抗肿瘤药物体内筛选试验标准操作作业规程SOP.doc

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1、抗肿瘤药物体内筛选试验标准操作作业规程SOP抗肿瘤药物体内筛选标准操作规程概述：抗肿瘤药物是指能够直接杀伤或抑制肿瘤细胞生长或增殖的一类药物，作用机制包括抑制肿瘤细胞核酸或蛋白质的合成、干扰大分子物质代谢、干扰微管系统、抑制拓扑异构酶等。 本操作规程包括与抗肿瘤药物申请临床试验和申请上市有关的非临床有效性和安全性研究的内容，其中着力强调非临床有效性和安全性之间的关联性，以及非临床研究和临床试验之间的关联性。旨在一方面为抗肿瘤药物的非临床研究提供技术参考；另一方面，通过技术要求引导科学有序的研发过程，使国内此类药物的研发更趋规范和合理。 本操作规程仅代表目前对抗肿瘤药物非临床研究的一般性认识。具

2、体药物的非临床研究应在本指导原则的基础上，根据药物的自身特点制订研究方案。研究目的：建立一套包括抗肿瘤药物体内作用的药效学研究和评价体系及相应的标准操作规程以及抗肿瘤药物安全性和作用新机制的研究。 有效性研究抗肿瘤药物有效性研究的目的主要在于探索受试物的作用机制、作用强度、抗瘤谱等，为之后的安全性评价以及临床试验中适应症、给药方案的选择提参考信息。 安全性评价安全性评价的目的主要包括：（1）估算 I 期临床试验的起始剂量；（2）预测药物的毒性靶器官或靶组织；（3）预测药物毒性的性质、程度和可逆性；（4）为临床试验方案的制订提供参考。研究计划：(a)小鼠急性毒性测试 按照急性毒性测试的常规方法，

3、选用昆明种小鼠，通过腹腔注射方式给药，测定体外抗肿瘤活性突出的化合物的半数致死量（LD50），参考给药小鼠体重变化情况，评价化合物的急性毒性，并确定小鼠体内抗肿瘤活性测试的给药剂量。(b)小鼠体内抗肿瘤活性测试 根据动物体内抗肿瘤活性测试的标准方法，选用昆明种小鼠，皮下接种肉瘤S180或肺癌H22瘤株，选择体外活性突出且急性毒性较低的化合物，设定合适的剂量通过腹腔注射方式给药，以临床常用抗肿瘤药物环磷酰胺作为阳性对照药物，测定肿瘤生长抑制作为体内活性评价指标。(c)专利保护范围内的化合物的继续合成申请保护范围较大的专利，合成部分可能具有良好活性的新的化合物，拓展研究范围，发现活性更强的化合物，

4、并申请新的发明专利。并可针对具体化合物申请从属专利，延长高活性化合物的保护期限。（d）体外抗肿瘤活性的广泛筛选 采用MTT法或台盼蓝染色法，测定化合物对多种人肿瘤细胞株的增殖抑制活性，确定化合物在不同瘤株间抗肿瘤活性的选择性，为裸鼠模型实验提供依据。（e）抗肿瘤作用机理的深入研究 根据抗肿瘤（f）人癌裸鼠移植瘤模型实验活性化合物作用机理特征，选用微管蛋白聚合等实验从分子水平确认化合物的作用机理；利用人脐静脉血管内皮细胞探讨化合物对内皮细胞骨架的影响及诱导凋亡的途经，从细胞水平上阐明化合物的作用机理。 根据抗肿瘤新药审批办法的要求，采用裸小鼠皮下接种模型和/或原位移植瘤模型，以相对肿瘤增值率和生

5、存时间为指标，确定化合物的抗肿瘤活性。（g）动物体内药物代谢动力学实验 选择在人癌裸鼠移植瘤模型实验中活性良好的化合物，开展动物体内药物代谢动力学实验，考查化合物的吸收、分布、代谢、排泄性质。（h）动物亚急性，长毒实验 根据抗肿瘤新药审批办法的要求，测定动物亚急性、长毒性质，进行药物安全性评价。基本方法：小白鼠的灌胃法 以左手捉持小白鼠，使腹部朝上，右手持灌胃器。灌胃器先从小白鼠口角插入口腔内，然后沿着上颚壁轻轻插入食管，稍感有阻力时（大约灌胃管插入1/2，相当于食管过膈肌的部位），即可推进注射器，进行灌胃（图1）。若注射器推进困难，应重插。若灌胃器误插入气管给药，可致小白鼠死亡。注药后轻轻抽

6、出灌胃管。 小白鼠皮下注射法 通常在其背部皮下注射。将其皮肤拉起，注射针刺入皮下，把针尖轻轻左右摆动，易摆动表示已刺入皮下，然后注射药液。拔针时，以手指捏住针刺部位，以防止药液外漏（图2）。小白鼠静脉注射法 一般采用尾静脉注射法。事先将小白鼠或大白鼠置于固定的筒内或铁丝罩内，或扣于烧杯内，使其尾巴露出（图3）。将尾置于45-50的温水中浸泡或用75%的酒精棉球擦之，以使血管扩张。然后，选择尾巴左、右两侧静脉进行注射。注射时若出现隆起的白色皮丘，说明药物未注入血管。这时，注射器应向尾根部位移动，重新注射。图3小白鼠尾静脉注射法小白鼠腹腔注射法以左手捉持小白鼠，让其腹部向上，右手将注射器针头刺入皮

7、肤，刺入部位距离下腹部腹白线稍向左或右的位置（图4）。向前推进注射器3-5mm,，接着使注射针与腹部皮肤面呈45刺入小白鼠的腹肌，继续向前刺入，针头通过腹肌进入腹腔后阻力消失，这时即可慢慢注入药液。实验动物的标记实验用较大动物如兔、猫、犬等可用特制的号码牌固定于耳上。白色家兔和小鼠、大鼠,可用黄色苦味酸（3%-5%）涂于毛上标号。其编号方法无统一规定，以下方法可供参考。如给小鼠标记1-10号，可将小鼠背部分前肢、腰部、后肢，按左、中、右分为九个区,从右到左标记1-9号，第10号不标记（图5a）。如给小鼠标记1-20号，则（图b）。1号右前肢 11号腰部及右前肢2号左前肢 12号腰部及左前肢3号

8、左后肢 13号腰部及左后肢4号右后肢 14号腰部及右后肢5号头部 15号腰部及头部6号头部及右前肢 16号腰、头部及右前肢7号头部及左前肢 17号腰、头部及左前肢8号头部及左后肢 18号腰、头部及左后肢9号头部及右后肢 19号腰、头部及右后肢10号腰部（背中间 20号尾根部、大鼠皮毛标记编号法(a) 小鼠急性毒性测试目的：测定LD50了解受试物的毒性强度、性质和可能的靶器官，为进一步进行毒性试验的剂量和毒性观察指标的选择提供依据，并根据LD50进行毒性分级。结果判定：如LD50小于人的可能摄入量的100倍，则放弃该受试物。如LD50大于或等于100倍者，则可考虑进入下一阶段毒理学试验。 如动物

9、未出现死亡的剂量大于或等于10g/kg BW（涵盖人体推荐量的100倍），则可进入下一阶段毒理学试验。 对人的可能摄入量较大和其它一些特殊原料，按最大耐受量法给予最大剂量动物未出现死亡，也可进入下一阶段毒理学试验。范围：本方法规定了急性毒性试验的基本技术要求。术语和定义：下列术语和定义适用于本方法。半数致死量（LD50）是经口给予受试物后，预期能够引起动物死亡率为50%的单一受试物剂量，该剂量为经过统计得出的估计值。其单位是每公斤体重所摄入受试物质的毫克数、克数或毫升数，即mg/kg BW、g/kg BW 、mL/kg BW。最大耐受剂量法(MTD)：用最大使用浓度和最大灌胃容量给予20只动物

10、后，连续观察7-14天，未见任何动物死亡，则MTD大于*g/kg BW。原理经口一次性给予或24h内多次给予受试物后，在短时间内观察动物所产生的毒性反应，包括致死的和非致死的指标参数，致死剂量通常用半数致死剂量LD50来表示。实验动物一般均分别用两种性别的成年小鼠或大鼠。小鼠体重为18-22g，大鼠体重为180-220g。如对受试物的毒性已有所了解，还应选择对其敏感的动物进行试验，如对黄曲霉素选择雏鸭。动物购买后适应环境3-5天。操作步骤受试物的处理：受试物应溶解或悬浮于适宜的介质中。一般采用水或食用植物油作溶剂，可以考虑用羧甲基纤维素、明胶、淀粉等配成混悬液；不能配制成混悬液时，可配制成其它

11、形式（如糊状物等）。必要时可采用二甲基亚砜。但不能采用具有明显毒性的有机化学溶剂。如采用有毒性的溶剂应单设溶剂对照组观察。受试物的给予途径：经口。试验前空腹：动物应隔夜空腹（一般禁食16h左右，不限制饮水）。容量：各剂量组的灌胃容量相同（ml/kg BW），小鼠常用容量为20 mL/kg BW；大鼠常用容量为10ml/kg BW。 方式：一般一次性给予受试物。也可一日内多次给予（每次间隔4-6h，24内不超过3次，尽可能达到最大剂量，合并作为一次剂量计算）。常用的急性毒性试验设计方法霍恩氏（Horn）法预试验：可根据受试物的性质和已知资料，选用下述方法：、1和10g/kg BW的剂量，各以2-

12、3只动物预试。根据24内死亡情况，估计LD50的可能范围，确定正式试验的剂量。也可简单地采用一个剂量，如215mg/kg BW，用5只动物预试。观察24h内动物的中毒表现。如症状严重，估计多数动物可能死亡，即可采用低于215mg/kg BW的剂量系列，反之症状较轻，则可采用高于此剂量的剂量系列。如有相应的文献资料时可不进行预试。动物数：一般每组用5只。常用剂量系列： 10t t=0,1, 2, 310t t=0,1, 2, 3为小，所以结果较为精确。一般试验时，可根据上述剂量系列设计)个组，即较原来的方法在最低剂量组以下或最高剂量组以上各增设一组，这样在查表时容易得出结果。 正式试验：将动物在

13、实验动物房饲养观察3-5天，使其适应环境，证明其确系健康动物后，进行随机分组。给予受试物后一般观察7或14天，若给予后的第4天继续有死亡时，需观察14天，必要时延长到28天。记录死亡数，查表求得LD50，并记录死亡时间及中毒表现等。 该方法的优缺点：优点是简单易行，节省动物；缺点是所得LD50的可信限范围较大，不够精确。但经多年来的实际应用与验证，同一受试物与寇氏法所得结果极为相近。因此对其测定的结果应认为是可信与有效的。 最大耐受量试验：适宜条件：有关资料显示毒性极小的或未显示毒性的受试物，给予动物最大使用浓度和最大灌胃容量的受试物时，仍不出现死亡。 动物：至少雌、雄各10只。剂量：受试物最

14、大使用浓度和灌胃容量（一个剂量组）。方法：动物购买后观察3-5天，给予最大使用浓度和最大灌胃容量的受试物（一日内1次或多次给予，一日内最多不超过3次），连续观察7-14天，动物不出现死亡，则认为受试物对某种动物的经口急性毒性剂量大于某一数值（g/kg BW）。最大灌胃容量小鼠为20 mL/kg BW，大鼠为20 mL/kg BW。(b) 小鼠体内抗肿瘤活性测试体内试验用于确认受试物对特定类型肿瘤细胞的杀伤或抑制作用，探索受试物产生药效作用的给药剂量、途径、频率、周期等。 体内试验通常采用动物肿瘤移植模型和人癌移植模型。 由于动物肿瘤移植模型与临床疗效之间的相关性不强，仅可用于侯选化合物的初步筛

15、选。通常情况下，以人癌移植模型试验结果来评价抗肿瘤药物的有效性。1、 模型建立细胞毒类抗肿瘤药物临床前体内试验一般至少应选用 6 种人癌移植瘤模型，其中应包括 II期临床试验中拟筛选的肿瘤组织类型。模型的建立和使用应注意： 移植瘤复苏后一般应传 2-3 代后再用于体内抗肿瘤试验；为了保持移植瘤的生物学特性和遗传特性，复苏后移植瘤体内传代应少于15-20 代。2、 试验设计肿瘤移植部位主要在皮下，也包括腹腔、肾囊下和原位等。通常待移植肿瘤生长至100-300mm3后将动物随机分组给药。 一般包括高、中、低 3个剂量的治疗组、阳性对照组和阴性对照组。治疗组受试物剂量的选择应能够体现出药物的量效关系

16、， 高剂量不宜超过受试物的最大耐受剂量。 应根据受试物的药动学特点和毒性反应等确定给药频率和周期；给药途径应尽量与推荐临床用药的途径相同。阳性对照药一般应满足以下条件：（1）与受试物作用机制相同或相近；（2）对移植肿瘤敏感；（3）临床广泛应用且疗效确切。阳性对照药的给药方案应能够体现出药物的最佳治疗作用，其剂量一般不宜超过最大耐受剂量。阴性对照组给予相应的溶剂。 3、检测指标 推荐使用测量瘤径的方法，动态观察受试物的抗肿瘤效应。肿瘤直径的测量次数根据移植瘤的生长情况而定，一般为每周 2-3次。在试验中还应该观测与药物安全性有关的指标，如动物体重增长和死亡率，将治疗组的这些数据与标准治疗对照组进

17、行比较，对于判断药物的安全性和开发前景具有重要的意义。 试验中应记录检测指标的变化与给药时间的关系，以便了解药物的作用特点，减少单次记录试验结果可能引起的误差。体内抗肿瘤试验结果中还应同时附有相应的照片。4、评价标准 对于体内试验结果的评价应综合考虑受试物的作用机制、模型的临床相关性、 每一种模型的具体试验结果以及受试物与阳性对照药物试验结果的比较。 针对每一种人癌移植瘤模型， 推荐采用相对肿瘤增殖率T/C （%）作为试验评价指标，评价标准通常为：T/C（%）40 %为无效；T/C（%） 40%，并经统计学处理 P 为有效。在体内有效性试验采用的全部人癌移植模型中，一般至少应有1/3 达到有效

18、标准，才提示药物有必要进入临床试验。在评价时还应关注受试物与阳性对照药试验结果的比较。在毒性相当（在有效性研究中主要表现为动物体重下降相当）的情况下，对受试物治疗组和阳性对照药组肿瘤增殖率的比较也是评价受试物是否有必要进入临床试验的指标之一。附：相对肿瘤增殖率T/C（%） ：针对每一种人癌移植瘤模型的抗肿瘤活性评价指标。计算公式如下：T/C % = TRTV / CRTV*100%。（TRTV：治疗组RTV ；CRTV：阴性对照组RTV）。 肿瘤体积(tumor volume,TV)的计算公式为：V = 1/2ab2 或/6abc。其中a、b、c分别表示长宽高。由于此两公式的相关性极好，可采用

19、任一公式。根据测量的结果计算出相对肿瘤体积（relative tumor volume，RTV） ，计算公式为： RTV = Vt / V0。其中V0为分笼给药时(即d0)测量所得肿瘤体积，Vt为每一次测量时的肿瘤体积。鼠S180移植瘤的抑制作用实验1 材料与方法 材料 实验用药物 动物及瘤株肉瘤S180；实验用昆明小鼠18-22 g。 仪器设备灌胃器、手术器械、天平、离心机 方法 肿瘤模型建立小鼠S180细胞接种于昆明种小鼠腹腔后，取腹水传代保存。取腹水传代第7日荷瘤小鼠，脱颈椎处死小鼠，消毒腹部皮肤，无菌注射器吸取乳白色腹水，用生理盐水调整肿瘤细胞浓度为1107 /mL，用酒精棉球消毒昆明

20、种小鼠右侧腋下皮肤，于皮下接种上述瘤细胞悬液（ mL/只），常规饲养。 药物对小鼠S180的抑制作用昆明种小鼠50只，腋下接瘤，次日将荷瘤小鼠随机分为5组，每组10只。分别为模型组、环磷酰胺（CTX）组、药物高、中、低剂量组。干后,称取瘤重，计算抑瘤率：小鼠接瘤后第二日开始按表1所示剂量和方式给药，CTX组于接瘤后第2日给药，隔天一次，药物组每日给药一次，连续10天， ml/20g体重。末次给药24小时后，脱颈椎处死小鼠，剥取瘤组织,去除血污、脂肪等非肿瘤组织，用滤纸吸抑瘤率%=（1给药组平均瘤重/ 对照组平均瘤重）100 %表1 荷瘤小鼠给药剂量和方式组别剂量（mg/kg B.W.）给药方式

21、模型CTX20腹腔注射药物高灌胃中灌胃低灌胃 对荷瘤小鼠免疫器官的影响动物接种S180瘤株为第0天，第1天开始灌胃，连续灌胃10天 ，第11天处死动物，准确称量动物体重、胸腺重量、脾脏重量，计算胸腺指数和脾脏指数，脏器指数= 脏器重量/体重。表2 药物对免疫指数的影响(s)组别剂量(mg/kg B.W.)动物数（n）胸腺指数（110-3）脾指数（110-3）空白对照10CTX20 i.p.10药物101010取部分瘤组织用10中性甲醛固定，石蜡包埋，切片，经苏木精伊红染色，光镜观察。 实验步骤固定液、染色液的配置固定液： (1)10%中性福尔马林（） 甲醛 100 ml NaH2PO4H2O

22、4 g Na2HPO4 13 g 蒸馏水 900 ml(2) Harris苏木素: 配方： 苏木素 1 g 无水乙醇 10 ml 蒸馏水 200 ml 钾明矾 20 g HgO g 先将苏木素溶于无水乙醇中，备用。把明矾放入蒸馏水，加热溶解，再加入备用的苏木素，煮沸 2 分钟，先加入少量的氧化汞，防止氧化过程中苏木素外溢，玻棒搅拌，然后，边搅拌边加入氧化汞。加完后，立即移至冰水中，加速其冷却，静置一夜后，过滤。用前以 5% 的比例加入冰醋酸。 (3)伊红（醇溶性） 配方： 伊红 （醇溶性） 75%酒精 1000 ml 加几滴冰醋酸至半透明状。 伊红有水溶的和醇溶的，如果用的是水溶的，应该在脱水

23、前进行染色，如果是醇溶的，应使用与溶解伊红等浓度的酒精开始脱水。(4)盐酸酒精分化液： 浓盐酸1 ml 75%酒精99 ml(5) 蛋白甘油： 蛋白甘油是粘贴蜡片用的粘片剂。配方如下：取一新鲜鸡蛋的蛋白，充分搅拌成雪花状泡沫，然后滤去泡沫，加入等量甘油，搅拌均匀，再加入一小粒麝香草酚防腐。实验用具：解剖器一套、单面刀片、切片刀、切片机、载玻片、盖玻片、标本瓶、烧杯、量筒、漏斗、染色缸、树胶瓶、酒精灯、毛笔、绘图纸、滤纸、熔蜡箱（或恒温箱）、展片台（或烫板）、小木块、蜡带盒、烤片盒、切片托盘。病理标本的采集和制作(l)取材脱颈椎处死小鼠，剥取瘤组织,去除血污、脂肪等非肿瘤组织。(2)固定与修块迅

24、速将胰腺放入4%中性甲醛(用PH )中固定48小时，组织块的直径应小于7mm。(3)脱水与透明在以下过程，要求经常晃动组织块，以保证组织块可以充分地与乙醇或二甲苯接触，在每一步骤之后，要充分滤干组织块，一般用筒纸吸干组织块上的液体，以免影响其他液体的浓度，但要防止组织块干燥。（270min）。175%乙醇 50min285%乙醇 50min395%乙醇 （I） 30min495%乙醇 （II） 30min5100%乙醇（I） 30min6100%乙醇（II） 30min 7 1/2 二甲苯（乙醇与二甲苯等体积） 20min8二甲苯（I） 20min9二甲苯（II） 10min（可依据透明效果而

25、定） 透明效果的判断：如组织块颜色加深透明，二甲苯溶液颜色透明，即表明脱水效果很好；如脱水不好，二甲苯溶液颜色会变混浊。使用过的酒精或二甲苯倒入烧杯里以便回收。(4)浸蜡、包埋与修蜡块1浸蜡：可在脱水与透明进行时，将60恒温箱打开，使大烧杯内的石蜡充分溶解，待脱水与透明结束后，可将脱水篮整个或包裹在纱布内的组织块转入充分溶解的石蜡里，于60恒温箱放置120分钟。 2包埋：包埋有多种器具，比较简洁廉价的方法是采用纸盒。可在浸蜡的同时将纸盒做好，包埋时将60的石蜡倒入纸盒内，然后用小镊子将各组织块按一定的顺序排列好，使切面朝下。我们建议，不同组别的同一组织包埋于一个蜡块中，以保证切片和染色条件一致

26、，且以便读片和比较。为防止倒入纸盒内的石蜡底部立刻凝固，可将纸盒置于一玻璃板上（或大培养皿内），然后将玻璃板置于80-90左右热水上，包埋时蜡盒底部要放平，做蜡块的蜡要反复冻融较好。组织包埋方法可参见表2。3修蜡块：待纸盒内蜡凝固后(若需要使蜡块迅速凝固，可将包埋好的蜡块置于4冰水混和物中)。将蜡块取出，用刀片将其修成梯形，通常蜡块大小视组织多少而定，为保证切片顺利，组织块与蜡块边缘之间的距离不得小于2mm。修剪下来的残蜡应回收，以便再用。(5)切片在载玻片上擦少量甘油蛋白。可滴半滴甘油蛋白于载玻片上，用手指充分抹匀，呈半干状为佳。切片厚约48m，通常厚约6m，细胞小而密的组织如胸腺，可以切4

27、5m，而细胞疏的组织，如下丘脑可切10m。将切片在55左右水浴中展开，展开程度以带黄颜色的组织完全摊平为准。用涂有甘油蛋白的载玻片从水浴中捞取切片，斜放在木架上，立即放入37烘箱中过夜，一般时间越长效果越好，以切片紧贴于载玻片上呈半透明状为佳。每个组织块捞片2张。过夜后，将载玻片置于玻片架上，进行下面的实验。(6)脱蜡、染色与脱水取出玻片架后，应将玻片架倾斜，以使载玻片上的试剂流尽，然后用筒纸将玻片架和载玻片下缘的试剂吸干，以免影响其他试剂的浓度。全过程约需要50min。1脱蜡到水（1）二甲苯（I） 15分钟（2）二甲苯（II） 15分钟（3）100%乙醇 2分钟（4）95%乙醇（I） 1分钟

28、（5）95%乙醇（II） 1分钟（6）蒸馏水浸洗 1分钟2染色（7）苏木精 30秒钟（8）自来水冲洗1分钟，但应注意不能用水直接冲在玻片上，以免冲走切片。（显微镜下观察效果）（9）伊红（着色即可） 10秒钟（10）蒸馏水浸洗 1分钟3脱水（10）95%乙醇（I）1分钟（11）95%乙醇（II） 1分钟（12）100%乙醇 2分钟（13）二甲苯（I） 2分钟（14）二甲苯（II） 35分钟(7)封片将载玻片从玻片架上取下，滴加12滴中性树胶，用眼科镊夹住盖玻片的一角，轻轻盖上盖玻片，让中性树胶沿着盖玻片充分展开，之后倾斜载玻片，用筒纸将多余的中性树胶吸干，同时注意避免有气泡的产生，平放载玻片，室

29、温下长期保存。 数据处理所有实验设3个平行组或重复3次，结果以s表示，用SPSS 。注意事项关于腹水传代，观察到第一代的种鼠肚子较大后（一般约8-9天左右），可以传代，传代时取1ml注射器，用2ml注射器的针头，种鼠腹部消毒后直接将针头插入抽取 腹水即可，注意不要把针头插得很深，尽量浅一点，还可以把老鼠拎起来，利用重力，让腹水集中在某处便于抽取，不用离心，直接 用PBS 3-6倍稀释后，接种到新的老鼠腹腔，腹水颜色为白色或者略有发黄都是正常的，但是血性腹水说明不好，需要注意调整，第二代以后，尽量6-7天的时候传代，不要等的时间太久，否则腹水容易血性。三代后可用于试验。关于接种进行试验，这个时候

30、抽取的腹水需要量比较多，一般需要处死种鼠后，小心地用消毒眼科剪刀镊子剥开腹部皮肤，注意不要弄破肌肉，然后，用镊子拎起腹部的肌肉，用剪刀剪开一个小口，然后用玻璃滴管或者去掉针头的注射器吸取腹水。稀释后，接种到小鼠的 腋下。关于稀释量，最好摸索一下，开始的时候可以适当的计数，污染。但是要用台盼兰染色后计活细胞数。接种部位在小鼠腋下，但是不要 深入到腋窝里面，会给以后的操作带来麻烦。接种时的进针处离接种处远一点，让针头在皮下多走一段，不容易细胞接种量控制在1106 /只时，小鼠腹水出现情况一般如下：56 d出现腹水，79 d抽取传代最好，1012 d出现血性腹水，1415 d小鼠开始死亡。如果动物固

31、定不佳, 注射肿瘤细胞时针头在皮下来回游动, 结果是肿瘤长成后不能成为一个球形或半球形, 而是成为有几个小瘤体组成的长条或者不规则形状。关于观测指标，主要是按时称体重，试验结束后剥取肿瘤称瘤重。因为出瘤已经是接种后的第6天左右了，第10天就结束时间，瘤体积的数据意义就不大。按照SFDA的规定，平均瘤重小于1g，或者 单个瘤重小于200mg，认为肿瘤生长不良，试验作废。（d）体外实验法：用培养的肿瘤细胞系进行。体外试验主要用于对候选化合物进行筛选， 初步了解受试物的作用机制、敏感肿瘤类型和作用强度， 为随后进行的体内试验提供参考。在体外培养的不同人肿瘤细胞系中加入不同浓度的待测药物， 采用磺酰罗

32、丹明染色法（SRB法） 、四氮唑盐还原法、集落形成法等方法进行检测，计算药物的半数抑制浓度（IC50） ，并与标准治疗药物进行比较，可以初步预测抗肿瘤药物的抗瘤谱和作用强度。应根据化合物的结构特点和作用机理确定体外试验采用的研究方法。 例如，以线粒体为作用靶点的药物不宜采用四氮唑盐还原法。试验中，在选择肿瘤细胞系时应考虑到细胞的生长和增殖速率，一般至少应选用 12 种人癌细胞系。药物与细胞共培养的时间一般为4872 小时，贴壁细胞需先贴壁 24 小时后再给药。试验应设阳性及阴性对照组，阳性对照为标准抗肿瘤药，阴性对照为溶媒对照。试验至少应重复一次。1、噻唑蓝（MTT）法 在培养的活细胞线粒体中

33、与NADP相关的脱氢酶可将黄色的四氮唑（MTT）催化成不溶性的蓝紫色的甲替，将甲替用二甲基亚砜（DMSO）溶解后，利用酶标仪（试验波长570nm，参比波长450nm）测定光密度值，按照公式 实验组光密度值肿瘤细胞生长抑制率（%）=（1 ）100% 对照组光密度值计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率。用系列浓度的药物可制作肿瘤细胞生长抑制率的量效曲线。2、染料排斥法 本方法是根据活细胞具有排斥某些染料的功能，而死细胞因胞膜破坏而易于被染料着色的原理，在培养的对数生长期的细胞悬液中加入伊红、台盼蓝、或苯胺黑等染料，在室温下放置5分钟后，在15分钟用血球计数板计数200个细胞。根据公式未染细胞数活细胞率（

34、%）= 100% 细胞总数3、生长曲线法 本方法是根据肿瘤的Gompertzian生长曲线而设计。培养的肿瘤细胞在初期为指数增殖期，随着细胞密度的增加，因代谢产物的积聚和营养物质的消耗，增殖趋于减缓乃至停止，进入所谓的平台期。在培养后的的即刻、1、2、3、4、5、7天的细胞，用台盼蓝染色，细胞计数，然后取细胞对数对培养时间作图可获细胞生长曲线。1）将生长曲线外延至Y轴可获得截距No，用公式计算药物对增殖细胞的杀伤力（No是对照组的的截距）2）用Nt代表接种后t小时的细胞数， 用公式TD = / logNt - LogNo 计算药物对细胞增增时间（TD）的影响。3）取平台期每毫升的细胞均数，比较

35、细胞生长的饱合密度（Ns）。4、集落形成法 本方法利用分裂6代以上的克隆原单细胞子细胞可形成集落成簇（每簇细胞数50）的能力，比较药物对单个肿瘤细胞增殖能力的影响。本方法有贴壁法和半固体培养法两种。1）贴壁法 需要选用贴壁生长的细胞， 按500细胞/ml的浓度接种到35mm培养皿中，培养后弃去培养基，用瑞氏-姬姆萨染色后，在20解剖显微镜下计数含有50i个细胞的细胞集落。2）半固体软琼脂培养法 取对数生长的细胞，用含小牛血清的培养液稀释成1000细胞/ml的悬液；溶化5%的琼脂液，并按1：9的比例与含小牛血清的新鲜培养液混合，倒入35mm培养皿（1ml/皿），室温下待琼脂凝固，%琼脂, 加到已

36、制备的琼脂平皿中，室温下凝固。移入培养箱培养。在16解剖显微镜下计数直径大于75m的细胞集落。以集落形成抑制百分率对对数剂量作图，可得“S”型曲线，从曲线上求取半数抑制浓度IC50；以集落的存活分数与剂量作图，可获得克隆原细胞存活曲线，方程为S=1-(1-e-D/Do)n，S为存活分数， D 为剂量， Do为存活分数每下降1/e时所需的药物剂量， n为外推值。Do越小， 药物的杀伤力越大，N越大杀死细胞的药物剂量越大。5、硫化若丹明B法（SRB）法 硫化若丹明（sulforhamine B）呈粉红色，溶于水，可与生物大分子的碱性氨基酸结合，这种结合物在波长515nm时的读数与细胞表现出良好的线

37、性关系，可用于细胞的定量。测试的细胞先用TCA固定，去除固定液，加入SRB， 室温下静置， 然后去除未结合的SRB， 用非缓冲tris碱液溶解结合的SRB，在自动化分光光度平板读数仪（515nm波长）测定OD值。可根据下述公式计算: T - T0 生长率（%）= 100% C - T0C、T和To分别为对照组细胞，为给药组细胞，另外的对照平板加药时的细胞的OD值。 T - T0杀伤率(%) = 100% T T - T050%生长抑制所需的药物浓度(GI50) = 100% C - T0 T - T0杀死50%细胞所需的药物浓度(LC50)= 100% T0（e）抗肿瘤作用机理的深入研究（一）

38、药物作用周期特异性研究进行药物作用细胞周期性实验必须首先制备同步化的细胞，常用的体外培养细胞同步化的方法有机械振荡法、双胸苷同步法、含羞草氨酸俘获法和离心洗脱法。1、机械振荡法 机械振荡法分离同步化细胞是基于单层贴壁生长的细胞在进入有丝分裂期时, 胞形变圆，松散地附在支持物上，利用摇晃或拍击培养瓶可以剥离出这些细胞，利用此方法可以得到较纯的M 期细胞。双胸苷同步法的原理是先以高浓度的TdR处理细胞，使细胞内的dTTP升高，后者抑制CDP 向dCDP的转变，DNA复制受阻，S期细胞停滞在S 期，其它期细胞积聚在G1/S边界；撤TdR，让原处于S期的细胞完全越过S期，再给予TdR，让越过S期的细胞

39、进入G1/S边界，然后撤去TdR，让细胞重新生长，同时进入S期。因此，本方法可以得到较纯的S期细胞。2、含羞草氨酸俘获法 含羞草氨酸可将细胞集结于G1/S边界，阻止细胞进入S期。在撤除含羞草氨酸后，细胞可同步进入S 期。3、离心洗脱法 离心洗脱法的原理是进入细胞周期的的体积呈线性增加。G1期细胞体积最小，离出口最近而被最先洗出。G2/M细胞体积最大离进气口最近而被后洗出。在上述同步化处理尚需配合以同步化程度的检测，检查的方法有两种：流式细胞光度技术和放射性同位素技术。前者通过测定细胞的荧光强度来定量细胞的DNA量； 后者则利用测定掺入到DNA中的3H-胸苷（3H-TdR）或溴脱氧尿苷（BrdU

40、）的量来获知处于S 期的细胞量。（二）药物抗微管作用 利用微管蛋白在37聚合，在冰浴上解聚的特点，测定微管蛋白或微管液的OD值，分别获得S型的聚合曲线和倒S型的解聚曲线， 比较药物对曲线的影响， 用下式计算抑制率。 实验组光密度值抑制率（%）=（1 - ）100% 对照组光密度值（三）药物与DNA结合能力检查 吸收光谱移动法 原理是DNA与药物形成复合物后吸收光谱发生改变，吸收峰产生位移，位移波长随DNA/ 药物复合物的量增加而增加。利用紫外分光光度计进行紫外吸收光谱扫描，可观察到这些改变。荧光光谱移动法 原理是在激发光的激发下，DNA-药物复合物的荧光发射光谱发生改变，谱峰向短波方向移动，荧

41、光强度增强，同时激发光谱说发生改变。用荧光分光光度计测定激发光谱和发射光谱可观察到这些变化。（四）药物造成的DNA损伤彗星（Comet）微凝胶单细胞电泳法 正常的DNA为负超螺旋结构， 在pH。DNA受损后链断裂, 成为一个松散的结构, 在电场的作用下,松散的DNA离开细胞核向正极移动, 形成彗星似的拖尾,变换不同pH缓冲液可检测断裂的是双链还是单链。碱洗脱法 收集细胞于滤膜上，用细胞溶解液裂解细胞并洗去RNA和蛋白质，暴露DNA，用洗脱液进行洗脱，若DNA发生链断裂，则易于经滤膜洗出。（五）药物对DNA拓扑异构酶的影响DNA拓扑异构酶是调节DNA空间结构的动态变化的关键性核酶，分成拓扑异构酶

42、I和II，抑制拓扑异构酶I可以造成DNA的单链断裂，抑制拓扑异构酶II，可造成双链断裂，进而干扰DNA的复制、重组和基因表达。实验的原理是用从肿瘤细胞核提取的拓扑异构酶II处理PBR322DNA，后者是一种质粒DNA，主要存在有超螺旋、缺口状和线性DNA三种形式，琼脂糖电泳上显示出三条带，在拓扑异构酶的作用下超螺旋DNA解旋、断裂，电泳时超螺旋带减弱或消失，相应的缺口环状或线性DNA增加。如果药物对拓扑异构酶具有抑制作用，则可见超螺旋带保留。此方法亦可改进为观察药物对拓扑异构酶功能的促进和抑制作用。方法是选定不能使一定量DNA完全断裂量的拓扑异构酶处理PBR322DNA后电泳可见超螺旋带，同时

43、加入不同浓度的药物，如果药物抑制拓扑异构酶，则超螺旋带增强，若药物增强拓扑异构酶活性，则见螺旋带减弱或消失。（六）药物对细胞核酸代谢的影响 DNA和RNA合成均需要特殊氨基酸，用同位素标记前体物如3H-TdR，3H-UR可分别掺入到细胞DNA 和RNA中去， 用液闪法测定其同位素活性则可知细胞DNA和RNA 的合成情况。（七）药物对肿瘤细胞凋亡的诱导作用细胞凋亡是一种受基因调控的细胞程序性死亡过程，细胞凋亡时表现为细胞体缩小，染色质浓缩成大小不等的块状，并裂解为小片段。DNA断裂长度为核小体核苷酸长度(180200碱基对)的整倍数，提取后普通的琼脂糖电泳表现为特殊的云梯状，凋亡小体形成。检查细

44、胞凋亡的方法有：1、荧光显微镜的形态学检查 该方法是利用凋亡细胞染色质浓缩，DNA广泛裂解的特征和荧光化合物可嵌入DNA分子或以静电相互作用与DNA分子结合的原理，建立DNA的荧光探针。常用的方法是用Hoechst33342和PI联合染色，然后在荧光显微下用紫外光激发。凋亡的细胞对Hoechst33342具有高摄取比，加之染色质的高度浓缩，呈强蓝色荧光；正常细胞呈微弱荧光，坏死细胞则呈红色荧光（被PI染色）。2、流式细胞光度术 该方法的原理是用DNA结合性的荧光染料标记DNA， 因为细胞发生凋亡时，内源性核酸内切酶降解、断裂DNA，断裂生成的小分子量DNA溢出细胞外，细胞内DNA总量降低，利用流式细胞光度术可以检测出DNA的这种结构和量的变化。3、琼脂糖电泳分析法 利用该方法可检测出呈云梯状的寡聚核小体。（g）动物体内药物代谢动力学实