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1、课题1 微生物的实验室培养第一课时,专题2 :微生物的培养与应用,到目前为止， 几十项Nobel生理学和医学奖，化学奖 都与微生物学有关,微生物包括哪五类：,病毒细菌放线菌真菌原生动物,原核生物界,原生生物界,真菌界,病毒界,微生物基础知识,微生物的类群,原生生物：,原核生物:,真菌:,病毒:,如酵母菌,单细胞的动植物,如草履虫、单细胞藻类等,微生物包含了除植物界和动物界以外的所有生物,无细胞结构,细菌、蓝藻、放线菌,原核细胞,特点：结构都相当简单,个体多数十分微小.通常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结构.且体内一般不含有叶绿素.不能进行光合作用.,细菌的外形与大小,细菌
2、：单细胞不分枝的原核微生物。细菌细胞微小而透明，通常用适当染料染色后显微镜观察,图1-1 常见的三种细菌典型形态A.球菌 B.杆菌 C.弧菌,细菌细胞由外向里依次有鞭毛、菌（纤）毛、荚膜、细胞壁、细胞膜、细胞质，细胞质中又有液泡、储存性颗粒、核质等。,细菌的构造,图1-3 细菌的结构,*细胞壁,结构特点：坚韧且有弹性细胞壁有哪些功能？ 固定细胞外形；,保护细胞免受外力的损伤；,阻拦大分子物质进人细胞；,使细胞具有致病性及对噬菌体的敏感性。,伤寒杆菌细胞壁中含毒素,芽孢,有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。
3、例如，有的细菌的芽孢，煮沸3小时以后才死亡。芽孢又小又轻，可以随风飘散。当环境适宜（如温度、水分适宜）的时候，芽孢又可以萌发，形成一个细菌.,菌落：,单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落。菌落是鉴定菌种的重要依据。,菌落,细菌的菌落特征因种而异,放线菌,1、结构：单细胞原核分支状的菌丝（基内菌丝、气生菌丝）,链霉素、土霉素、四环素、氯霉素、红霉素、庆大霉素,微生物中发现了几千种抗生素，其中2/3是由放线菌产生的,应用:,病毒的结构,病毒,SARS病毒、 禽流感病毒,朊病毒（蛋白质病毒）,2、病毒的增殖：,真菌,如图是酵母菌电子显
4、微镜下的形态结构,酵母菌和霉菌,青霉,生殖,直立菌丝 营养菌丝,腐生生活,孢子生殖,细菌的营养类型,根据细菌所利用的能源和碳源的不同，将细菌分为两大营养类型。自养菌（autotroph）异养菌（heterotroph）腐生菌寄生菌 大部分病原菌,微生物包括哪五类：,病毒细菌放线菌真菌原生动物,特点：结构都相当简单,个体多数十分微小。通常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结构，且体内一般不含有叶绿素，不能进行光合作用。,原核生物界,原生生物界,真菌界,病毒界,1、了解培养基的基础知识，掌握培养基的配制、分装方法。2、掌握常用的消毒和灭菌的方法，进行无菌技术的操作,一、教学目标,
5、无菌技术的操作。,二、课题重点和难点：,一、基础知识：,（一）培养基,培养基（培养液）是由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养液。,不管哪种培养基，一般都含有水、碳源、和氮源、 无机盐等营养物质，另外还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质,例如:生长因子(即细菌生长必需，而自身不能合成的化合物,如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)以及氧气、二氧化碳、渗透压等的要求。,（一）.培养基：,微生物生存的环境和营养物质,1.基本成分：,思考：微生物“吃”什么？,水、无机盐、碳源、氮源,碳源,无机碳源：,有机碳源：,CO2、CO32-、HCO3-,牛肉膏、蛋白胨等,自养微生物,异养微生物
6、,氮源,NH4、NO3-,牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等,注：含CHON的有机物为异养型微生物提供碳源、氮源、能源,（一）.培养基：,1.基本成分：,水、无机盐、碳源、氮源,2.特殊营养：,维生素、碱基等,（牛肉膏、酵母膏、蛋白胨中含有）,3.pH、氧气的需求：,4.种类：,固体培养基,液体培养基,有无 凝固剂琼脂,分离 鉴定,工业 生产,化学成分：,物理性质：,天然培养基 合成培养基,选择培养基,加入青霉素的培养基: 分离酵母菌、霉菌等真菌加入高浓度食盐的培养基: 分离金黄色葡萄球菌不加氮源的无氮培养基: 分离固氮菌不加含碳有机物的无碳培养基: 分离自养型微生物加入青霉素等抗生素的培养基:
7、分离导入了目的基因的受体细胞加入氨基喋呤、次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷的培养基: 分离杂交瘤细胞,这些营养成分是构成细胞结构的元素和化合物的基本元素，碳源：如CO2、糖类、脂肪酸等有机物，构成微生物的结构物质和分泌物，并提供能量。氮源：如N2、氨盐、硝酸盐、牛肉膏、蛋白胨等，主要用来合成蛋白质、核酸及含氮代谢物等。,1、从细胞的化学元素组成来看，培养基中为什么都含有这些营养成分？,课堂探究,牛肉膏蛋白胨培养基 是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。,分析营养构成？,（二）无菌技术,无菌技术的概念,无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。,获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵
8、，无菌技术就是防止杂菌污染的操作技术。,消毒,1、无菌技术的种类,灭菌,使用较为温和的物理和化学方法（酒精、紫外线）来杀死部分对人体有害的微生物（不包括芽孢和孢子。,使用较为强烈的理化因素杀死物体内外的所有微生物（包括芽孢和孢子）。以化学剂或物理方法消灭所有微生物，包括所有细菌的繁殖体、芽孢、霉菌及病毒，而达到完全无菌之过程。,对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁消毒； 将培养器皿、接种用具和培养基等进行灭菌； 接种的过程要在酒精灯火焰附近进行。 避免已经灭菌处理的材料用具与周围物品接触,1、煮沸消毒法:100煮沸5-6min2、巴氏消毒法：70-75 下煮30min或 80 下煮15m
9、in9(牛奶）3、化学药剂消毒法:用75%酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒;氯气消毒水源（酒精擦拭双手4、紫外线消毒：（工作台、接种室）(能使蛋白质变性，还能损伤DNA的结构）,(1)消毒的方法,3.常用的消毒与灭菌的方法,（1）、灼烧灭菌：接种用具和接种过程中的试管口或瓶口放在酒精灯火焰的充分燃烧层中进行灼烧灭菌。试管口或瓶口等容易被污染的部位,3、常用的消毒与灭菌的方法,（2）、干热灭菌：将玻璃器皿、金属用具等能耐高温并需要保持干燥的物品放到干热灭菌箱内，在160170OC中加热12h即可。,（3）、高压蒸汽灭菌：将需灭菌的物品放到盛有水的高压蒸汽灭菌锅内煮沸，待冷空气排尽后，密闭继续加热至锅
10、内压力到100kPa，温度到121OC后，维持1530min即可。,1、灼烧灭菌2、干热灭菌：160-170 下加热1-2h。3、高压蒸气灭菌：100kPa、121 下维持15-30min.,(2)灭菌的方法：,1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？,2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。（1） 培养细菌用的培养基与培养皿（2） 玻棒、试管、烧瓶和吸管（3） 实验操作者的双手,无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。,（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。,P15-16旁栏思考,4.无菌技术除了用来防止实验室的培养
11、物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？,无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。,课堂探究,拓展延伸,单个或少数菌体,2.特征：,大小、形状、光泽度、颜色、透明度等。,3.功能：,1.定义：,三.菌落,鉴定菌种的重要依据,固体培养基培养基上,大量繁殖,子细胞群体,微生物实验室培养的基本操作程序,1、器具的灭菌2、培养基的配制3、培养基的灭菌4、倒平板5、微生物接种6、恒温箱中培养7、菌种的保存,三、实验操作,1.制备牛肉膏蛋白胨培养基（用于培养细菌）,培养基的配制原则,目的要明确：根据培养的微生物种类、培养的目的等确定培养基的类型和配制量。营养要协调：培养基中各种营养物质的浓度和比例要适
12、宜。pH要适宜：细菌培养基pH中性或偏碱性，霉菌培养基呈酸性。,（一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基,1.计算：（根据微生物生长时对营养物质的需求）,2.称量 准确称取各种成分，注意事项：牛肉膏要放在称量纸上称量，牛肉膏、蛋白胨都易吸潮，称取时动作要迅速，称后及时盖上瓶盖。,三、实验操作,思考：该培养基从物理性质分属于哪种？原因？含有几种营养成分？牛肉膏提供上述哪几种成分？,3.溶化：先将牛肉膏连同称量纸一起放入烧杯，加少量水，加热至牛肉膏溶化并与称量纸分离后，用玻璃棒取出称量纸。加入蛋白胨和氯化钠，用玻璃棒搅拌使之溶解，再加入琼脂，不断用玻璃棒搅拌，原因：防止琼脂糊底而导致烧杯破裂。待溶解后，加
13、自来水定溶至100mL。（熔化后灭菌前应该调节PH),4.灭菌：将配制好的培养基放到锥形瓶中（瓶口加棉塞，包上牛皮纸），连同培养皿（35套，用几层报纸包好）一起放到高压蒸汽灭菌锅内灭菌。,5.倒平板：待培养基冷却到50OC左右时倒平板。,?,思考3,溶化时为什么要将牛肉膏连同称量纸一起加热? 加琼脂的目的是什么?,可保证粘附在称量纸上的牛肉膏也能溶于水中,减少误差,作为凝固剂,思考4,在灭菌前, 用牛皮纸、旧报纸包紧盛有培养基的锥形瓶的目的是什么？ 培养皿能否用高压蒸汽灭菌？,?,在灭菌时能避免水蒸汽凝结时浸湿棉塞；在取出培养基锥形瓶时也能起到隔绝空气中杂菌污染的作用,不能,因为培养皿要保持干
14、燥,应该用干热灭菌,倒平板技术,倒平板操作的讨论,1.培养基灭菌后要冷却到50OC时倒平板。用什么办法来估计培养基的温度？ 用手触摸锥形瓶，温度下降到刚刚不烫手时即可开始倒平板。,2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？ 通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。,3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？ 平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。,4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？ 空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间
15、的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。,1计算、称量2溶化3调pH：pH764过滤：这一步可以省去。5分装：分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。6加塞7包扎,操作步骤,8灭菌: 将50ml培养基用玻棒转移至三角锥瓶中，塞上棉花塞，包上牛皮纸，再放入高压蒸气灭菌锅，在压力为100kPa、温度为121，灭菌1530min。将培养皿用旧报纸包裹，放入干热灭菌箱内，在160170 下灭菌2h。 9倒平板: 待培养基冷却到50 左右时，在酒精灯附近倒平板。（倒平板操作见课本）2d后观察平板，无杂菌污染才可用来接种
16、. 10无菌检查： 将灭菌的培养基放入37的温室中培养2448小时，以检查灭菌是否彻底。,练习：右表是某微生物培养基成分，据此回答：（1）右表培养基可培养的微生物类型是 。（2）若不慎将过量NaCl加入培养基中。如不想浪费此培养基，可再加入 ，用于培养金黄色葡萄球菌。,自养型微生物,含碳有机物,（3）若除去成分，加入（CH2O），该培养基可用于培养 。（4）表中营养成分共有 类。（5）不论何种培养基，在各种成分都溶化后分装前，要进行的是 。（6）右表中各成分重量确定的原则是 。（7）若右表培养基用于菌种鉴定，应该增加的成分是 。,自生固氮微生物,3,调整pH,依微生物的生长需要确定,琼脂（或凝固剂）,
