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1、化学发光和生物发光 I,一、引言,公元前亚里士多德 真菌类和死鱼的发光1668年，罗伯特.波义耳 BL需要氧参与19世纪80年代末，Dubois命名荧光虫素酶和荧光虫素1877年，Radziszewski发现洛汾碱的CL1928年，Albrecht发现luminol的CL1935年，光泽精的CL1950年，商品化仪器出现,化学发光是化学反应的反应物或生成物（或荧光物质）吸收了反应释放的化学能后所产生的光辐射。根据化学发光反应在某一时刻的发光强度或发光总量来确定反应中相应组分含量的分析方法叫化学发光分析法。,二、常见的溶液化学发光和生物发光体系,鲁米诺化学发光反应体系过氧化草酸盐反应体系光泽精化
2、学发光反应体系吖啶酯类化学发光反应体系1,2-二氧杂环丁烷类化学发光体系高锰酸钾化学发光反应体系Ce(IV)化学发光反应体系钌(II)-联吡啶配合物化学发光反应体系铁氰化钾直接氧化反应体系电化学发光反应体系荧火虫素（luciferine)-荧火虫素酶（luciferase-磷酸三腺苷（ATP）体系 NADPH：FMN氧化还原酶和细菌荧光素酶催化的发光反应其他化学发光反应体系,1.鲁米诺化学发光反应体系,鲁米诺化学发光反应机理,鲁米诺衍生物,环状酰肼结构是发光的关键,15,14,16,17,鲁米诺反应体系的应用,金属离子或酶的催化作用测定金属离子或酶H2O2或其他氧化剂 测定过氧化氢或氧化剂某些
3、分子的增强、抑制作用测定此类分子偶合反应间接测定无机或有机化合物通过标记化合物测定此类物质或免疫分析,2.过氧化草酸酯类反应体系,典型过氧化草酸酯分子结构式双(2,4,6-三氯苯基)草酸盐,过氧化草酸酯体系发光机理,双(2,4-二硝基苯基)草酸酯-过氧化氢-红荧烯，发光总量子产率23%。为效率最高的化学发光反应。溶解度小，不稳定，浓度猝灭效应强,TCPO-CL在药物分析中的应用,3.光泽精化学发光反应体系,光泽精化学发光反应,光泽精的分子结构式,4. 吖啶酯类化学发光反应体系,5、1,2-二氧杂环丁烷类化学发光体系,6、酸性高锰酸钾化学发光体系,高锰酸钾-吗啡高锰酸钾-连二亚硫酸钠体系KMnO
4、4(H+)-甲氧苄啶-硫代硫酸钠化学发光反应体系KMnO4(H+)-EC-RNA化学发光体系高锰酸钾-草酸,高锰酸钾-亚硫酸盐体系发光机理,最佳pH=2.5HSO3 + MnO4 HSO3 + MnO42 2HSO3 S2O62 +2H+S2O62 SO42 +SO2*HSO3为SO2水解生成，pH=2.5时比例最大,高锰酸钾TCs CL体系测定盐酸四环素、盐酸土霉素,高锰酸钾 CL体系的应用,过氧化氢药物氧化还原化学发光体系测定核黄素、VB1、四环素、土霉素、金霉素等,7. 过氧化氢直接氧化化学发光体系,8. Ce(IV)化学发光反应体系,Ce(IV)SO32-体系 Ce(IV)Ru(bpy
5、)32+ CL体系 Ce(IV)直接氧化药物产生化学发光,1 、 Ce(IV)SO32体系,喹诺酮类化合物（氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、洛美沙星等）的FIACL测定,2 、 Ce(IV)Ru(bpy)32+ CL体系 利用此体系测定测定丙酮酸、Vc、巴比妥酸、酒石酸等,Ru(bpy)32+ + Ce(IV) Ru(bpy)33+ + Ce(III)Org + Ce (IV) Org-Ce(IV) 快反应Org-Ce(IV) Org* + Ce(III) 慢反应Ru(bpy)33+ + Org* Ru(bpy)32+* + PRu(bpy)32+* Ru(bpy)32+ + h,3 、 Ce(
6、IV)直接氧化药物产生化学发光 利用此体系测定一系列药物，如奎宁、奎尼丁、辛可宁、萘普生、卡托普利、非那西汀、青霉胺、安乃近、VK3等。,9. 钌(II)-联吡啶配合物化学发光反应体系,Ru(bpy)33+药物氧化还原CL体系的应用,10. 铁氰化钾直接氧化反应体系,N-溴丁二酰亚胺（NBS）可以在碱性介质中氧化脲产生强的化学发光。,H2NCONH2 + H2O 2NH3 + CO2 3NBS + 2NH3 + 3OH- 3NHS + N2* + 3Br- + 3H2O N2* + f N2 + f* f* f + h,11. NBS体系,NBS体系还用于测定异烟肼链霉素、氨基吡脒等,12.电
7、化学发光反应体系,电化学发光分析是对电极施加一定的电压进行电化学反应，反应的产物之间或与体系中某种组份进行反应产生化学发光，用光电倍增管等光学仪器测量发光光谱和强度，从而对物质进行痕量分析的一种方法。,12.1电致化学发光反应体系,ECL物质包括三联吡啶（或联吡嗪或林菲罗啉）的钌、锇和铼类络合物、鲁米诺、吖啶酯等。研究最多的还是钌(II)-联吡啶的ECL。,Ru(bpy)32+和还原性分析物的ECL反应机理,12.2 鲁米诺电化学发光体系,在电极上所产生氧化性物质来氧化鲁米诺产生化学发光。在电极上施加一定的电压，从而使溶液中的溶解氧还原成H2O2，H2O2进一步反应产生一些具有强氧化性的氧自由
8、基，这些活性氧与鲁米诺反应产生化学发光 鲁米诺直接接受电极通过的能量生成激发态或自由基离子，从而产生化学发光。 鲁米诺电化学发光体系在分析化学中应用主要分以下四类：（1）测定H2O2，或通过偶合反应测定生物活性物质，如葡萄糖、乳酸等。（2）基于金属离子对鲁米诺电化学发光反应的催化作用，测定金属离子,，如Co2+、Cu2+、Ni2+。（3）基于一些有机物对鲁米诺电化学发光体系的增敏或抑制作用测定这些有机物，如异烟肼、肾上腺素、没食子酸。（4）利用不同的电极材料，测定鲁米诺或鲁米诺所标记的物质。,12.3 电位溶出化学发光反应体系,特点：,1. 高灵敏度和高选择性2. 结合了两种方法的优点，克服各
9、自的缺点3. 从原理上说，所有能用电化学方法富集且能用CL检测的物质都可用此法测定。电化学富集数据完善，CL检测体系很多。此方法有很好应用前景。,12.4电生试剂化学发光反应体系,13、荧光素（luciferine)-荧光素酶（luciferase-磷酸三腺苷（ATP）体系,检测食品中总菌数,腰鞭毛虫（Dinoflagellate）荧光素酶 含有三个结构域，每个都具有发光活性，底物为腰鞭毛虫荧光素，同时需要O2参与；该荧光素在中性pH条件下与一种特定的荧光素结合蛋白（LBP）结合并被持续氧化，当pH下降时荧光素与结合蛋白解离并与上述荧光素酶结合，因此改变pH可调控其发光强度变化 。,水母素（A
10、equorin）及奥贝林（Obelin）含腔肠素（Coelenterazine）过氧化物生色团，因此只需要Ca2+激活,14、NADPH：FMN氧化还原酶和细菌荧光素酶催化的发光反应,细菌荧光素酶（luciferase，LUX）由两个对称的杂合二聚体构成，底物为FMNH2和醛,不同生物发光荧光素的结构及其中间产物和最终发光分子,不同生物发光荧光素的结构及其中间产物和最终发光分子,水母荧光素,细菌荧光素（FMNH2）,腰鞭毛虫荧光素,萤火虫荧光素,发光分子,发光分子,发光分子,发光分子,长链醛,15、基于纳米材料的CL,纳米TiO2乙醇，丙酮,Anal. Chem. 2002, 74, 120-124,含氯有机物,Anal. Chem. 2002, 74, 6279-6284,A Catalytic Nanomaterial-Based Optical Chemo-Sensor Array,J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 14420-14421,纳米金催化化学发光,Anal. Chem., 2005, 77, 3324-3329,量子点,HgTe, H2O2, KMnO4,16、微波引发的金属增强化学发光,J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 13372-13373,
