第5章微生物遗传育种课件.ppt

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1、第5章 微生物的遗传与育种,遗传学的几个概念,遗传：亲代将自身一整套遗传因子传递给下一代的行为和功能。变异：生物体的遗传物质结构和数量的改变。遗传型（genotype）：一个生物体所含有的基因的总和。表型（phenotype）：一个生物体所具有的一切外表特征和内在特性的总和。,微生物的独特生物学特性：,（1）个体的体制极其简单；（2）营养体一般都是单倍体；（3）易于在成分简单的组合培养基上大量生长繁殖；（4）繁殖速度快；（5）易于积累不同的中间代谢产物或终产物；（6）菌落形态特征的可见性和多样性；（7）环境条件对微生物群体中各个个体作用的直接性和均一性；（8）易于形成营养缺陷型；（9）存在多种

2、处于进化过程中的原始有性生殖方式；,第一节 遗传变异的物质基础,一、DNA是遗传变异的物质基础 DNA是遗传变异的物质基础的证明： 1944年以后，利用微生物为实验对象进行的三个著名实验： 肺炎球菌的转化试验、噬菌体感染试验、病毒的拆开与重建试验。,1928年，Griffith进行了以下几组实验：（1）动物实验对小鼠注射活R菌或死S菌 小鼠存活对小鼠注射活S菌小鼠死亡对小鼠注射活R菌和热死S菌 小鼠死亡 抽取心血分离活的S菌,三个经典实验：,（一）经典转化实验（transformation）：研究对象：肺炎双球菌S型菌株：有致病性，菌落表面光滑，有荚膜R型菌株：无致病性，菌落表面粗糙，无荚膜,

3、（2）细菌培养实验热死S菌不生长活R 菌长出R菌热死S菌+活R 菌长出大量R菌和10-6S菌,（3）S型菌的无细胞抽提液试验活R菌+S菌无细胞抽提液长出大量R菌和少量S菌。,以上实验说明：加热杀死的S型细菌细胞内可能存在一种转化物质，它能通过某种方式进入R型细胞并使R型细胞获得稳定的遗传性状。,（二）噬菌体感染实验,A. D. Hershey和M. Chase， 1952年,（1）含32P-DNA的一组：放射性85%在沉淀中（2）含35S-蛋白质的一组：放射性75%在上清液中所以，进入细胞的是噬菌体的核酸而不是蛋白质。,（三）植物病毒的重建实验,为了证明核酸是遗传物质，H. Fraenkel-

4、Conrat（1956）用含RNA的烟草花叶病毒（TMV）进行了著名的植物病毒重建实验。将TMV在一定浓度的苯酚溶液中振荡，就能将其蛋白质外壳与RNA核心相分离。分离后的RNA在没有蛋白质包裹的情况下，也能感染烟草并使其患典型症状，而且在病斑中还能分离出正常病毒粒子。,二、DNA的结构与复制,DNA的一级结构：指碱基序列 DNA的二级结构：主要是BDNA：双螺旋结构 DNA的三级结构：双螺旋的DNA分子可以进一步盘曲形成更加复杂的结构。DNA的复制：半保留复制ATTTCGTAAAGC,RNA等作为遗传物质的基础：,以RNA作为遗传信息的携带者主要是一些RNA病毒：正链RNA病毒、负链RNA病毒

5、、反转录RNA病毒、双链RNA病毒：类病毒、卫星RNA朊病毒:蛋白质,第二节 微生物的基因组结构,基因：一段具有特定功能和结构的连续DNA片段。基因组：细胞中基因以及非基因的DNA序列的总称，包括结构基因、调控序列以及目前功能未知的DNA序列。,一、原核生物（大肠杆菌）的基因组,紧密缠绕的环状双链DNA分子；遗传信息的连续性；功能相关的结构基因组成操纵子结构；结构基因的单拷贝及rRNA基因的多拷贝；基因组的重复序列少而短。,二、真核生物（啤酒酵母）的基因组,DNA与组蛋白构成染色体有间隔子或内含子序列没有明显的操纵子结构含有一定数量的重复序列（低度、中度和高度重复） 遗传丰余：较高同源性的DN

6、A重复序列,中心法则：,第三节 质粒,一、原核生物的质粒 质粒定义：是一类小型共价闭合环状核外DNA，能独立于细胞核进行自主复制。可以通过交换掺入细胞核成为附加体；可以从寄主细胞中消除。 近年来也发现了线性双链DNA质粒和RNA质粒,二、几种代表性质粒：,1.F-因子（fertility factor） 致育因子/性因子，62106Dalton，94.5kb，相当于核染色体DNA2%的环状双链DNA，足以编码94个中等大小多肽，其中1/3基因（tra区）与接合作用有关。 存在于肠细菌属、假单胞菌属、嗜血杆菌、奈瑟氏球菌、链球菌等细菌中，决定性别。,2.巨大质粒（mega质粒）,为近年来在Rhi

7、zobium（根瘤菌属）中发现的一种质粒，分子量为200300106Dalton，比一般质粒大几十倍到几百倍，故称巨大质粒，其上有一系列固氮基因。,3.Ti（毒性）质粒（tumoe inducing plasmid）长200kb，是一种大型质粒。存在于根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens）中。赋予宿主引起许多双子叶植物的根癌的特性。当带有Ti质粒的细菌侵入植物细胞中后，在其细胞中溶解，把细菌的DNA释放至植物细胞中。含有复制子的Ti质粒的小片段与植物细胞中的核染色体发生整合，破坏控制细胞分裂的激素调节系统，从而使它转变成癌细胞。,根癌,4.Col因子（colicin

8、ogenic factor）: 产大肠杆菌素因子:大肠杆菌素是一种由E.coli的某些菌株所分泌的细菌蛋白，具有通过抑制复制、转录、转译或能量代谢等而专一地杀死不含Col因子的近缘的其它肠道细菌。凡带Col因子的菌株，由于质粒本身编码一种免疫蛋白，从而对大肠杆菌素有免疫作用，不受其伤害。,5.R（抗生素抗性和重金属抗性）因子（resistence factor）R因子由相连的两个DNA片段组成，即抗性转移因子（resistence transfor factor， RTF ）和抗性决定因子（r-determinant），RTF控制质粒copy数及复制，抗性决定因子带有抗生素或重金属的抗性基因。

9、,6.降解性（代谢）质粒 如假单胞菌属中发现。它们的降解性质粒可为一系列能降解复杂物质的酶编码，从而能利用一般细菌所难以分解的物质做碳源。 这些质粒以其所分解的底物命名，例如有分解CAM（樟脑）质粒，XYL（二甲苯）质粒，SAL（水杨酸）质粒，MDL（扁桃酸）质粒，NAP（奈）质粒和TOL（甲苯）质粒等。,二、转座因子 转座因子：可在DNA链上改变自身位置的一段DNA序列。也称作跳跃基因（jumping gene）或可移动基因（movable gene）。有些DNA片段不但可在染色体上移动，而且还可从一个染色体跳到另一个染色体，甚至还可从一个细胞转移到另一个细胞。在这些DNA顺序的跳跃过程中，

10、往往导致DNA链的断裂或重接，从而产生重组交换或使某些基因启动或关闭，结果导致突变的发生。,第四节 基因突变及修复,一、基因突变（gene mutation）： 是变异的一种，指生物体内遗传物质的分子结构或数量突然发生的可遗传的变化。 突变率常在10-810-9范围内。,(一)基因突变的类型（根据遗传信息的变化）,原序列 5-AUG CCU UCA AGA UGU GGG Met Pro Ser Arg Cys Gly(1)同义突变 5- AUG CCU UCA AGA UGU GGA Met Pro Ser Arg Cys Gly(2)错义突变 5- AUG CCU UCA GGA UGU

11、GGA Met Pro Ser Gly Cys Gly(3)无义突变 5- AUG CCU UCA AGA UGA GGA Met Pro Ser Arg(4)移码突变 5-AUG CCU UCA AGU GUG GG Met Pro Ser Ser Val,常见突变类型突变株的表型成因检出方法营养缺陷型 丧失合成一补充培养基（auxotroph） 种或几种生长因子的 能力不能在基本培养 基上生长抗性突变型 产生了对某药物培养基（resistant mutant） 种化学药物或致死 物理因子的抗性条件致死突变型 在某种条件下 培养条件改变（conditional 可正常生长、繁殖并lethal

12、 mutant） 实现其表型，而在另 一条件下却无法生长 繁殖的突变型,突变株的表型成因 检出方法形态突变型 因突变而产生的个体 形态Morphologycal 或菌落形态的非选择（常用颜色变化） mutant 性变异抗原突变型 因突变而引起的抗原 借助于抗原antigenic 结构发生改变 抗体反应 mutant产量突变型 因突变而获得的在有 测定产量或 high producing 用代谢物产量上高于 其它mutant 原始菌株的突变株,（二）突变率突变率: 每一细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率。突变率为10-8是指该细胞在一亿次细胞分裂中，会发生一次突变。突变率也可以用每一单位群体

13、在每一世代中产生突变株（mutant，即突变型）的数目来表示。如一个含108个细胞的群体，当其分裂为2108个细胞时，即可产生一个突变表型。突变率=突变细胞数/分裂前群体细胞数,一些菌种某些性状的自发突变率,.诱变机制,诱变剂（mutagen）：凡能提高突变率的任何理化因子，诱变剂的种类很多，作用方式多样。即使是同一种诱变剂，也常有不同的作用方式。,直接引起置换的诱变剂,一类可直接与核酸的碱基发生化学反应的诱变剂，例如亚硝酸、羟胺和各种烷化剂（硫酸二乙酯，甲基磺酸乙酯，N-甲基-N硝基-N-亚硝基胍，N-甲基-N-亚硝基脲，乙烯亚胺，环氧乙酸，氮芥等）。,间接引起置换的诱变剂,引起这类变异的诱

14、变剂都是一些碱基类似物，如5-溴尿嘧啶（5-BU）、5-氨基尿嘧啶（5-AU）、8-氮鸟嘌呤（8-NG）、2-氨基嘌呤（2-AP）和6-氯嘌呤（6-CP）等。它们的作用是通过细胞的代谢活动掺入到DNA分子中后而引起碱基置换，故是间接的。,三、 基因重组,基因重组（gene recombination）：凡把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传分子间的重新组合，形成新遗传型个体的方式。重组可使生物体在未发生突变的情况下，也能产生新遗传型的个体。真核微生物中的有性杂交、准性杂交（parasexual hybridization）等原核生物中的转化、转导、接合和原生质体融合等都是基因重组

15、在细胞水平上的反映。,四、 微生物育种,从生产中选育： 在生产过程中，微生物以一定频率发生自发突变。为选育优良的生产菌种创造了机会。定向培育优良品种： 一般指用某一特定因素长期处理某微生物的群体（culture population），同时不断地对它们进行移种传代，以达到积累并选择相应的自发突变株的目的。,诱变育种,诱变育种：利用物理或化学诱变剂处理均匀而分散的微生物细胞群，促进其突变率显著提高，然后采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选少数符合育种目的的突变株，以供生产实践或科学研究之用。诱变育种具有极其重要的实践意义。当前发酵工业和其他微生物生产部门所使用的高产菌株，几乎毫无例外地都是通

16、过诱变育种而明显提高其生产性能的。,选择简便有效的诱变剂： 物理诱变剂：紫外线、激光；X射线、射线和快中子等。 化学诱变剂：主要有烷化剂、碱基类似物和丫啶类化合物。 拟辐射物质：有些烷化剂例如氮芥、硫芥和环氧乙烷等除了能诱发各种点突变外，还能诱发一般只有辐射才能诱发的染色体畸变，所以它们也被称为拟辐射物质。 由于一切生物的遗传物质基础都是核酸尤其是DNA，所以任何能改变核酸结构的因素都可引起核酸生物学功能的改变。同样，凡能引起核酸的其他功能改变的因素，一般也能引起突变。,五 菌种的衰退、复壮和保藏,衰退（degeneration）：在微生物的生长过程中，由于变异的存在，使原有的优良性状发生负变

17、，即菌种的衰退。 复壮(rejuvenation)：狭义的复壮是指在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和生产性能测定等方法，从衰退的群体中找出未衰退的个体，以达到恢复该菌原有典型性状的措施；广义的复壮是指在菌种的生产性能未衰退前就有意识的经常、进行纯种的分离和生产性能测定工作，以期菌种的生产性能逐步提高。实际上是利用自发突变（正变）不断地从生产中选种。,防止菌种衰退的方法,（1）控制传代的次数（一般在DNA的复制过程中，碱基的错配率是5x10-4，自发突变的频率为10-810-9，采用良好的菌种保藏方法，可以减少移种和传代的次数）（2）创造良好的培养条件（3）利用不同类型的细胞进行接种传代：

18、对丝状微生物而言，通常采用稳定的单核孢子进行接种。（4）采用有效的菌种保藏方法,菌种的复壮措施,（1）纯种分离 菌落纯的分离方法（平板表面涂布法，平板划线分离法，琼脂培养基浇注法） 细胞纯的分离方法（分离小室进行单细胞分离，显微操纵器进行单细胞分离，菌丝尖端切割法进行单细胞分离）（2）通过宿主体内生长进行复壮（如Bacillus thuringiensis的复壮）（3）淘汰已衰退的个体（采用比较激烈的理化条件进行处理，以杀死生命力较差的已衰退个体）,、菌种的保藏,菌种保藏机构的任务：广泛收集实验室和生产菌种、菌株（包括病毒株以及动、植物细胞株和质粒等）的基础上，使之达到不死、不衰、不乱以及便于

19、研究、交换和使用的目的。常用的菌种保藏机构： 中国微生物菌种保藏委员会(CCCCM) 美国的典型菌种保藏中心(ATCC),菌种保藏的原理,挑选典型菌种的优良纯种 一般采用微生物的休眠体（如孢子、芽孢等）创造适于微生物长时期休眠的环境条件（如干燥、低温、缺氧、避光、缺乏营养以及添加保护剂或酸碱中和剂等）,菌种保藏方法:,定期移植法液体石蜡法沙土管法真空冷冻干燥法-80冰箱冻结法液氮超低温冻结法,（一 ）定期移植法(传代培养保藏法),是指将菌种接种于适宜的培养基中，最适条件下培养，待生长充分后，于46进行保存并间隔一定时间进行移植培养的菌种保藏方法。(包括斜面培养、穿刺培养、液体培养等)。根据要求

20、每36个月移植一次。某些菌种，如芽裂酵母，阿舒假囊酵母，棉病囊霉等，须13个月移植一次。(保藏湿度用相对湿度表示，通常为50%70%。斜面菌种应保藏相继三代培养物以便对照，防止因意外和污染造成损失。),（二）液体石蜡保藏法(矿物油保藏法),是指将菌种接种在适宜的斜面培养基上，最适条件下培养至菌种长出健壮菌落后注入灭菌的液体石蜡，使其覆盖整个斜面，再直立放置于低温（46）干燥处进行保存(120年)。 恢复培养时，挑取少量菌体转接在适宜的新鲜培养基上，生长繁殖后，再重新转接一次。,（三） 沙土管保藏法,是载体保藏法的一种。将培养好的微生物细胞或孢子用无菌水制成悬浮液,注入灭菌的沙土管中混合均匀，或

21、直接将成熟孢子刮下接种于灭菌的沙土管中，使微生物细胞或孢子吸附在沙土载体上，将管中水分抽干后熔封管口或置干燥器中于46或室温进行保存。 恢复： 取部分沙土粒于适宜的斜面培养基上,（四）、冷冻干燥,将微生物冷冻，在减压下利用升华作用除去水分，使细胞的生理活动趋于停止，从而长期维持存活状态。五、-80低温冷冻保藏将菌种保藏在-80冰箱中以减缓细胞的生理活动进行冷冻的一种保藏方法。,（五）、液氮超低温保藏,液氮超低温保藏技术是将菌种保藏在-196的液态氮，或在-150的氮气中的长期保藏方法，它的原理是利用微生物在-130以下新陈代谢趋于停止而有效地保藏微生物。,几种常用菌种保藏方法的比较,第五节 微

22、生物基因工程,基因工程：用人为的方法将所需要的某一供体生物的遗传物质-DNA大分子提取出来，在离体的条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中使供体DNA进行正常的复制和表达，才，从而获得新物种的一种崭新的育种技术。,一、基因工程的基本操作,基因工程操作一般分为以下四个步骤：目的基因的取得、载体的选择、目的基因与载体DNA的体外重组、重组载体引入受体细胞。,获得目的基因的主要方法,从供体细胞的DNA中分离（酶切法、PCR扩增）通过反转录酶的作用由mRNA合成cDNA（拷贝数少的目的基因的获得）由化学方法合成特定功能的基因

23、（磷酸二酯法、磷酸三酯法、固相亚磷酸三酯法，合成的长度150200bp，作用：合成基因的元件、合成引物、合成探针、用于基因的定点诱变、作为重组DNA连接的构件）,载体的选择,载体必须具备的几个条件： 必须是一个复制子 在受体细胞中有较高的复制率 最好只有一个内切酶切口 必须具有选择性遗传标记目前常用载体： 质粒载体 噬菌体载体,目的基因与载体DNA的体外连接,核酸内切酶与DNA分子的体外切割： 在基因工程中，必须使用特定的内切酶（一般为型内切酶）消化目的基因与载体DNA，使它们产生互补的粘性末端或平末端，如EcoR消化DNA 产生的粘性末端为： G3 5AATTC CTTAA5 3G 目的基因

24、与载体DNA用同一种内切酶消化，即产生相同的粘性末端，在低温（5-6）下进行退火时，互补的粘性末端配对重新形成带缺口的双链。 DNA连接酶进行目的基因与载体DNA的体外连接 粘性末端连接（来源于E.coli的DNA连接酶）；平末端连接（ T4 DNA连接酶）,重组载体引入受体细胞,受体细胞的种类： 微生物细胞（E.coli B.subtilis S.cerevisiae） 植物细胞 动物细胞重组载体引入受体细胞的方法： 转化 转染 具体的方法参见有关实验指导,复习与思考,1.什么是微生物的遗传和变异？它们的物质基础是什 么？如何证明？ 2.DNA是如何复制的？ 3.微生物有几种RNA？它们各有什么作用？ 4.微生物变异的实质是什么？微生物基因突变的类型有哪几种？ 5.什么叫杂交、转化和转导？各有什么实践意义？ 6.自然界微生物菌种的筛选程序是什么？ 7.诱变育种的关键步骤有哪些？ 8.什么是营养缺陷型菌株？它的研究意义是什么？9.什么叫“工程菌”？如何获得？ 10.微生物菌种的保藏方法有哪些？举例说明。,Thank you!,