医学分子生物学新技术应用ppt课件.ppt

《医学分子生物学新技术应用ppt课件.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《医学分子生物学新技术应用ppt课件.ppt（114页珍藏版）》请在三一办公上搜索。

1、分子生物学新技术及其应用,申志发E-mail：shenzhifa Tel：15868772693 662693 （短号）温州医科大学检验医学院/生命科学院教育部检验医学重点实验室,代谢组学及研究技术microRNA的研究及应用免疫共沉淀技术（Co-Immunoprecipitation）4. 胞内RNA分子可视技术,第一节 代谢组学及其研究进展,什么是代谢组学？代谢组学研究方法代谢组学分析技术气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）毛细管电泳-质谱联用技术（CE-MS）核磁共振技术（NMR）,代谢组学研究什么？,生物体系（细胞、组织或生物体）代谢产物发生变化（种

2、类，随时间变化）,特定基因突变,环境变化,生物体系,代谢组学研究对象,体内各种物质代谢过程互相联系形成一个整体,各种物质代谢之间互有联系，相互依存。,机体物质代谢不断受到精细调节,机体有精细的调节机制，调节代谢的强度、方向和速度,内外环境的变化,对机体代谢造成影响,适应环境的变化,精细的调节控制,代谢组(metabolome)是指一个细胞、组织或器官中所有代谢物的集合, 包含一系列不同化学型的分子, 比如肽、碳水化合物、脂类、核酸以及异源物质的催化产物等。代谢组学(metabonomicsmetabolomics)来源于代谢组一词,是研究一个细胞、组织或器官中所有小分子代谢组分集合的科学。代谢

3、组学研究的目的是定量分析一个生物系统内所有代谢物的含量。,代谢组学分析可以指示细胞、组织或器官的生化状态, 协助阐释新基因或未知功能基因的功能, 并且可以揭示生物各代谢网络间的关联性, 帮助人们更系统地认识生物体。进行代谢组学研究涉及生命科学、分析科学以及化学统计学三大方面的专业知识。 代谢物化学分析技术及数据分析技术的发展极大促进了诸多生物、医学问题的研究, 这些知识的综合运用使得代谢组研究在疾病诊断、药理研究以及临床前毒理等研究中发挥了极为重要的作用。,普遍定义,代谢组学：通过考察生物体系（细胞、组织或生物体）受刺激或扰动后（如将某个特定的基因变异或环境变化后），其代谢产物的变化或其随时间

4、的变化，来研究生物体系的一门科学。研究对象：相对分子质量小于1000的内源性小分子。代谢物小分子类别：多肽、氨基酸及其衍生物、胺、脂类、金属离子。,特点,1.关注于内源性小分子化合物。2.对生物体系中的小分子化合物进行定性定量研究3.内源性小分子化合物的上调和下调指示了与疾病、毒性、基因修饰或环境因子的影响。4.内源性化合物的特点用来表征疾病和药物筛选。,代谢组学的发展,研究方法,研究步骤：,Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics,生物组织，体液经灭活预处理,多个方法联用,应用,药物研发疾病研究植物代谢组学微生物代谢组学中药现代化,连接图

5、数据库 Connections Map DB京都基因与基因组百科全书 KEGG (http:/www.genome.jp/kegg/ligand.html)生物化学途径 ExPASy互联网主要代谢途径 main metabolic pathways on Internert, MMPDuke 博士植物化学和民族植物学数据库Arizona 大学天然数据库Wiley_handbook of gc-ms新药及其代谢产物质谱库http:/www.ualberta.ca/_gjones/mslib.htm“肿瘤”代谢组数据库http:/www.metabolic-Pubmed 化合物数据库http:/w

6、ww.pubmed.govNIST质谱数据库http:/www.nist.gov/srd/nistl.htm,一些有用的数据库：,代谢组学分析技术,气相色谱-质谱联用技术（GC-MS)液相色谱-质谱联用技术 （LC-MS)毛细管电泳-质谱联用技术 （CE-MS)核磁共振技术 （NMR）,分析技术,1.气相色谱-质谱联用技术（GC-MS） 工作原理：,气相色谱仪,接口,质谱仪,常压,高真空,离子源,质量分析器,检测器,质谱仪的基本结构及工作流程,几种新的GC-MS技术,全二维气相色谱质谱技术（GCGC-TOFMS）,气化室,检测器,色谱柱1,色谱柱2,调制器,研究实例,用Leco ChromaT

7、OF soft ware得到的质荷比为73（m/z）的离子碎片典型GCGC-TOFMS二维血浆色谱图（Analytica Chimica Acta，2009，633，257-262）,大连化物所许国旺教授分析确定5种糖尿病病源标记物：葡萄糖、2-羟基异丁酸、亚麻油酸、软脂酸、磷酸。 脂肪酸代谢紊乱,GC-MS 适用于挥发性的代谢物。对于非挥发性代谢物的分析需要经过化学衍生。多用于环境分析、大气有毒气体分析、某些疾病诊断等。,2.液相色谱-质谱联用技术（LC-MS） LC工作原理：,液相色谱-质谱联用的新技术,4000Q Trap LC/MS/MS,高效液相色谱系统配合液相质谱系统。健康和慢性乙

8、肝病人的血清样本。,使用PLS-DA处理代谢数据正常组和慢性乙肝组对照（Journal of Proteome Research, 2006, 5, 554-561）,新型液相色谱技术UPLC,新型超高液相色谱仪,HPLC色谱柱填料颗粒：3、5m,UPLC色谱柱填料颗粒：1.7m分离能力得到空前提高,比较（a）HPLC和（b）UPLC用于美沙芬的代谢物TOP质谱全扫描（Rapid Commun Mass Spectrom, 2005, 19, 843）,UPLC在代谢组学中的研究优势,UPLC相对于传统的HPLC有更好的分离效率、峰容量、及灵敏度，提供更适合与质谱联用的接口，有助于检出更多的代

9、谢物。提高方法通量、灵敏度，改善与质谱联用的定性定量结果。UPLC与质谱联用为代谢组学研究提供更加高效、灵敏的研究平台。,毛细管电泳-质谱联用技术（CE-MS）,代谢组学研究的生物样品中包含多种离子性代谢物（糖酵解代谢产物、三羧酸循环代谢物、如羧酸、磷酸化糖；以及核苷酸、氨基酸、辅酶等代谢物。）毛细管电泳是以毛细管为分离通道、采用高压直流电场为驱动力的的新型液相分离技术，通过离子化合物的质荷比（m/z）不同造成迁移速率不同来实现分离。 适用于普通反相色谱柱不易保留的离子性代谢物的分离分析。,毛细管电泳-质谱联用分析仪（兰州理工大学）型号： P/ACE MDQ-Deca XP plus 厂家：美

10、国 Beckan Coulter-Finnigan,（NMR）,基于具有自旋性质的原子核在核外磁场的作用下，吸收射频辐射而产生的能级跃迁谱学，主要用于反映化合物结构中的H和C原子的位置信息。1H-NMR：在排除杂质及水峰的干扰下，1H-NMR的谱峰与样品中的化合物的氢原子是一一对应的。所测的样品中的每一个氢在谱图中都有唯一的谱峰与之相对应。图谱中信号的强弱则反映出样品中各组分相对含量的关系，适用于研究代谢产物。,核磁共振,电子云：,基于具有自旋性质的原子核在核外磁场的作用下，吸收射频辐射而产生的能级跃迁谱学。主要用于反应化合物结构中的H和C原子的位置信息。,hr-MAS of biologic

11、al tissue,相同强度,放大,人前列腺组织（prostate tissu）良性 vs. 恶性,癌症组织给出更多的脂类物含量（lipid ）！,代谢组学研究一般包括四个步骤：第一步，给予生物体一定的刺激。第二步，代谢组数据的采集。用核磁共振、质谱、色谱等分析手段测定其中代谢物的种类、含量和状态以及其变化。,第三步，建立表征代谢特征的时空模型。在代谢组学中最常用的建模方法是主成分分析(Principle Components Analysis, PCA)。第四步，建立代谢物时空变化与生物体特性的关系，达到从不同层次和水平上阐述生物体对相应刺激的响应的目的。,35,microRNA 的研究与应

12、用,36,10.1.1 概述10.1.2. microRNA的分子生物学研究方法 10.1.3 microRNA的实验技术10.1.4 microRNA与疾病,内容结构,37,概述,miRNA是由2125个核苷酸组成的非编码RNA；它通过与靶基因的3-UTR的配对，促进mRNA的降解或抑制mRNA的翻译从而抑制其靶基因的表达；它在生物体生长发育、细胞增殖、分化、凋亡以及人类各种疾病的发生发展过程中发挥重要的调控作用。,?,什么是miRNA？,38,概述 MicroRNA的发现,lin-4: Lee等人于1993年在线虫中通过胚胎发育时间控制缺陷性遗传筛选实验中发现，是第一个被发现的miRNA。

13、 lin-4在L1,L2阶段大量表达，如缺失，则导致幼虫发育停顿。,L1,L2,L3,L4,L1L4，线虫发育的四个不同阶段,39,let-7: Rinhart等人于2000年在线虫发现第二个miRNA， let-7。 let-7在L3,L4阶段大量表达，控制幼虫的L4阶段向成虫阶段发育转换。,L1L4，线虫发育的四个不同阶段,概述 MicroRNA的发现,40,MicroRNA的起源与生物合成过程,1. miRNA基因被转录成pri-miRNA (RNA 聚合酶)；2. pri-miRNA被剪切成具有70-100个核苷 酸 的pre-miRNA (Drosha,DGCR8)； 3. pre-

14、miRNA从核内被转移至胞质 (Exportin-5, Ran-GTP)；4. pre-miRNA被剪切成21-25个核苷酸的双链 RNA双体 (Dicer,TRBP,PACT)；5. 双链RNA双体中成熟miRNA链会选择性整合入RISC,并与mRNA互补配对。,41,MicroRNA的起源与生物合成过程,42,miRNA与siRNA的性质比较,引自 方福德, microRNA的研究方法与应用, 中国协和医科大学出版社, 2008,43,续表1,44,续表2,45,MicroRNA的鉴定,正向遗传学的突变筛查方法（最初几个miRNA分子的发现；效率不高）；cDNA克隆技术（有优势也有不足）；

15、生物信息学预测方法 （是实验预测方法有益和必要的补充；目前两个最主要的miRNA基因预测工具：MiRscan和miRseeker） 当然计算机预测的miRNA必须经过RT-PCR或Northern试验分析才能鉴定,46,MicroRNA的特征,广泛存在于真核生物中, 是一类内源性表达的非编码短序列RNA, 本身不具有开放阅读框 (ORF) ； 成熟的miRNA长度通常为2125nt； miRNA在进化上具有高度保守性； miRNA表达具有细胞和组织特异性，同时具有时序性 如拟南芥中的miR-171仅在其花序中高水平表达，在某些组织低水平表达，在茎、叶等组织中却无任何表达的迹象；20-24h的果

16、蝇胚胎提取物中可发现miR-12，却找不到miR3-miR6，在成年果蝇中表达的miR-1和let-7也无法在果蝇胚胎中表达,47,MicroRNA的功能,miRNA通过基因的转录后调控过程参与了生命体的发生、生长、发育、分化和死亡的各个过程。如线虫幼虫发育阶段的转换，哺乳动物的造血分化，脂类代谢，激素分泌，癌症，糖尿病，白血病以及病毒感染等。,48,部分已知功能的miRNA,引自 方福德, microRNA的研究方法与应用, 中国协和医科大学出版社, 2008,49,续表,50,MicroRNA的调控机制,mRNA剪切 miRNA与靶mRNA几乎完全互补； 切割位点在从5端起与miRNA配对

17、的第10位和11位核苷酸之间 ； 由RISC中的内切酶催化完成； 可催化多个mRNA分子的降解翻译抑制 miRNA与靶mRNA互补程度较低； 翻译抑制可能发生在翻译起始后的某一阶段； 翻译顺利进行但翻译产物可能被特异性降解,每个miRNA可以有多个靶基因，而几个miRNAs也可以调节同一个基因。这种复杂的调节网络既可以通过一个miRNA来调控多个基因的表达，也可以通过几个miRNAs的组合来精细调控某个基因的表达,51,MicroRNA表达的研究方法,miRNA基因芯片技术，高通量检测miRNA表达情况的最佳选择；PAGE/Northern blotting杂交法，可用于miRNA表达水平的定

18、量检测，还能与RNA marker结合使用检测miRNA分子的大小，用来排除其他小分子RNA的污染；原位杂交，可直观显示生物体miRNA的时间和组织特异性表达谱；miRNA实时定量PCR，可高度灵敏地检测出低丰度表达地靶分子，适用于高通量筛选。,52,miRNA功能研究的主要实验策略,引自J Krtzfeldt, Matthew N Poy and Stoffel. Strategies to determine the biological function of miRNAS. Nature Genetics, 2006,38 (suppl):S14-S19,53,MicroRNA功能研究

19、方法,miRNA体外或体内水平的过表达研究 构建相应的表达载体 体外合成miRNA前体分子miRNA表达抑制研究 基因水平抑制miRNA表达 使用反义核酸分子抑制miRNA表达,55,miRNA基因克隆,（一）基本原理：miRNA克隆是依赖于其本身的特殊结构，5端的磷酸基团和3端的羟基基团，以T4 RNA连接酶在分子末端加上连接子，然后利用RT-PCR方法扩增获得目的片段，克隆到合适的载体，最后测序验证。（二）应用：microRNA基因克隆主要用于寻找新microRNA基因，同时还可获得精确的表达信息。,56,Michael MZ, 2006,miRNA基因克隆策略,57,miRNA基因克隆的

20、基本步骤,（一）总RNA的提取 关键：尽量不使小RNA丢失（二）小分子RNA分离纯化及富集 变性聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）方法 是用于小分子RNA分离纯化的理想方法。 （三）小分子RNA片段修饰 小分子RNA的修饰包括磷酸化、去磷酸化以及在3端和5端连接上连接子等,58,miRNA基因克隆的基本步骤,（四）克隆及测序鉴定 含3与5端接头的小分子RNA，经RT-PCR扩增后连接至合适的载体，转化克隆，最后用相关方法鉴定阳性克隆。（五）PAGE/Northern blotting验证 PAGE/Northern blotting方法是确认microRNA 最有效 和常用的方法。,59,PAGE/N

21、orthern blotting,（一）基本原理：PAGE/Northern blotting与常规核酸杂交技术原理相同，都是根据碱基互补配对原理，设计特异探针，与膜杂交，经放射自显影后分析杂交信号。唯一的差别在于选择对小分子RNA分离效率更高的PAGE代替琼脂糖作为分离胶。（二）应用：PAGE/Northern blotting方法能提供准确的杂交信息以及有效检测低丰度的RNA分子，在验证micorRNA基因芯片结果及降低假阳性方面具有重要作用，是目前研究microRNA的重要技术。,60,PAGE/Northern blotting基本操作步骤,（一）总RNA的提取 关键：尽量不使小RNA

22、丢失（二）样品处理 取适量提取的RNA样品于上样缓冲液及去离子甲酰胺中 混匀，55孵育30 min，冰浴后准备PAGE分离。（三）PAGE分离、转膜及固定,61,PAGE/Northern blotting基本操作步骤,（四）寡核苷酸探针的制备 探针标记可选择放射性核素或非放射性荧光，其中放射 性核素敏感度高，可检测较低丰度的microRNA分子（五）杂交、洗膜、压片及显影 （六）如果选用放射性标记的探针，在分析结果后要去除Northern印记膜上的放射性，避免放射性污染。,62,MicroRNA基因芯片技术,基本原理：MicroRNA基因芯片的基本原理与以往传统基因芯片的使用原理基本相同，

23、即经过标记的待测microRNA与芯片上特定位置的探针根据碱基互补配对原则杂交，再经特定仪器扫描，以计算机相关软件对荧光信号进行检测，并转化为可读的数字信息，最后经大量数据分析筛选出有显著表达差异的microRNA。,63,MicroRNA基因芯片技术,主要应用： （1）寻找和发现新microRNA基因； （2）miRNA相关疾病的诊断和治疗，如肿瘤、 白血病、糖尿病等； （3）药物筛选和药物开发等；,64,MicroRNA基因芯片技术操作流程示意图,Li W, Ruan KC. 2009,65,MicroRNA基因芯片技术操作流程,（一）MicroRNA基因芯片的设计与制作 可根据实验需要自

24、行设计芯片，需要考虑探针的种类、点阵数目及片基种类等；也可向市面上购买芯片（二）RNA提取与纯化 （三）RNA样品的标记 MicroRNA芯片表达谱分析的一个前提条件是检测到所有的microRNA，并且结果具有可重复性。因此，选择合适的microRNA标记系统是实现芯片表达谱检测精确性的一个保证。,66,MicroRNA基因芯片技术操作流程,（四）芯片杂交及后处理 由于microRNA分子量小，因此，杂交反应条件及杂交后洗脱条件需谨慎选择。 （五）图像采集和数据分析 MicroRNA基因芯片图像的采集和分析是microRNA芯片技术的重要环节，芯片图象获取的准确性和分析的可靠性直接影响芯片的应

25、用。（六）验证 由于microRNA基因芯片结果存在假阳性的可能性，需要用PAGE/Northern blotting、定量PCR等方法验证。,67,MicroRNA实时定量PCR,基本原理：利用能特异标记PCR产物的荧光物质，显示PCR 产物的动态累积，得到S 型的扩增曲线；假设该曲线的前期PCR 符合指数性扩增，于是在单纯指数方程的基础上，通过比较产物积累的速度来间接比较初始模板的分子数。 最初，实时定量PCR被用于定量检测小RNA分子的前体表达；现在，经过方法改进可用于检测成熟小RNA分子的表达。,68,MicroRNA实时定量PCR,主要应用： （1）microRNA的定量检测，可精确

26、检测出细胞或组织样品中特定微量的microRNA表达水平； （2）由于该方法可以同时检测microRNA及其前体，因此，可以根据两者在不同发育阶段的表达差异情况来深入了解microRNA的起源和发生； （3）应用于临床诊断和治疗等。,69,TaqMan MicroRNA 实时定量PCR示意图,Chen CF, Ridzon DA, Broomer AJ, et al. Real-time quantification of microRNAs by stemloop RTPCR. Nucleic Acids Res. 2005; 33(20): e179,70,MicroRNA实时定量PCR操

27、作步骤,（一）总RNA提取、小分子RNA的分离纯化及富集 （二）逆转录反应 MicroRNA的逆转录反应与普通的针对mRNA的逆转录反应过程基本相似，但也有其特异之处，如它的逆转录酶的特异性等。 （三）实时定量PCR 针对microRNA的实时定量PCR的热学反应条件要谨慎选择。,71,MicroRNA与疾病,MicroRNA与人类疾病包括肿瘤、糖尿病、炎症、心脏疾病、病毒感染等的发生密切相关。 MicroRNA造成疾病发生的可能原因有：突变、基因表达失活、低效转录等原因造成的microRNA表达下调；启动子区域基因扩增或突变等原因造成的microRNA表达上调等。,72,microRNA引发

28、癌症的可能原因： （1）microRNA与细胞的增殖、分化、凋亡密切相关，而肿瘤则是由细胞增殖、分化、凋亡功能紊乱而引发的 ； （2）许多microRNA的基因位于基因组中易发生断裂、移位、缺失等变异的区域 ； （3）与正常组织相比，在恶性肿瘤和肿瘤细胞株中普遍存在着对microRNA的表达失控,充当抑癌基因作用的miRNA:,miR-15a和miR-16-1 :,这两个miRNAs的缺失或下调，促进了白血病、淋巴瘤和前列腺癌的发生。,mir-143和mir-145: 在结肠癌中明显下调,充当癌基因作用的miRNA:,miR-21:在胶质母细胞瘤中表达增加,miR-155:在Burkitt淋巴

29、瘤、Hodgkin淋巴瘤等肿瘤中表达上升,74,目前肺癌中已经表达分析及初步功能研究的部分microRNA,75,MicroRNA与糖尿病,MicroRNA引发糖尿病的可能原因： （1） MicroRNA参与胰岛素的合成分泌调节； （2） MicroRNA对血糖代谢起着直接或间接的调控作用； （3）MicroRNA与脂质代谢密切相关；,76,已知功能的部分miRNA与糖尿病的关系,Amit K. Pandey, et al., 2009,77,miRNA的综合信息网站：http:/microrna.sanger.ac.uk/sequences/index.shtml,免疫共沉淀技术,Zheji

30、ang Provincial Key Lab of Medical Genetics,Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics,Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics,Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics,Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics,Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics,Zhejiang Provinci

31、al Key Lab of Medical Genetics,Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics,Shen et al , Genes and Development. 2010,Shen et al MBC 2009,Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics,Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics,Shen et al 2010,Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics,

32、参考文献1. Zhifa Shen, Anik St-Denis and Pascal Chartrand. Cotranscriptional recruitment of She2p by RNA pol II elongation factor Spt4-Spt5/DSIF promotes mRNA localization to yeast bud. Genes and Development, 2010, 24:1914-19262. Zhifa Shen, Nicolas Paquin1, Amlie Forget and Pascal Chartrand. Nuclear sh

33、uttling of She2p couples ASH1 mRNA localization to its translational repression by recruiting Loc1p and Puf6p. Mol.Bio.Cell, 2009. 20, 2265-2275 .,RNA Visualization inside Cells- seeing is believing,Techniques to Label RNARNA PolyA binding proteins taged with Green Fluorescent Protein (GFP) Fluoresc

34、ent In Situ Hybridization (FISH)MS2 coat protein (MCP) -MS2 binding sites (MBS) system,The RNA-binding protein She2p-GFP,Shen et al. Mol. Biol. Cell. Vol. 20 (2009),FISH （ Fluorescence In Situ Hybridization）,Shen Z., et al. Mol. Biol. Cell, 2009, 20(8): 2265-2275.,TATTTCTGAAGAACATTCATTTAATAGATTTACTC

35、AGTATCTGGGTCTT (T modified with CY3/CY5),Specific RNA labeled with the MS2 system,Valeria de Turris et al. (2009 ) ISBN: 978-3-527-31288-7,Advancements in Imaging Technologies,single-molecule imaging: Optical system to match the requirements for imaging single moving particles. Including:Acquiring i

36、mages at rates as fast as, or faster than, the particle movements projected optically onto the capture chipApplying a minimal amount of light to avoid phototoxicity and bleaching of the sample.Maximizing the signal-to-noise ratio and tracking the particles in three dimensions (3D) and in time (4D imaging).,一、 FISH （ Fluorescence In Situ Hybridization）技术介绍,FISH过程,制片,Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics,Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics,