从毛地黄中分离提取强心苷类药物课件.ppt

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1、从毛地黄中分离提取 强心苷类药物,生物化工系 张洪鹏,一 、强心苷简介,(一)分布与应用强心苷(cardiac glycosides)是指生物界中一类对心脏有显著生理活性的甾体苷类。强心苷能加强心肌收缩性，减慢窦性频率。主要用于治疗慢性心功能不全，心房纤颤、心房扑动、阵发性心动过速等心脏疾病。 强心苷还有兴奋延髓催吐化学感受区和影响中枢神经系统作用，可引起恶心、呕吐等胃肠反应，并能使动物产生眩晕、头痛等症。,强心苷在植物界分布比较广泛，主要存在于夹竹桃科、玄参科、百合科、萝摩科、十字花科、毛茛科、卫矛科、大蕺科、桑科等十几个科的一百多种植物中。 强心苷在植物体中主要存于花、叶、种子、鳞茎、树皮

2、和木质部等组织器官中。,(二)强心苷结构与分类,强心苷的基本结构是由甾醇母核和连在 C 17 位上的不饱和共轭内酯环构成苷元部分，然后通过甾醇母核 C 3 位上的羟基和糖缩而合成。,一般根据在生物体内是原生还是次生，可分为原生苷和次生苷。次生苷是含有两个以上糖的原生苷，经水解失去一部分糖而得到的苷称为次生苷或次级苷。,1甾核的立体结构构型及表示方法,甾体母核A、B、C、D四个环的稠合方式为A/B环有顺、反两种形式，但多为顺式；B/C环均为反式；C/D环多为顺式,构向式为：,A.B反式,A.B顺式,2.结构类型,(1)苷元部分根据C17位侧链的不饱和内酯环不同分为：甲型：C17位侧链为五元环的-

3、内酯乙型：C17位侧链为六元环的- -内酯这两类大都是-构型，个别为-构型，-型无强心作用。,甲型强心苷元：,C17位上连五元不饱和内酯环，即-内酯-强心甾烯型。以强心甾（cardenolide）为母核命名。,乙型强心苷元,C17位上连六元不饱和内酯环，即，-双烯-内酯，称为海葱甾二烯或蟾蜍甾二烯。以海葱甾（scillanolide）或蟾蜍甾(bufanolide)为母核命名。,(2)糖部分的结构构成强心苷的糖有20多种。根据它们C2位上有无羟基可以分成-羟基糖（2-羟基糖）和-去氧糖（2-去氧糖）两类。-去氧糖常见于强心苷类，是区别于其它苷类成分的一个重要特征。,（1）-羟基糖：除D-葡萄糖

4、、L-鼠李糖外，还有6-去氧糖如L-夫糖（L-fucose）、D-鸡纳糖（D-quinovose）、D-弩箭子糖（D-antiarose）、D-6-去氧阿洛糖（D-6-deoxyallose）等；6-去氧糖甲醚如L-黄花夹竹桃糖（L-thevetose）、D-洋地黄糖（D-digitalose）等。 （2）-去氧糖：有2，6-二去氧糖如D-洋地黄毒糖（D-digitoxose）等；2，6-二去氧糖甲醚如L-夹竹桃糖（L-oleandrose）、D-加拿大麻糖（D-cymarose）、D-迪吉糖（D-diginose）和D-沙门糖（D-sarmentose）等。,D-鸡纳糖 D-弩箭子糖 D-6

5、-去氧阿洛糖 L-夫糖,D-洋地黄糖 D-洋地黄毒糖 D-加拿大麻糖 L-黄花夹竹桃糖,（三）构成强心苷的糖对强心作用的影响,构成强心苷的糖数目和种类不同，对强心苷活性影响不同。甲型强心苷元及其苷的毒性规律一般为： 苷元单糖苷二糖苷三糖苷单糖苷的毒性次序为： 葡萄糖苷甲氧基糖苷6-去氧糖苷 2, 6-去氧糖苷,乙型强心苷元及其苷的毒性规律一般为： 苷元单糖苷二糖苷乙型强心苷元的毒性相应的甲型强心苷元,（四）糖和苷元的连接方式,强心苷中，多数是几种糖结合成低聚糖形式再与苷元的C3-OH结合成苷，少数为双糖苷或单糖苷。糖和苷的连接方式有三种： 型:苷元-(2,6-去氧糖)X-(D-葡萄糖)Y 型:

6、苷元-(6-去氧糖)X-(D-葡萄糖)Y 型：苷元-（D-葡萄糖）Y 一般初生苷其末端多为葡萄糖。,（五）结构举例,大量的研究证明，强心苷的化学结构对其生理活性有较大影响。强心苷的强心作用取决于苷元部分，主要是甾体母核的立体结构、不饱和内酯环的种类及一些取代基的种类及其构型。糖部分本身不具有强心作用，但可影响强心苷的强心作用强度。强心苷的强心作用强弱常以对动物的毒性（致死量）来表示。,(六)、强心苷的结构与活性的关系,1.甾体母核 甾体母核的立体结构与强心作用关系密切的是C/D环须顺式稠合。一旦这种稠合被破坏，将失去强心作用。若C14羟基为构型时即表明C/D环顺式稠合，若为构型或脱水形成脱水苷

7、元，则强心作用消失。A/B环为顺式稠合的甲型强心苷元，必须具C3-羟基，否则无活性。A/B环为反式稠合的甲型强心苷元，无论C3是-羟基还是-羟基均有活性。,2.不饱和内酯环 C17侧链上、-不饱和内酯环为-构型 时，有活性；为构型时，无活性。3.取代基 强心苷元甾核中一些基团的改变亦将对生理活性产生影响。如C10位的角甲基转化为醛基或羟甲基时，其生理活性增强；C10位的角甲基转为羧基或无角甲基，则生理活性明显减弱。,4.糖部分 强心苷中的糖本身不具有强心作用，但它们的种类、数目对强心苷的毒性会产生一定的影响。一般来说，苷元连接糖形成单糖苷后，毒性增加。随着糖数的增多，分子量增大，苷元相对比例减

8、少，又使毒性减弱。如毒毛旋花子苷元组成的三种苷的毒性比较，结果见下表。,洋地黄毒苷元与不同单糖结合的苷的毒性比较,由上表可知，单糖苷的毒性次序为：葡萄糖苷甲氧基糖苷6-去氧糖苷2，6-去氧糖苷。,二.毛地黄,毛地黄 Digitalis purpurea 科属：玄参科 形态：多年生草花，常作二年生栽培。花期6-8月，果熟期8-10月。,毛花洋地黄中强心苷的种类,由上图可知：在毛化洋地黄中存在：甲，乙，丙，丁，戊五种苷,其中，乙型和丙型苷已得到较为广泛的应用 如：1.毛花洋地黄苷丙通过去乙酰基的反应可得到去乙酰毛花洋地黄苷丙，商品名为西地兰（cedilanid）。2.地高辛是毛花洋地黄苷丙的次级苷

9、。利用毛花洋地黄叶中存在的-D-葡萄糖酶水解除去葡萄糖，再用乙醇提取即可得到。,三、强心苷的物理性质,1.性状： 强心苷多为无色结晶或无定形粉末，中性物质，有旋光性，C17 侧链为-构型的味苦，-构型味不苦，但无效。对粘膜有刺激性。,强心苷的溶解性与所连糖的种类和数目有关，一般可溶于水、甲醇、乙醇、丙酮等极性溶剂；难溶于乙醚、苯、石油醚等非极性溶剂。弱亲脂性苷微溶于氯仿-乙醇(2:1)，亲脂性苷微溶于乙酸乙酯、含水氯仿、氯仿-乙醇（3:1）。,2.溶解性,一般糖基多的原生苷比次生苷或苷元的亲水性强、亲脂性弱，可溶于水等高极性溶剂而难溶于低极性溶剂，多为无定形粉末。 洋地黄毒苷是一个三糖苷，但3

10、分子糖都是洋地黄毒糖，整个分子只有5个羟基，故在水溶液中溶解度小(1:100000000)，溶于氯仿（1:40）。,洋地黄毒苷,但糖基和苷元上羟基数目的多少对溶解性也有一定的影响。如乌本苷是一个单糖苷，却有8个羟基，水溶性很大（1:75），难溶于氯仿。,乌本苷,3.紫外吸收光谱 甲型强心苷由于存在不饱和共轭内酯环，在216-218nm处有最大吸收，当16，17位存在双键时，则最大吸收波长在270nm处。乙型强心苷在300nm处有最大吸收。,1.脱水反应2.水解反应3.颜色反应,四.强心苷类化合物的化学性质,(一)脱水反应,强心苷混合强酸（3%-5%HCl）加热水解时，苷元往往发生脱水反应。（1

11、）C14和C5-OH最易发生脱水反应生成缩水苷元。 （2）同时存在C14-OH和C16-OH，也易脱水，得到二缩水苷元。,（3）如将C3-OH氧化为酮基，则更使C5叔羟基活化，在温热条件下即可脱水而形成烯酮。同样，C16被氧化为酮基，也能促使C14-叔羟基脱水而形成烯酮。（4）若C4位有双键，可促使C3-OH与C4-H脱水，生成共轭双键。,海葱苷A 脱水海葱苷元,羟基洋地黄毒苷 脱水羟基洋地黄毒苷元,鼠李糖-O-葡萄糖,+3 D-洋地黄毒糖,+ L-鼠李糖 + D-葡萄糖,(D-洋地黄毒糖)3,（1）温和酸水解 用稀酸0.020.05mol/L的盐酸或硫酸，在含水醇中经短时间加热回流，可使I型

12、强心苷水解为苷元和糖。由于此水解条件温和，对苷元的影响较小，不致引起脱水反应，对不稳定的-去氧糖亦不致分解。,（二）水解反应,（2）氯化氢-丙酮法（Mannich和 Siewert法）将强心苷置于含1%氯化氢的丙酮溶液中，20放置两周。此法可得到原生苷元和糖衍生物。,（3）强烈酸水解 型和型强心苷与苷元直接相连的均为- 羟基糖，由于糖的2-羟基阻碍了苷键原子的质子化，使水解较为困难，用温和酸水解无法使其水解，必须增高酸的浓度（3%5%），延长作用时间或同时加压，才能使-羟基糖定量地水解下来，但常引起苷元结构的改变，失去一分子或数分子水形成脱水苷元。,强心苷的苷键不被碱水解。但强心苷分子中的酰基

13、、内酯环会受碱的影响，发生水解或裂解、双键移位、苷元异构化等反应。又可分为：（1）酰基的水解（2）内酯环的水解,3.碱水解反应,（1）酰基的水解 强心苷的苷元或糖上常有酰基存在，它们遇碱可水解脱去酰基。一般用碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化钙、氢氧化钡等。-去氧糖上的酰基最易脱去，用碳酸氢钠、碳酸氢钾处理即可，而羟基糖或苷元上的酰基须用氢氧化钙、氢氧化钡处理才可。甲酰基较乙酰基易水解，提取分离时，若用氢氧化钙处理，即可水解。上述四种碱只水解酰基，不影响内酯环。氢氧化钠、氢氧化钾由于碱性太强，不仅使所有酰基水解，而且还会使内酯环开裂。,（2）内酯环的水解 在水溶液中，氢氧化钠、氢氧化钾溶液可使内酯环开

14、裂，加酸后可再环合；在醇溶液中，氢氧化钠、氢氧化钾溶液使内酯环开环后生成异构化苷，酸化亦不能再环合成原来的内酯环，为不可逆反应。,(三)颜色反应强心苷颜色反应很多，根据颜色反应发生在分子的不同部位可分为三类：1.作用于甾体母核的反应： (1).醋酐-浓硫酸反应(Liebermann-burchard rection) (2).氯仿-浓硫酸反应（Salkowski reaction) (3).三氯化锑或五氯化锑反应,2.作用于,不饱和内酯环的反应：甲型强心苷在碱性醇溶液中，发生双键转移，生成活性亚甲基，故可与活性亚甲基试剂作用而显色。乙型强心苷无此类反应。,三.强心苷的检测识别和定性、定量分析方

15、法,(一).常用检测识别方法 ：显色反应,强心苷的显色反应包括五元不饱和内酯环、-去氧糖、甾体母核三部分。,1.五元不饱和内酯环的显色反应,间二硝基苯试剂反应（Raymond反应）,3,5二硝基苯甲酸试剂反应（Kedde反应） 取试样的甲醇或乙醇溶液于试管中，加入3,5二硝基苯甲酸试剂（A液：2%的3,5-二硝基苯甲酸甲醇或乙醇溶液；B液：2mol/L氢氧化钾溶液，用前等量混合）34滴，产生红色或紫红色。原理与间二硝基苯试剂反应类似，本试剂可作为强心苷纸色谱和薄层色谱的显色试剂，喷雾后显紫红色，几分钟后褪色。,取试样的甲醇或乙醇溶液于试管中，加入碱性苦味酸试剂（A液：1%苦味酸乙醇溶液；B液：

16、5%氢氧化钠水溶液，用前等量混合）数滴，呈现橙色或橙红色，反应有时需要15分钟以后才能显色，原理也是活性亚甲基与苦味酸缩合显色。此缩合产物在485nm波长处有吸收峰，药典以此法测定强心苷类药物含量。,碱性苦味酸试剂反应（Baljet反应）,亚硝酰铁氰化钠试剂反应（Legal反应） 取试样1mg2mg，溶于23滴吡啶中，加3%亚硝酰铁氰化钠试剂和2mol/L氢氧化钠各1滴，反应液呈深红色并渐渐消失。,2.作用于-去氧糖的反应,Keller-Kiliani (K-K)反应（三氯化铁-冰醋酸反应） 取试样1mg溶于5ml冰醋酸中，加1滴20%三氯化铁溶液，沿试管壁缓缓加入5 ml浓硫酸，观察界面和醋

17、酸层的颜色变化。如有-去氧糖存在，醋酸层渐呈蓝或蓝绿色。,过碘酸-对硝基苯胺反应 过碘酸将-去氧糖氧化成丙二醛，丙二醛与硝基苯胺试剂反应呈深黄色。,对二甲氨基苯甲醛反应,将试样的醇溶液点在滤纸上，喷以对二甲氨基苯甲醛试剂（1%对二甲氨基苯甲醛的醇溶液4ml加浓盐酸1ml），并于90加热，分子中含有-去氧糖的强心苷可显灰红色斑点。,呫吨氢醇反应（xanthydrol反应） 取试样110g加入呫吨氢醇试剂（呫吨氢醇10mg溶解于100ml冰醋酸中，加入1ml浓盐酸）1ml，置沸水浴中数分钟后呈红色。本反应非常灵敏，只要分子中有-去氧糖都能呈色。可用于含-去氧糖化合物的定性、定量分析。,3.作用于甾

18、体母核的反应,Liebermann-Burchard反应 取试样溶于冰醋酸，加浓硫酸-醋酐（120）混合液数滴，反应液呈黄红蓝紫绿等变化，最后褪色。本反应液的呈色变化过程随分子中双键数目与位置不同而有所差异。Tschugaeff反应 取试样溶于冰醋酸，加无水氯化锌及乙酰氯后煮沸，或取试样溶于氯仿或二氯甲烷，加冰醋酸、乙酰氯和氯化锌煮沸，反应液呈紫红蓝绿等变化，B环有不饱和双键的作用更快。,Salkowski反应 将试样溶于氯仿，沿试管壁加入浓硫酸，静置，氯仿层呈血红色或青色，硫酸层有绿色荧光。Kahlenberg反应 将强心苷的醇溶液点在滤纸或薄层上，喷以20%三氯化锑氯仿溶液（不含乙醇和水）

19、，于100加热数分钟，在可见光或紫外光下可观察到不同颜色的斑点。,三氯醋酸-氯胺T(chloramines T反应) 将试样醇溶液点在滤纸（或薄板）上，喷以三氯醋酸-氯胺T试剂（25%三氯醋酸乙醇溶液4 ml加3%氯胺T水溶液1ml混匀），待纸片干后，100加热数分钟，于紫外光下观察。洋地黄毒苷元衍生的苷类显黄色荧光；羟基洋地黄毒苷元衍生的苷类显亮蓝色荧光；异羟基洋地黄毒苷元衍生的苷类显灰蓝色荧光。该反应可初步区别洋地黄类的苷元。,(二).定性分析,1.化学定性 依据母核结构、苷元的不饱和内酯环、-去氧糖3个方面的结构反应进行鉴别。方法见显色反应。2.色谱定性 由于强心苷类成分的结构类似，因而

20、，色谱法对强心苷的分析有着特殊的价值。包括：纸色谱、薄层色谱等。,（1）纸色谱,根据强心苷及其苷元的极性不同可选用不同的固定相。如强心苷的亲水性较强，宜选用水为固定相，移动相多选用水饱和的丁酮、乙醇-甲苯-水（461）、氯仿-甲醇-水（1025）；如强心苷的亲水性较弱或检识苷元时，可选用甲酰胺为固定相，以甲酰胺饱和的甲苯或苯为移动相。,（2）薄层色谱,吸附薄层色谱 由于强心苷分子中含有较多的极性基团，尤其是多糖苷，在氧化铝上吸附作用较强，分离效果较差，因此常采用硅胶作吸附剂，以氯仿-甲醇-冰醋酸（85132）、二氯甲烷-甲醇-甲酰胺（80191）、醋酸乙酯-甲醇-水（855）等溶剂系统作为移动

21、相。这些展开剂中含少量甲酰胺或水可以减少拖尾现象。,分配色谱 一般选用硅藻土、纤维素为支持剂，甲酰胺、二甲基甲酰胺或乙二醇作固定相。氯仿-丙酮（41）、氯仿-正丁醇（191）等溶剂系统作移动相。,（3）纸色谱和薄层色谱常用的显色剂,适用于甲型强心苷的显色剂 1%苦味酸水溶液与10%氢氧化钠水溶液（955）混合，喷后于100烘数分钟，显呈橙红色；2%3,5-二硝基苯甲酸乙醇溶液与2mol/L氢氧化钾溶液等体积混合，喷后显红色，数分钟后渐褪色。适用于各类强心苷的显色剂 2%三氯化锑的氯仿溶液，喷后于100烘数分钟，各种强心苷及苷元显不同颜色；25%三氯醋酸乙醇溶液与3%氯胺T(41)混合，喷后于1

22、00加热数分钟，在紫外灯下显蓝（紫）、黄（褐）色荧光。,(三).定量分析方法,利用强心苷中 ， 不饱和五元内酯易与某些芳香硝基化合物（如间 - 二硝基苯）形成有色加成物，采用紫外 - 可见分光光度法测定生药中总强心苷的含量。 单体强心苷可用薄层扫描法、高效液相色谱法或柱前衍生化气相色谱法测定。,*反相薄层层析法对洋地黄叶中强心苷定量分析（文献1）,将洋地黄叶冷冻干燥，粉碎成500m一下得粉末，250mg叶末中添加内标物-脱水去乙酰基毛花洋地黄苷A，用50甲醇提取。提取物中加3ml甲醇及50ml乙酸乙酯过滤后，上SwpPak（二氧化硅）柱。先用氯仿-丙酮-乙酸（70：30：0.05）分离2级糖苷

23、，在以氯仿-甲醇-水-乙酸（90：10：0.8：0.05）分离原糖苷。分别以Sep-Pak(C18)纯化，TLC出现斑点，再用KC18F板（20cm）层析，分离原糖苷的展开溶剂位乙腈-甲醇-0.5M NaCl(1:1:1)，分离2级糖苷用乙腈-甲醇- 0.5M NaCl(12:7:9），使用岛津TLC扫描仪，以反射吸收法在225nm处检测。,结果，100mg叶末中的含量依次为：毛花洋地黄苷A56.72.4g，毛花洋地黄苷B16.11.2 g,毛花洋地黄苷C322.740.8 g,去毛花洋地黄苷C27.0 3.9g,-乙酰洋底黄毒苷20.52.9g， -乙酰基异羟基洋底黄毒苷17.92.7g。,

24、四、强心苷的提取分离,强心苷含量很低，多与糖类、皂苷、色素、鞣质等共存，这些成分的存在可影响强心苷在溶剂中的溶解度。同时，强心苷的原生苷和次生苷共存，且很多结构相似的苷同存，故提取分离较难。因酸碱可使强心苷发生水解、脱水和异构化，故提取分离时应注意控制酸碱性。,(一)、提取方法,由于强心苷易受酸、碱、酶的作用，发生水解、脱水及异构化等反应。在提取分离时要注意这些因素的影响和应用。在研究或生产中，若以提取分离原生苷为目的时，须防止酶水解。 常用70%80%的乙醇为提取溶剂。当原料中含脂类杂质较多时，须用石油醚或汽油脱脂后再提取。 原生苷:抑制酶的活性(冷冻干燥、快速提取、快速干燥)MeOH、70

25、%EtOH提取。次生苷:利用酶的活性,EtOH、EtOAc提取。,(二)、分离纯化方法,分离强心苷可以采用重结晶法、溶剂萃取法、逆流分溶法和色谱分离法。在大多数情况下需要采用多种方法配合使用，反复分离才能得到单体。,(三)分离提取工艺部分,1.从毛地黄中提取分离粗总苷(主要含毛花洋地黄苷甲、乙、丙)；2.毛花洋地黄总苷（混合苷）中苷甲、乙、丙以及苷元部分的分离提取；3.西地兰、地高辛的分离提取；,1.从毛地黄中提取分离粗总苷工艺流程,2.(1)毛花洋地黄总苷（混合苷）中苷甲、乙、丙的分离提取；,毛花洋地黄叶中主要含强心苷类化合物，达三十余种，其中主要由五种强心苷元组成.大多为次生苷.毛花洋地黄

26、苷甲、乙、丙、丁、戊为原生苷.从粗总苷中分离原生苷即：毛花洋地黄苷甲、乙、丙的工艺流程如下图所示.,毛花洋地黄总苷（混合苷）中苷甲，乙，丙的分离,粗总苷,按粗总苷-甲醇-氯仿-蒸馏水（1:100:500:500）的比例进行第一次分离,现将总苷溶于甲醇，过滤，在向滤液中加入氯仿和水,稀甲醇层,氯仿层,母液,粗结晶（主要含苷丙和乙）,氯仿层,稀甲醇层,减压浓缩至小体积，冷却，抽滤析出的结晶,常压回收氯仿,氯仿,残渣（主要含苷甲和乙）,按上述第一次分离配比进行第二次分离,常压回收氯仿,残渣 （主含苷乙）,减压浓缩,母液,结晶（主含苷丙）,原生苷、次生苷分离时的注意事项,由于苷结构特点及性质,提取原生

27、苷时一般需要注意以下方面： 1.提取过程中避免接触酸或碱； 2.设法抑制或破坏酶的活性。抑制或破坏酶的活性的方法： 1.新鲜植物药材迅速干燥或加入硫酸铵水溶液研磨促使酶变性； 2.提取时用沸水、甲醇、60以上浓度的乙醇； 3.加入碳酸钙拌匀后沸水提取。,(2)苷元部分的分离提取,3.(1)去乙酰毛花洋地黄苷丙(西地兰)的制取,制取过程分为提取总苷、分离苷丙(见总苷分离部分)和水解去乙酰基三个阶段。水解去乙酰基 毛花洋地黄苷丙去乙酰基的反应（即洋地黄毒糖上的酯键水解）较易进行。常采用氢氧化钙或碳酸钾，按苷丙-甲醇-氢氧化钙-水（1g33ml70mg33ml）的配比，先将苷丙溶于甲醇中，氢氧化钙溶

28、于水中，分别滤清，再混合均匀，静置过夜。使水溶液呈弱碱性。水解完毕，用1%的盐酸调至中性。滤过，滤液减压浓缩至约20%的体积，放置过夜，滤过得到粗结晶，用甲醇重结晶即得西地兰纯品（mp265268）。,去乙酰基毛花洋地黄苷丙(西地兰)的工艺流程,4.地高辛(异羟基洋地黄毒苷)的制取,地高辛是毛花洋地黄苷丙的次级苷，为白色结晶或结晶性粉末。熔点235245（分解）， +9.512(吡啶)，无臭，味苦。溶于稀乙醇、吡啶或氯仿与乙醇混合液中。几不溶于水、乙醚、丙酮、醋酸乙酯、氯仿，在80%乙醇中的溶解度比羟基洋地黄毒苷大。利用毛花洋地黄叶中存在的-D-葡萄糖酶水解除去葡萄糖，再用乙醇提取。,地高辛制

29、取的工艺流程,参考文献,1.反相薄层层析法对洋地黄叶中强心苷定量分析.国外医学中医中药分册.1996年第18卷第2期34页2.汪洋,李孟全.HPLC 法测定糖芥不同部位强心苷的含量研究.中医药学刊.第23卷第5期2005年5月3.刘瑞源, 钟平, 戴开金.大孔吸附树脂提取中草药有效成分的研究进展.4.袁黎明,傅若农,张天佑.高速逆流色谱在植物有效成分分离中的应用.药物分析杂志.第18(1)期60页1998年5.尹茶,吴玉田.高效毛细管电泳技术及其在中药分析中的应用.药物分析杂志.第19(3)期210页1999年.6.姜艳艳,刘斌,石任兵.高效液相色谱&质谱联用技术在天然产物分离鉴定中的应用.药

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