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1、病原微生物标本的采集、保存及运输方法,病原微生物标本的采集,标本采集种类血液标本（抗凝血与非抗凝血）呼吸道标本上呼吸道标本（咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物、咽漱液、痰液等）下呼吸道标本（呼吸道抽取物、支气管灌洗液、胸腔积液、肺组织活检标本等）。消化道标本 （粪便和肛拭子）尿液标本其他人体标本 （脑脊液、疱疹液、淋巴结穿刺液等）尸体解剖标本采集媒介和动物标本采集环境标本采集,病原微生物标本的采集,标本采集中的注意事项采样时生物安全的考虑采样时间及部位采样容器采样标本的标识各种标本的采样方法,病原微生物标本的采集,采样时生物安全的考虑1)具有掌握相关专业知识和操作技能的工作人员；住院病例的标本由所在医
2、院医护人员在当地疾控机构专业人员指导下采集。密切接触者标本由当地疾控机构负责采集。2具有与采集病原微生物样本所需要的生物安全防护水 平相适应的设备，包括个人防护用品（隔离衣、帽、 口罩、鞋套、手套、防护眼镜等）、防护材料、器材 和防护设施等； 3)具有有效的防止病原微生物扩散和感染的措施；4)具有保证病原微生物样本质量的技术方法和手段。,病原微生物标本的采集,采样时间及部位时间:一般在怀疑细菌感染时应尽量在急性发病期和使用抗生素之前采集标本，进行细菌的分离培养，否则这种标本在分离培养时要加药物拮抗剂。作病毒分离和病毒抗原检测的标本，应在发病初期和急性期采样，因为此时病毒在体内大量繁殖，检出率高
3、，病毒分类标本最好在发病12天内采取。部位：根据致病菌在患者不同病期的体内分布和排出部位，采集不同的标本。例如伤寒病人应在发病早期未使用抗生素之前采血培养，在23周时停用抗生素2天后采粪便培养。全病程可做骨髓培养。,病原微生物标本的采集,采样容器采集标本应使用无菌容器，一个标本一个容器。对容器基本要求是选耐用材料制成，容器包装好后可防渗漏。能承受空中地面运送过程中可能发生的温度和压力变化。,病原微生物标本的采集,采样标本的标识包括种类、原始采样容器、标本性质、数量、运送人和接受人及其包装日期、运输日期、统一的识别编号及病人联系方式、姓名、检验目的、临床诊断等信息。其他信息如病人信息（年龄、性别
4、、完整地址），临床资料（发病日期、临床症状、治疗史、可疑的发病原因、采样前是否用抗生素），急性或恢复期标本，症状类似病人的其他标本。接收标本的实验室也应记录接收日期和时间、接受标本者的姓名、标本性质和状态等。这些信息都是解释检验结果所必需的。,病原微生物标本的采集,各种标本的采样方法(1)血液采集全血：作血液病原培养时，严格用无菌穿刺法采静脉血，移入无菌的有螺口的抗凝的容器或培养瓶中送检。采集量为3-5毫升。做核酸检测时，抗凝剂一般使用EDTA-K3或枸橼酸钠，不可用肝素。血清：用于检测IgM的血清一般采于发病1个月内；用于检测IgG的血液应收集两次，第一次于发病初期（13天），越早越好，第二
5、次血样一般在恢复期（第一次采血后34周）。双份血清同时检测，如抗体滴度有4倍以上升高才有意义。 （2）粪便采集：应在急性腹泻期及用药前采集自然排出的粪便。采集时应用灭菌棉拭子多点蘸取患者新鲜排出粪便的脓血、粘液、水样便或稀便部分，采样量一般3-5克。（3）咽拭子：令患者仰头张口，用压舌板压舌，将无菌棉拭子伸入口腔，适度用力拭涂抹咽后壁和两侧扁桃体部位，放入盛有3-5mlHanks液的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封。,病原微生物标本的采集,各种标本的采样方法（4）肛拭子：用棉花拭子在3-5mlHanks液中浸湿，插入肛门2-3cm处，自肛门周围皱襞处拭取，或在肛门口内轻轻旋转涂
6、擦，然后插入盛有3-5mlHanks液采样管内。 （6）疱疹液：可同时采集多个疱疹作为一份标本。先用75%酒精对疱疹周围的皮肤进行消毒，然后用消毒针将疱疹挑破用棉签蘸取疱疹液，迅速将棉签放入盛有3-5mlHanks液中、在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封。 如用于核酸检测的标本采集采集咽拭子或肛拭子等用于检测核酸时不能使用棉拭子和木质拭子棒，因为这类材料中含有核酸扩增抑制剂，而要使用灭菌人造纤维拭子和塑料棒。,病原微生物标本的采集,各种标本的采样方法（5）脑脊液：在无菌条件下由腰椎穿刺，用无菌试管收集35ml，（作厌氧培养时标本应注入厌氧瓶内），操作最好在医院内由有经验的医生按腰椎穿刺术进
7、行。（6）疱疹液：可同时采集多个疱疹作为一份标本。先用75%酒精对疱疹周围的皮肤进行消毒，然后用消毒针将疱疹挑破用棉签蘸取疱疹液，迅速将棉签放入盛有3-5mlHanks液中、在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封。,病原微生物标本的采集,禽流感环境标本采集采样液：可使用 PH 7.4-7.6 Hanks或Eagles等培养液加入以下抗菌素和0.5%BSA(也可以使用MEM、EMEM、DMEM，价格相对较高 )：采样液最好现配现用氨苄青霉素 (2 x 106 IU/L)：主要对G+菌作用强链霉素 (200 mg/L) ：主要对G-菌，结核杆菌有抑制作用两性菌素 B (2 x 106 IU/L)
8、:主要为抗真菌作用庆大霉素 (250 mg/L):广谱抗生素 制霉菌素 (0.5 x 106 IU/L) 盐酸氧氟沙星 (60 mg/L)：广谱菌，对多数肠杆菌科细菌等G-菌较强的抗菌活性磺胺甲基异恶唑 (0.2 g/L),病原微生物标本的采集,禽流感环境标本采集,1、水标本禽类饮用水：在每个笼具旁的饮水槽采集一份饮用水标本,将水槽中的水样用无菌的、一次性的玻璃棒或棉签充分混匀后采集5-10ml置于15ml外螺旋盖的管内。水沟或水池:清洗禽类的污水:,病原微生物标本的采集,2、擦拭标本笼具表面擦拭标本：用蘸有采样液的带有聚丙烯纤维头的拭子擦拭笼具表面禽类最常接触的3-5个不同部位（包括笼具底部
9、），然后将擦拭过的拭子放入含5ml采样液的采样管中，尾部弃去。也可以用多个拭子充分擦拭笼具表面后放到一个采样管中宰杀或摆放禽肉案板表面的擦拭标本：如果宰杀或摆放禽肉使用不同的案板，可采集擦拭标本放到不同的采样管中。方法与采集笼具表面擦拭标本的方法相同，拭子要擦拭禽肉接触最多的部位,病原微生物标本的采集,3、粪便标本 从禽舍或环境中采集新鲜禽类粪便样品5g左右，放入含5ml采样液的采样管中，充分混匀。同一地点多份粪便标本可置于同一采样管中。 4、其它标本笼具周围标本（笼具下地面，笼具垫草等）内脏拭子皮毛拭子等。,病原微生物标本的保存,总原则：根据标本种类及检测内容确定标本的保存方式。用于细菌检测
10、的标本：常需无菌、无抗生素保存，从而能确保目标细菌的存活并抑制其他微生物的过度生长。一般在4 C或室温保存。用于病毒检测的标本：一般应放在保温容器（0C4C）里，不可放置超过2天，如不能立即分离病毒时，应将标本冻存保存。若长期储存，最好在70C冻存。,病原微生物标本的保存,如怀疑是寄生虫，所取粪便中加入10%福尔马林和PVA防腐剂（充分混合）。用于检测抗原或抗体的标本可在4C8C保存2428h，在20C保存时间更长。检测抗体的血清可在4C保存约一个星期，最长10天；超过一周必须在-20C下冷冻。,病原微生物标本的保存,实验室必须对所有标本建立追踪系统，此系统中必须严格注明标本基本信息，如标号，
11、标本唯一识别码，采样日期，地点，采样人等；患者的基本信息、临床诊断检测结果，以及实验室检测信息，如检测项目、时间和结果。从而可随时了解标本涞源信息，追踪原始出处。,病原微生物标本的包装,任何感染性材料的包装和运输都必须遵循WHO对传染性物质和诊断性标本的安全运送指南（WHO，1997）。标准的包装方法和材料应能确保即使在运送中包装意外受损时也能保护人员的安全及标本的完整。因此运送标本时要进行三层包装。,病原微生物标本的包装,原始的容器应该是防漏的，可盛容量不大于500ml。在原始容器与第二层包装之间应放置有吸附作用的材料。并辅以第二层防漏包装。运输标本的外包装必须有明确的标签，标明寄送人和接收
12、人的详细联系方式、包装日期和运输日期等。,病原微生物标本的包装,国际民航组织危险品航空安全运输技术细则中将感染性物质分为A和B两类。A类指人感染后发病的可能性大，传染性强，对人群危害性大的烈性感染性物质感染性物质。高度怀疑具有严重危害性的感染性物质感染性物质也属于A类。A类感染性物质感染性物质联合国编号UN2814和UN2900（只导致动物致病）采用P620包装要求。 A类之外，仅具有一般危险性，引起感染的机会较少的感染性物质感染性物质为B类（联合国编号UN3373），采用P650包装要求。,A类包装和B类包装区别1,A类包装和B类包装区别2,UN3373,A类感染性物质的包装材料,B类感染性
13、物质的包装材料,A类感染物质的标识,B类感染物质的标识,UN3373,Biological substance, Category B（生物物质，B类）,病原微生物标本的实验室间传递,应制定对危险材料运输的政策和程序，包括危险材料在实验室内、实验室所在机构内及机构外部的运输，应符合国家和国际规定的要求。应以防止污染人员或环境的方式运输危险材料，并有可靠的安保措施。危险材料应置于被批准的本质安全的防漏容器中运输。,病原微生物标本的运输,地面运送标本时注意将装有标本的箱子紧紧固定在交通工具上，车上还应备有吸水材料、消毒剂、手套、口罩、护目镜、密封防水的废弃物容器等防护用品。为避免路途颠簸引起标本溶
14、血，可在运送前分离血清。 在国际、国家、商业的有关规定允许下，诊断标本也可空运，应注意规范包装。,病原微生物标本的运输,分离培养细菌、病毒的标本大多数要求冷藏运送。脑膜炎球菌等应在35C37C保温运送。血液标本用于细菌、病毒或寄生虫分离时，需低温保存，不能冷冻。用冰块而不是干冰运送。做立克次体类微生物的全血标本要求干冰保存和冷冻运送。检测核酸样品的运送要求低温快速。从标本采集到检测的间隔时间要尽可能短，并尽可能将标本处于冷藏状态。检测前保存时间较长时则需冷冻标本防止核酸降解。,我国对病原微生物菌（毒）种及样本运输的有关规定,尽量陆路运输； 报卫生主管部门批准（跨省报卫生部） 包装、容器和标识符
15、合要求 二人护送，不能通过城市公交 发生泄漏2小时内报告,可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定,可感染人类的高致病性病原微生物（毒）种或样本运输管理规定已于2005年11月24日经卫生部部务会议讨论通过，现予以发布，自2006年2月1日起施行。,可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定,目的：为加强可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输的管理，保障人体健康和公共卫生，依据中华人民共和国传染病防治法、病原微生物实验室生物安全管理条例等法律、行政法规的规定，制定本规定。定义：本规定所称可感染人类的高致病性病原微生物（毒）种或样本是指在人间传染的病
16、原微生物名录中规定的第一类、第二类病原微生物菌（毒）种或样本。 适用范围：本规定适用于可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本的运输管理工作。人间传染的病原微生物名录中第三类病原微生物运输包装分类为A类的病原微生物菌（毒）种或样本，以及疑似高致病性病原微生物菌（毒）种或样本，按照本规定进行运输管理。,可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定,运输以上范围内规定的菌（毒）种或样本（以下通称高致病性病原微生物菌（毒）种或样本），应当经省级以上卫生行政部门批准。未经批准，不得运输。申请单位：从事疾病预防控制、医疗、教学、科研、菌（毒）种保藏以及生物制品生产的单位，因工作需要，
17、可以申请运输高致病性病原微生物菌（毒）种或样本。运输申请：申请运输高致病性病原微生物菌（毒）种或样本的单位（以下简称申请单位），在运输前应当向省级卫生行政部门提出申请，并提交以下申请材料（原件一份，复印件三份）：,1.可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输申请表,（接收单位）具备从事高致病性病原微生物实验活动资格的实验室； （接收单位）取得有关政府主管部门核发的从事高致病性病原微生物实验活动、菌（毒）种或样本保藏、生物制品生产等的批准文件。,接收单位应当符合以下条件： 1.具有法人资格； 2.具备从事高致病性病原微生物实验活动资格的实验室； 3.取得有关政府主管部门核发的从事高致病
18、性病原微生物实验活动、菌（毒）种或样本保藏、生物制品生产等的批准文件。,在固定的申请单位和接收单位之间多次运输相同品种高致病性病原微生物菌（毒）种或样本的，可以申请多次运输。多次运输的有效期为6个月；期满后需要继续运输的，应当重新提出申请。,省内运输审批： 申请在省、自治区、直辖市行政区域内运输高致病性病原微生物菌（毒）种或样本的，由省、自治区、直辖市卫生行政部门审批。,省级卫生行政部门应当对申请单位提交的申请材料及时审查，对申请材料不齐全或者不符合法定形式的，应当即时出具申请材料补正通知书；对申请材料齐全或者符合法定形式的，应当即时受理，并在5个工作日内做出是否批准的决定；符合法定条件的，颁
19、发可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本准运证书；不符合法定条件的，应当出具不予批准的决定并说明理由。,跨省运输审批： 申请跨省、自治区、直辖市运输高致病性病原微生物菌（毒）种或样本的，应当将申请材料提交运输出发地省级卫生行政部门进行初审；对符合要求的，省级卫生行政部门应当在3个工作日内出具初审意见，并将初审意见和申报材料上报卫生部审批。,卫生部应当自收到申报材料后3个工作日内做出是否批准的决定。符合法定条件的，颁发可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本准运证书；不符合法定条件的，应当出具不予批准的决定并说明理由。,突发疫情 对于为控制传染病暴发、流行或者突发公共卫生事件应急处
20、理的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本的运输申请，省级卫生行政部门与卫生部之间可以通过传真的方式进行上报和审批；需要提交有关材料原件的，应当于事后尽快补齐。,根据疾病控制工作的需要，应当向中国疾病预防控制中心运送高致病性病原微生物菌（毒）种或样本的，向中国疾病预防控制中心直接提出申请，由中国疾病预防控制中心审批；符合法定条件的，颁发可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本准运证书；不符合法定条件的，应当出具不予批准的决定并说明理由。中国疾病预防控制中心应当将审批情况于3日内报卫生部备案。,运输申请单位,卫生部科教司,中国CDC(实验室管理处),出发地省级卫生行政部门,初审（3个工作日）,
21、核发准运证或出具不予批准的决定及理由,核准申请的单位，在运输任务结束后，书面报告运输情况,3日内报卫生部,备案,审批,陆路运输水路运输民用航空运输,实验室检测技术,镜检形态学观察细菌的分离培养细菌的鉴定病毒的分离培养,直接涂片镜检形态学观察,直接涂片染色后镜检适用于形态和染色上具有特征性的病原菌。例如痰中查见抗酸性细长杆菌，脓液中发现革兰氏阳性葡萄串状球菌，咽喉假膜中有异染颗粒的棒状杆菌及霍乱弧菌、艰难梭菌等。优点是方便快捷，缺点是适用范围小。,电镜技术：可快速诊断病毒，适用于形态特殊且并病毒量较多的标本。缺点是设备昂贵，对技术人员要求高，并需要一定的病毒量。,细菌的分离培养,无菌部位采集的脑
22、脊液、血液等标本，可直接接种至营养丰富的液体或固体培养基。有正常菌群存在部位所取标本（如粪便），应接种至选择或鉴别性培养基。缺点：耗时较长（需4872h），过程繁琐，优点：能获得病原菌，特异性为100%，是许多细菌性传染病实验室确诊的最重要证据，因此，在暴发疫情中要求尽可能进行病原菌分离来获得实验室确诊证据。,抗生素敏感性检测对分离的病原菌进行抗生素敏感性试验能够知道临床用药和制定暴发疫情中高危人群的预防服药控制措施；还能观察病原菌的耐药谱变迁，了解局部地区细菌耐药的危害程度，对细菌性传染病的有效控制和减少抗生素滥用具有重要意义。,细菌的鉴定,生化鉴定生化代谢特征是鉴定病原菌的重要方法之一。如
23、糖发酵试验等。现有多种微量、快速、半自动或全自动细菌生化反应试剂盒和检测仪器，极大地方便了菌株鉴定工作。血清鉴定与分型利用已知的特异抗体的诊断血清可以确定细菌的种和型。常用方法是玻片凝集实验，在数分钟内能可得出结果。,4.、免疫学检测,凝集反应包括直接凝集反应、间接凝集反应、间接凝集抑制反应和协同凝集反应。,沉淀反应主要有单免疫扩散、双免疫扩散和对流免疫电泳。免疫标记技术包括免疫荧光技术、放射免疫测定和免疫酶技术，其中免疫酶技术还包括酶联免疫吸附实验（ELISA）、夹心法，以及生物素加亲和素的ELISA方法。现场应用最多的是ELISA方法。,6、核酸检测,核酸诊断主要用于检测难以培养的微生物、
24、或目前培养方法不敏感、花费高或耗时太久的情况。优点：省时，灵敏性高。在严格控制实验过程的条件下，对于病因诊断有很好的作用。缺点：实验过程控制不严格时可能产生假阳性结果。实验条件、经验和试剂成本要求高。因此在应用时要考虑对疫情控制的需要，考虑必要性和可行性。,核酸检测方法主要有如下几种：聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）分子杂交技术（molecular hybridization）基因芯片技术序列分析,具有特异、敏感、快速、简便和容易自动化等特点。为增加灵敏度和特异度，普通PCR又演化有多种方法，如RT- PCR、PCR-RFLP、套式PCR、多重PCR、
25、实时PCR技术。近来实时PCR技术用于临床检测得到迅速发展和普及，可实时检测到信号的变化，并且整个反应过程为密闭，不需电泳检测结果，避免了产物的扩散和交叉污染，具有较好应用前景。,聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）,通常在支持膜上进行，又称为核酸印迹杂交。根据检测样品的不同又被分为DNA印迹杂交和RNA印迹杂交。DNA探针杂交在检测没有成熟可靠的培养方法的临床标本时具有突出的优点，如HPV、乙肝病毒（HBV）、和EB病毒的检测。与传统鉴定方法相比，针对荚膜组织胞浆菌、皮炎芽生菌、粗球孢子菌和新生隐球菌的检测探针具有独特的优点。,分子杂交技术（molecu
26、lar hybridization）,基因芯片技术核酸检测,芯片是一块方形的玻璃，上面铺了一层肉眼看不见的DNA探针。待测的样品基因被切成长短不一的片断，用荧光化学物质标记，然后作为一种溶液注射到嵌有芯片的胶片上。用装有激光设备的仪器来检测，通过激光光束激发后会发出荧光。荧光的强弱与DNA探针杂交程度有关，根据荧光强弱的图案就可以检测目的基因。用于现场诊断有一定应用前景。,序列分析,测定核酸一级结构的方法，是目前鉴定细菌或病毒特征的有效方法。对已知的病原体，通过特定序列测定可以精确地鉴定出所属的亚型；对未知的病原体，通过序列测定可以确定其在生物分类学上的归属。1999年我国在青海省检出的输入性
27、脊髓灰质炎野病毒以及SARS病毒属于冠状病毒的确定都是通过序列分析得到的结果。,7、现场快速检测,快速检测方法操作过程简单，结果判断不需借助仪器或只需要小型的仪器。适合现场应用，要求灵敏度高、对特异度的要求相对低些，以便能进行初筛。胶体金层析检测卡优点是方便快速，标本处理简单、无需仪器、肉眼判定结果、并且一般在15min内完成，适于现场使用。但结果的可靠性需要证实。 此外，还有ELISA法、直接涂片法等。环介导等温扩增技术,细胞毒素检测,许多致病菌可产生外毒素，这些毒素可能具有神经毒性、肠毒性、细胞毒性，检测这些细菌毒素有助于细菌鉴定及毒力鉴定，如检测白喉毒素、霍乱毒素、志贺毒素、金葡菌毒素等
28、。现有已研制出几种检测常见细菌毒素的仪器，能够快速进行检测。,动物实验,主要用于分离鉴定病原菌、测定菌株产毒性等。例如常用家兔或豚鼠皮肤检测白喉杆菌能否产生白喉毒素；用豚鼠眼结膜角膜检测志贺菌的侵袭力；用家兔肠断结扎试验检测细菌肠毒素。,本实验室开展的检测技术,免疫学中麻疹、风疹IGM抗体检测人群抗体检测：完成健康人群麻疹IgG抗体检测、风疹IgG抗体检测、腮腺炎IgG抗体检测、白喉抗体检测、乙脑抗体检测、流脑抗体检测、脊髓灰质炎中和抗体检测 PCR检测、手足口、麻疹、风疹、流感细胞培养：流感病毒分离，通过血凝及血抑试验进行流感病毒株分型鉴定细菌培养：流脑、霍乱、致腹泻型细菌分离培养,总之，实验室在确认疫情性质、追踪传染病的来源、摸清潜在的传染源、为感染者寻找有效的治疗措施等方面发挥着重要的作用。,
