal-）,双重溶源菌,HFT裂解物,* 转化、转导、接合的比较,四、噬菌体转变（又称溶源转变）1. 定义： 由于温
26、和噬菌体的感染，前噬菌体整合入宿主菌的基因组，使宿主菌获得噬菌体基因编码的某些性状，这种转移方式称为噬菌体转变。2. 实例： 白喉杆菌 产生白喉外毒素。,-噬菌体,五 细胞融合,第四节 菌种的衰退、复壮和保藏,菌种退化（degeneration）是指群体中退化细胞在数量上占一定数值后，表现出菌种生产性能下降的现象。 在退化的菌种中仍有一些保持原有菌种特性的细胞，故有可能采取一些相应措施，使这些细胞生长、繁殖，以更新退化的菌株，称之为菌种复壮。,常见的衰退现象：菌落和细胞形态的改变； 生长速度缓慢，产孢子越来越少； 抵抗力、抗不良环境能力减弱等。代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力下降；,控制传代
27、的次数创造良好的培养条件利用不同类型的细胞进行接种传代对菌种采用有效的保藏方法,菌种衰退的防止,菌种的复壮,纯种的分离通过寄主体进行复壮淘汰已衰退的个体,低温保藏方法（3-6月）石蜡油低温保藏（1-2年）沙土管保藏法（1-10年）液氮保藏方法（20年以上）真空冷冻干燥法（5-15年以上）,菌 种 保 藏,菌种保藏主要是根据菌种的生理、生化特性，人工创造条件使菌体的代谢活动处于休眠状态。,几种常用菌种保藏方法的比较,多歧管冷冻干燥机,液氮罐,中国微生物菌种保藏管理委员会(CCCCM) 美国的典型菌种保藏中心(ATCC) 英国国家典型菌种保藏所（NCTC） 法国里昂巴斯德研究所（IPL）,国内外菌种保藏机构：,
