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1、胶原蛋白传统提取方法的问题国内外重组胶原蛋白概况,类人胶原蛋白研发背景,胶原蛋白传统提取方式和面临的问题,1 He|cke TGelatin，The food technologists friend or foeInternational Food Ingredients20001，6-8,类人胶原蛋白研发背景,FDA、欧盟对 动物源胶原蛋白医学应用的限制234,Cooperman, L. and Michaeli, D., 1984, The immunogenicity of injectable collagen. I. A 1-year prospective study. J Am
2、 Acad Dermatol, 10:638-646.Lee, C.H., Singla, A. and Lee, Y., 2001, Biomedical applications of collagen. Int J Pharm, 221:1-22.Olsen, D., Yang, C.L., Bodo, M., Chang, R., Leigh, S., Baez, J., Carmichael, D., Perl, M., Hmlinen, E.R., Jarvinen, M. and Polarek, J., 2003, Recombinant collagen and gelati
3、n for drug delivery. Adv Drug Deliv Rev, 55:1547-1567.,寻找一种安全、有效并具有良好生物功效的胶原蛋白类材料在组织工程、医药美容等领域受到越来越广泛的关注,国外重组胶原蛋白的研究现状,2000年Myllyharju J等人使用甲基酵母表达生产准人纤维胶原蛋白，型51998年Nokelainen M等用两种杆状病毒转染昆虫细胞生产类人特异性软骨胶原II型62001年Nokelainen M等使用四种人类基因报道了使用甲基酵母高水平表达I型前胶原7Uitto J等从人皮肤细胞体外培养中得到了，型前胶原8Vaughn PR等在啤酒酵母中表达出了携
4、带有羟基化片断的类人型胶原蛋白9,由于哺乳动物细胞和昆虫细胞培养成本高, 周期长,重组胶原蛋白表达量极低(1%左右)，培养只能限于实验规模, 不可能满足产业化、大批量的需求,5Myllyharju J，Nokelainen M，Vuorela人Kividkko KIExpression of recombinant human type I-III collagens in the yeast pichia pastorisBiochem Soc Trans200028(4)，353-76Nokelainen M，Tu H，VuorelaNotbohm H，Kivirikko KI,Mylly
5、harju JHigh-level production of human type I collagen in the yeast Pichia pastoris Yeast2001 J蚰3018(9)797-8067Nokelainen M，Helaakoski T，Myllyharju J，Notbohm H，Pihlajaniemi TFietzek PP，Kivirikko KIExpression and characterization of recombinant human type II collagens with low and high contents of hyd
6、roxylysine and its glycosylated formsMatrix Bi011998 Jan16(6)，329-388Uitto J，Booth BPolak KLCollagen biosynthesis by human skin fibroblasts II Isolation and further characterization of type I and type III procoUagens synthesized in cultureBiochim Biophys Acta1980 Aug 21624(2)，545619Vaughn PR，Galanis
7、 M，Richards KM，Tebb TA，Ramshaw JA，Werkmeister JAProduction of recombinant hydroxylated human type 1II collagen fragment inSaccharomyces cerevisiaeDNA Cell Bi011998 Jun17(6)，5118,中国巨子生物,率先实现重组胶原蛋白规模化生产的突破,科技部对类人胶原蛋白的评价,世界首创全球唯一国际领先,类人胶原蛋白的来源和制备类人胶原蛋白的创新性类人胶原蛋白的实验研究,类人胶原蛋白介绍,人胶原蛋白基因,原始菌(不具胶原合成能力),基因工程
8、菌的构建,反馈补料,压力脉冲,饥饿胁迫,定向调控,高密度发酵,离心除杂,除杂蛋白,除内毒素,类人胶原蛋白,蛋白质分离纯化,类人胶原蛋白的来源和制备,类人胶原蛋白的基本生物学功能,通过基因重组和生物工程技术得到的，一种水溶性高分子生物胶原蛋白在结构、特性方面与人类胶原蛋白极为相似，命名它为类人胶原蛋白,具备胶原蛋白基本生物学功能：生物相容性生物吸收性细胞粘附性促新细胞形成,ECM示意图,类人胶原蛋白的创新性,类人胶原蛋白的创新性,类人胶原蛋白的安全性评价实验,由“中国食品药品检定研究院”完成的生物学评价试验,植入实验评价:小鼠、家兔皮下植入，90天无不良反应,类人胶原蛋白透皮与吸收实验,小白鼠背
9、部去毛清洁后，涂抹荧光染料(tritc)标记过的明胶和类人胶原蛋白溶液；于4h，8h分别在涂抹试样区域取1cm2cm大小的皮肤，进行冰冻切片，采用荧光显微镜观察；结果表明：类人胶原蛋白具有较强的透皮吸收行为，而明胶的透皮吸收较差。14,14 The Transdermal Absorption Study of Human-Like Collagen. Advanced Materials Research, 415-417: 1781-1985,类人胶原蛋白促细胞生长实验,类人胶原蛋白促细胞生长实验,15程宁,范代娣 类人胶原蛋白对BHK-21细胞生长的影响，西北大学学报(自然科学版)， 3
10、5(5):581-584, 2005,结果显示：应用类人胶原蛋白溶液培养细胞，细胞数量有大幅度增加，细胞形态正常、透亮饱满。,类人胶原蛋白细胞亲和性实验,结果显示：14天时成纤维细胞大量贴附在类人胶原蛋白海绵表面，且生长良好。反映了类人胶原蛋白具有良好的细胞亲和性和相容性。,类人胶原蛋白海绵表面2BS培养14天后扫描电镜观察,15程宁,范代娣 类人胶原蛋白对BHK-21细胞生长的影响，西北大学学报(自然科学版)， 35(5):581-584, 2005,类人胶原蛋白组织相容性实验,试验方法：将类人胶原蛋白海绵、动物胶原蛋白海绵和可吸收明胶海绵分别植入兔子肝脏，4周后开腹观察植入处的肝组织。,1
11、6类人胶原蛋白生物相容性实验研究西北大学学报（自然科学版）2004年2月第32卷第1期 作者：西北大学 范代娣，米钰，惠俊峰等,类人胶原蛋白细胞核形态正常,明胶海绵细胞核皱缩,动物胶原海绵细胞核皱缩变形,类人胶原蛋白组织相容性实验,结果表明：明胶海绵和动物胶原蛋白海绵植入处造成细胞形态和数量改变，组织肿胀，大量炎性细胞浸润类人胶原蛋白海绵对植入处肝细胞形态几乎不造成影响，细胞器的形态较好；组织相容性好，优于供试的其他产品,类人胶原蛋白植入处组织形态正常少量炎性细胞浸润,明胶海绵植入处大量炎性细胞浸润组织增生，细胞肿胀,动物胶原海绵植入处大量炎性细胞浸润组织增生，细胞肿胀,16类人胶原蛋白生物相
12、容性实验研究西北大学学报（自然科学版）2004年2月第32卷第1期 作者：西北大学 范代娣，米钰，惠俊峰等,皮肤美容止血材料骨修复材料人工血管皮下注射填充,类人胶原蛋白的应用,类人胶原蛋白在皮肤美容领域的应用,皮肤美容:眼膜、面膜、喷雾、原液等系列；用于衰老性肌肤紧致抗衰；日常的肌肤养护；皮炎、痤疮、敏感肌肤等问题肌肤的修护。,真正不含防腐剂,类人胶原蛋白在皮肤美容领域的应用,类人胶原蛋白在医学领域的应用研究,可降解止血海绵:主要用于腔内、颅内的外科手术止血,可降解止血海绵:主要用于腔内、颅内的外科手术止血,马茂，范代娣 壳聚糖-类人胶原蛋白对兔肝创面的止血效果及组织相容性观察，第四军医大学学
13、报，2007，28(12):1122-1124,专利成果：一种可生物降解止血海绵材料及其制备方法。专利号：ZL2006 1 0041913.3一种规模制备类人胶原蛋白止血海绵的方法。申请号：200910218514.3,类人胶原蛋白在医学领域的应用研究,骨修复材料:仿生矿化，制备骨修复材料，用于骨缺损的修复,类人胶原蛋白在医学领域的应用研究,类人胶原蛋白在医学领域的应用研究,人工血管：模拟人体血管结构，仿生制备，用于血管修复,类人胶原蛋白在医学领域的应用研究,注射填充水凝胶,应用领域采用皮下注射或填充，可用于去皱、丰唇、面部矫形、凹陷填充等。,产品特点生物相容性优异；降解时间可控；产品可促进注
14、射部位细胞活性和胶原蛋白纤维的再生,研发团队研发成果产业化之路,类人胶原蛋白的科研和产业化,类人胶原蛋白的研发团队,范代娣：新世纪“百千万人才工程”国家人选获“中国青年女科学家”提名享受“国务院特殊津贴”博士生导师研发团队：博士研究生20余人硕士研究生50余人,类人胶原蛋白的专业水准,Xiaoxuan Ma, Daidi Fan, Long-an Shang, Qiang Cai, Lei Chi, Chenhui Zhu, Yu Mi, Yan-e Luo. Oxygen transfer rate control in the production of human-like collag
15、en by recombinant Escherichia coil. Biotechnology and Biochemistry. 2010,55,4：169-174 (SCI)Wenjiao Xue, Daidi Fan, Longan Shang. Effects of acetic acid and its assimilation in fed-batch cultures of recombinant Escherichia coli containing human-like collagen cDNA. Journal of Bioscience and Bioenginee
16、ring. 2010.109（3）：257-261 (SCI)Xiao-Jun Wang, Dai-Di Fan, Yan-E Luo. Breakthrough Model of Recombinant Human-Like collagen in Immobilized Metal Affinity Chromatography. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2009, 158(2),262-276. (SCI)Wen J Xue, Dai D Fan, Longan Shang, Chen H Zhu, Xiao X Ma, Yuan
17、Y Yu. Production of biomass and recombinant human-like collagen in Escherichia coli processes with different CO2 pulses. Biotechnology Letters. 2009, 31: 221-226. (SCI)Dai D. Fan，L.-H. Wang，L.-A. Shang et al. A Microcalorimetric Method for Studying the Biological Effects of Mg2+ Ion on Recombinant E
18、scherichia coli. Chemical Biochemical Engineering, 2008, 22(3): 363-368. (SCI)DAI D FAN, LI H WANG, LONG A SHANG, HUI J SHI, XIAO X MA, YU MI, LI F GU, KANG Z XU. A microcalorimetric method to study the effect of kanamycin on the metabolism of recombinant Escherichia coli Chemical Engineering Commun
19、ications, 2007，194:1127-1137. (SCI)Yan E Luo, Dai D Fan, Long A Shang, Hui J Shi, Xiao X Ma, Yu Mi, Gui F Zhao. Analysis of metabolic flux in Escherichia coli expressing human-like collagen in fed-batch culture, Biotechnology letters, 30(4): 637-643, 2008. (SCI, EI)Dai D Fan, Yane Luo, Yu Mi, Xiao X
20、 Ma, Longan Shang. Characteristics of fed-batch cultures of recombinant Escherichia coli containing human-like collagen cDNA at different specific growth rates. Biotechnology Letters, 2005, 27: 865870. (SCI, EI)LUO Yane, FAN Daidi, MA Xiaoxuan, WANG Dewei, MI Yu, HUA Xiufu and LI Wenhong. Process Co
21、ntrol for Production of Human-like Collagen in Fed-batch Culture of Escherichia coli BL 21. Chinese J. Chem. Eng., 2005, 13(2):276-279. (SCI, EI)HUA Xiufu, FAN Daidi, LUO Yane, HANG X I, SHI Huijuan, MI Yu, MA Xiaoxuan, SHANG Longan, ZHAO Guifang. Kinetics of High Cell Density Fed-batch Culture of R
22、ecombinant Escherichia coli Producing Human-like Collagen. Chinese J. Chem. Eng., 2006, 14(2): 242-247. (SCI, EI),60余篇SCI文献报道,类人胶原蛋白的专业水准,国家自然科学基金：工程控制策略有效解除大肠杆菌培养过程中乙酸抑制机理探索（21076169）国家自然科学基金：周期性饥饿协迫对重组大肠杆菌高密度培养的影响（31000019）国家自然科学基金：重组类人胶原蛋白大肠杆菌表达体系高密度发酵的代谢调控及动力学（20606026）国家自然科学基金：重组E. coli类人胶原蛋白表达
23、体系多聚体现象研究(20476085)国家高技术产业化示范工程发展计划：基因工程技术生产类人胶原蛋白生物材料高技术产业化示范工程发改高计(2004)2563国家科技部863计划：重组类人胶原蛋白可降解材料制造关键技术及应用(2006AA02Z246)国家科技部创新基金：重组基因工程菌生产类胶原蛋白(01C26216110599)国家火炬计划：类人胶原蛋白(2002EB021307）利用重组类人胶原矿化仿生制备骨修复材料及应用(2007AA03Z456)类人胶原蛋白人工血管体外构建过程的工程学（20776119）新型有机无机杂化纳米生物功能材料复合制备及控制机理（21006079）,13项国家级
24、科研项目,类人胶原蛋白的专业水准,一种类人胶原蛋白及其生产方法。专利号：ZL 01 1 06757.8胶原蛋白敷料。专利号：ZL 2011 2 0413968.9一种可生物降解止血海绵材料及其制备方法。专利号：ZL2006 1 0041913.3一种制备可生物降解的组织工程用支架材料的方法。专利号：ZL2006 1 0041912.9一种制备可生物降解的组织工程用血管内层支架材料的方法。专利号：ZL 2009 1 0022613.4一种制备可生物降解的组织工程用血管中间层支架材料的方法。专利号：ZL 2009 1 0022614.9一种提纯橄榄多酚初品中酪醇的方法。专利号：ZL 2009 1
25、0022997.X一种双歧杆菌微胶囊及其制备方法。专利号：ZL 2011 1 0147416.2一种胶原蛋白滴眼液及其制备方法。专利号：ZL 2011 1 0147418.1一种胶原蛋白温敏型水凝胶及其制备方法。专利号：ZL 2011 1 0147417.7一种制备可生物降解组织工程用仿生人工骨材料的方法。申请号：200910023001.7一种制备可生物降解的组织工程用血管外层支架材料的方法。申请号：200910022612.X,21项国家发明专利,类人胶原蛋白的产业化之路,可复美“II类医疗器械”上市第9次获国家自然科学基金支持,1999-2001,2003-2005,2006-2009,2011,国家5部委授“国家重点新产品”科技部火炬计划、中小企业创新基金项目发改委高技术产业化示范工程项目项目，建设生产研发基地,2次纳入科技部“863”计划GMP建厂，可丽金上市SFDA的注册申报可复美,范代娣博士从MIT归国开始研究类人胶原蛋白实验室研发取得突破成立西安巨子，申请国家发明专利,类人胶原蛋白的产业化之路,THE ENDTHANKS!,
