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1、细胞工程教学提纲、课后思考题及补充思考题课程学时：36学时，学分：2学分n 教学基本要求：l 1了解与细胞工程相关的重要理论，背景知识和细胞工程学的基础知识。l 2了解和掌握细胞工程各种技术的基本原理、技术和方法。l 3了解和掌握细胞工程的工程与实验技术。l 4了解细胞工程重要技术的应用途径和范围，存在的问题及缺点。l 5了解细胞工程关键技术的最新进展和发展前景。 课程考核方式： 闭卷笔试综合考查。平时考查与期末考试相结合。 1、平时出勤、作业成绩占10%； 2、期中考试成绩占30%； 3、期末考试成绩占60%。第一章绪论第1节 生物工程u 1.1定义u 1.2发展历程u 1.3现代生物工程的
2、特点与组成u 一、定义 1、利用生物将原材料转化为产品的技术。（Kail Ereky，1917） 2、应用自然科学及工程学的原理，依靠微生物、动物、植物体作为反应器将材料进行加工以提供产品为社会服务的技术。（国际合作及发展组织，1982） 3、以现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段和其他基础学科的科学原理，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产所需产品或达到某种目的的技术。（国家科委，1986）生物技术（biotechnology）以生命科学为基础，利用生物体系和工程学原理生产生物制品和创造新物种的一门综合技术，也就是利用生物有机体或其组成部分如细胞、组织、器官等发展新工艺或
3、制造新产品的技术。u 二、发展历程 1、第一代生物工程（微生物发酵，如酒精等） 2、近代生物工程（医用抗生素、氨基酸、酶） 3、现代生物工程（高新技术）u 三、现代生物工程的特点与组成 1、发酵工程 2、酶工程 3、蛋白质工程 4、基因工程 5、生物化学工程 6、细胞工程第2节 细胞工程u 2.1定义u 2.2发展历史u 2.3主要研究内容u 2.4重要应用u 一、定义l 细胞工程（cell engineering）应用细胞生物学和分子生物学的方法，通过类似于工程学的步骤，在细胞整体水平或细胞器水平上，按照人们的意愿来改变细胞内的遗传物质以获得新型生物或特种细胞产品的一门综合性科学技术。u 二
4、、发展历史（略）u 三、主要研究内容 1、动植物细胞与组织培养 2、细胞融合 3、染色体工程 4、胚胎工程 5、细胞遗传工程u 四、重要应用 1、优质植物快速培育与繁殖 2、动物胚胎工程快速繁殖优良、濒危品种 3、利用动植物细胞培养生产活性产物、药品 4、新型动植物品种的培育 5、供医学器官修复或移植的组织工程 6、转基因动植物的生物反应器工程 7、珍稀动植物资源的保存与保护 8、应用于遗传学、发育学等领域的理论研究 9、应用于能源开发、环保等第一章小结：v 定义v 一、生物工程发展历程v 现代生物工程的特点与组成v 定义v 二、细胞工程发展历史v 主要研究内容v 重要应用第二章细胞工程基础第
5、1节 细胞生物学基础u 1.1细胞u 1.2染色质与染色体u 1.3细胞周期u 1.4细胞分裂u 1.5细胞分化与细胞全能性u 细胞分化个体细胞发育过程中，后代细胞在形态结构和生理功能上发生差异的过程。l 持家基因细胞中维持细胞生存所必需的基因。l 组织专一基因在各种细胞中专一选择表达的基因。l 发育潜能细胞分化能力的强弱。高度分化的植物营养组织具有全能性，高等动物细胞发育潜能变窄。细胞全能性已经分化和尚未分化的细胞所具有的表达生物体基因组任何一种基因、分化出任何一种类型细胞、各种组织直至发育成完整个体的潜能。l 多能性随着胚胎的发育，细胞具有分化出各种组织的潜能而失去发育成完整个体的潜能，这
6、种发育潜能叫多能性。u 去分化在某些条件下，分化细胞不稳定，基因活动模式发生可逆变化又回到未分化状态的过程，如培养条件下的植物愈伤组织。l 一个已分化细胞，要表现其全能性，形成完整个体，首先要经历脱分化，然后再经历再分化过程。第2节 分子生物学基础u 2.1基因与基因复制u 2.2转基因技术第3节 普通生物学基础u 3.1组织、器官u 3.2生殖、发育u 一、组织、器官u 分生组织u 植物组织u 成熟组织u 上皮组织u 动物组织 结缔组织u 肌肉组织u 神经组织n 分生组织按在植物体中的位置分：l （1）顶端分生组织l （2）侧生分生组织l （3）居间分生组织l 二、生殖、发育l 1、高等植物
7、的生殖和发育：l 花粉粒的形成和发育l 胚囊的形成和发育开花与传粉l 花粉萌发和双受精作用受精胚珠发育形成种子（合子发育成胚，受精极核发育成胚乳）果实形成种子萌发与幼苗形成l 2、高等动物的生殖和发育：l 受精卵卵裂球囊胚原肠胚形成中胚层胚层分化幼体l 顶体反应获能的精子释放顶体酶，溶解卵细胞周围的放射冠和透明带的变化。l 精子必须穿过几层物理性的屏障才能穿入卵内。在哺乳动物中，精子入卵所面临的第一层屏障是一层包埋在黏性透明质酸中的卵丘细胞。精子头部表面的透明质酶活性有助于精子穿过卵丘细胞层。第二层屏障是在卵丘细胞层下面包裹卵细胞的一层透明带。l 卵透明带是被覆于卵母细胞及着床前受精卵外的一层
8、基质，由糖蛋白组成。在受精过程中及早期孕卵发育方面具有重要的作用。l 当一个获能的精子进入一个次级卵母细胞的透明带时，受精过程即开始。到卵原核和精原核的染色体融合在一起时，则标志着受精过程的完成。l 受精的过程包括精子与卵子接触、精子穿过卵细胞的放射冠和透明带、次级卵母细胞进行第二次分裂及两性原核的融合。 精子头部通过顶体反应释放顶体小泡中的内容物，有助于精子穿过透明带。透明带中含有一种特异性结合的糖蛋白受体ZP3，而精子头部含有一种能够和ZP3结合的黏附分子1，4半乳糖基转移酶。当精子与ZP3结合后，顶体通过胞吐作用将内容物释放。释放的内容物主要是一些酶类，包括N乙酰葡萄糖胺糖苷酶和顶体素，
9、前者用于降解透明带糖蛋白上的寡糖链，后者为一种蛋白酶。它们可以使精子表面与卵细胞质膜结合的蛋白暴露出来。受精素就是其中的一种，有两个跨膜亚基组成，能与卵细胞质膜上的整联蛋白受体结合，从而引发精子与卵子融合。n 胚层的分化 （1）外胚层l 分化成皮肤表皮和其衍生物（比如口腔、鼻腔、肛门的粘膜、毛发、指甲、爪等）、神经系统、感觉器官、肾上腺髓质等。 （2）内胚层l 分化形成消化道、呼吸道及排泄管道的上皮、肝、胰、扁桃体、甲状腺、胸腺等。 （3）中胚层l 分化形成肌肉、骨骼、血管和血液、淋巴系统、肾脏、生殖腺、肠系膜等。 第二章小结：v 一、细胞生物学基础（细胞、染色质与染色体、细胞周期、细胞分裂、
10、细胞分化与细胞全能性）v 二、分子生物学基础（基因与基因复制、转基因技术）v 三、普通生物学基础（组织与器官、生殖与发育）第三章植物组织与细胞培养第1节 植物组织培养与细胞培养的区别 组织培养从生物体内取出组织或细胞，模拟机体内生理条件，在体外进行培养，使之生存或生长成组织的技术。植物组织培养主要是植物无性脱毒快速繁殖技术。 细胞培养使动植物细胞在体外条件下存活或生长的技术，不再形成组织。植物细胞培养主要是以生产植物次生代谢产物为目的的大规模细胞培养技术。 第2节 发展历史（自学）第3节植物组织与器官培养u 3.1定义与基本原理u 3.2几个重要概念u 3.3细胞分化和形态建成u 3.4植物组
11、培的基本步骤u 3.5愈伤组织培养u 3.6植物器官培养u 3.7植物组培的应用u 3.8人工种子u 3.9植物组织与器官的生物反应器培养u 一、定义与基本原理l 植物组织培养在无菌条件下，将离体的植物器官、组织、细胞、胚胎、原生质体等培养在人工配置的培养基上，给予适当的培养条件，诱发产生愈伤组织、潜伏芽，或者长成新的完整植株的技术。l 理论依据：细胞全能性科学研究表明，处于离体状态的植物活细胞，在一定的营养物质、激素和其他外界条件的作用下，就可能表现出全能性，发育成完整的植株。人工条件下实现的这一过程，就是植物组织培养。 v 植物组织培养技术是一种无性快速繁殖技术，与常规营养繁殖方法相比，只
12、需少量材料就能获得大量植株，可以节约大量种子、肥料、耕地，而且是在人工无菌操作和控制生长环境条件下进行，可进行工业化生产，对保质、保纯和反季节生产有着特殊作用，被认为是农业高新技术中最重要、最活跃的领域之一，不仅是农业继续发展的基础，而且是生物技术中应用最广、最具现实意义的领域，被誉为农业发展史上的第四次绿色革命，对解决经济和社会发展所面临的人口增长、农业资源贫乏、环境污染等重大问题具有十分重要的战略意义。u 二、几个重要概念 1、全能细胞l 能够表达生物体基因组的任何一种基因，并能分化出该生物体内任一类型细胞，进而发育为一个完全相同生物体的细胞。如合子（受精卵）、早期胚胎细胞、顶端分生组织细
13、胞、成熟器官遗留的胚性细胞等。 2、愈伤组织l 由外植体组织增生的细胞产生的一团不定型的疏散排列的薄壁细胞，比较容易分离，通常在外植体伤口处产生。这些细胞的大小、形状、液泡化程度、胞质含量、细胞壁特性等通常有较大差异。l 继代培养器官发生再生植株l 单细胞细胞培养l 原生质体 3、外植体l 植物组培中用来进行离体无菌培养的离体材料，器官、组织、细胞、原生质体都可以。 4、继代培养l 愈伤组织在培养基上生长一段时间后，营养物枯竭，水分散失，并已经积累了一些代谢产物，此时将这些组织转移到新的培养基上的培养方式，也称传代培养。u 三、细胞分化和形态建成u 体细胞胚指离体培养条件下没有经过受精过程而形
14、成的胚胎类似物，又叫胚状体。u 去分化在某些条件下，分化细胞不稳定，基因活动模式发生可逆变化又回到未分化状态的过程，如培养条件下的植物愈伤组织。l 一个已分化细胞，要表现其全能性，形成完整植株，首先要经历脱分化，然后再经历再分化过程。l 组培研究结果表明：分化细胞的脱分化关键需要两个条件：创伤和外源激素，如生长素、细胞分裂素或赤霉素。u 植物组织培养常用仪器设备：v 电子天平、高压蒸汽灭菌锅、电热干燥箱、超净台、冰箱、人工气候培养箱、人工气候室、三重纯水蒸馏器、超纯水仪、电炉、试管、三角瓶、培养皿、剂量器皿（量筒、容量瓶、移液管、移液枪等）、烧杯、试剂瓶、镊子、解剖剪、解剖刀等。u 植物组织培
15、养培养基成分：v 培养基应含有植物生长所必需的各种营养成分，以满足植物正常生长发育的需要。在完整的全培养基中应包括无机盐类、碳源、有机氮源、植物生长激素、维生素等物质。这些物质主要有四个方面的生理作用：一、作为结构物质参与机体的建构，如蔗糖提供碳源，肌醇在糖类的相互转化中起作用，是构成细胞壁的材料，也参与细胞膜的构建。氨基酸是很好的有机氮源，可直接被细胞吸收利用；二、构成特殊的生理活性物质，在代谢中起调节作用，如维生素类物质在植物细胞中主要以各种辅酶的形式参与多种代谢活动，对生长有促进作用；三、维持离子浓度的平衡、电荷平衡、胶体平衡等，如琼脂作为培养组织的支撑物起支持作用；四、影响器官的形态发
16、生和建成，如钾、铁、镁、钙等 。u 植物组织培养培养基成分：v （1）无机盐类v 大量元素：N、S、P、K、Ca、Mg等v 微量元素：Fe、Mn、Cu、Zn、Cl、B、Mo等v 通常无机盐浓度为25mmol/L左右，硝酸盐浓度一般为2540mmol/L，其中必须添加钾元素，浓度在20mmol/L或更高，磷、镁、钙、硫元素浓度在13mmol/L。v （2）碳源v 最常采用的碳源为蔗糖，用量在2%3%范围内。 v （3）有机氮源v 通常采用的有机氮源有蛋白质水解产物、谷氨酰胺或氨基酸混合物。v （4）植物生长激素（用量常在0.11mg/L）v 生长素能促进细胞分裂，促使根的形成，最常用的有吲哚乙酸
17、（IAA），2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D），萘乙酸（NAA）和吲哚丁酸（IBA）。吲哚乙酸是一种吲哚类具有生长素活性的广谱性植物生长调节剂，目前主要用于植物组织培养、诱导愈伤组织形成、促进生根。吲哚丁酸主要应用于促进插条生根。萘乙酸促进植物生长、插条生根。2，4-D用途随浓度而异，效果不一，在较低浓度下是植物组织培养的成分之一，促进愈伤组织的形成。v 细胞分裂素通常是腺嘌呤衍生物：6-苄基嘌呤（BA）、玉米素（ZT）、激动素（KT）。6-BA是诱导芽的分化，促进侧芽萌发生长，促进细胞分裂与扩大抑制根的分化。 v （5）维生素v 维生素作为植物细胞分裂、分化的生理活性物质，在植物细胞内主要以
18、各种辅酶的形式参与多种代谢活动。常用的维生素有：盐酸硫胺素（维生素B1)、烟酸（维生素B3）、盐酸吡哆素（维生素B6）、抗坏血酸（维生素C）。一般采用的维生素浓度为0.11mg/L。 v （6）肌醇v 又叫环已六醇，可促进愈伤组织的生长和胚状体及芽的形成。常用浓度为50100mg/L。v （7）复合物v 通常为细胞生长调节剂，包括酵母抽提液、麦芽抽提液、椰子汁和水果汁等。一些抽提液对细胞有毒性，现在已被已知成分的营养物质代替。目前仍广泛使用的是椰子汁。v 组培常用基本培养基是MS培养基，另外还有B5、N6、NT、AA等培养基。调pH5.55.8。u 培养基及器械的消毒：v 玻璃培养仪器及无菌操
19、作所用的水、滤纸、纱布、各种器械如解剖刀、解剖剪、解剖针、镊子等通常与培养基一起事先用高压灭菌锅灭菌备用。u 四、植物组培的基本步骤l 1、培养材料的采集l 2、材料消毒l 3、制备外植体l 4、接种和培养l 5、诱导生根l 6、炼苗、移栽u 1、培养材料的采集v 理论上全能植物细胞有3类：v （1）受精卵v （2）根尖、茎尖、叶、花等分生组织细胞v （3）雌雄配子及单倍体细胞，如花药、花粉粒等v 在快速繁殖应用中，通常用茎尖，一般切0.5cm左右；如果想要脱毒苗，通常只切茎尖0.1mm以内的部分，因为茎尖分生组织没有分化出维管组织，病毒难以感染到这个部位，但一般说来，外植体越小，培养难度越大
20、。u 2、培养材料的消毒v 材料先用自来水冲洗干净用蒸馏水冲洗（以下在超净台上进行无菌操作）无菌水冲洗无菌滤纸吸干水已消毒解剖刀切成小块70%酒精浸泡3060s移入漂白粉饱和液或0.01%升汞（HgCl2）消毒10min左右无菌水冲洗无菌滤纸吸干水常用消毒剂效果的比较u 植物组织培养中常遇到的问题污染v 污染连同褐变、玻璃化被称为植物组培三大难题。v 1、污染的原因v （1）外植体材料表面消毒不彻底或内生菌随材料带入；v （2）培养基和接种工具消毒不彻底；v （3）接种室和超净台不符合要求；v （4）操作人员不遵守操作规程；v （5）培养过程中环境空气不洁净污染等。v 2、污染的控制v （1）
21、将材料冲洗足够干净，严格消毒灭菌。可采用多次灭菌法。v （2）在培养基中加入一定量的抗生素，如青霉素、链霉素、新霉素、卡那霉素等，但抗生素对培养物的生长和分化会产生一定的抑制，应避免长期使用。 v （3）培养基灭菌时，要检查高压灭菌的温度、压力、时间及操作是否正常等。v （4）接种室定期用紫外灯照射或酒精喷雾或甲醛薰蒸等。超净台接种前用酒精擦拭后再开机灭菌。v （5）接种前，接种人员要严格消毒，认真洗手，酒精擦手；在接种时规范操作，常用酒精擦手。接种工具常在酒精灯火焰上灼烧。接种前后培养器皿开口需转动烘烤。u 3、制备外植体v 用消毒工具将表面消毒的材料作些处理（芽除鳞片、嫩枝除外皮、种子去种
22、皮、去胚乳等，叶片直接切成0.20.5cm小片，想要脱毒苗切至茎尖0.1mm内部分）。u 4、接种和培养v 接种封口置培养室培养（2528，湿度7080%，光照强度3000 4000lx，日光灯光照1016h）继代培养分化培养（一般在基本培养基中加入一定配比生长素与细胞分裂素，超净台上无菌操作）u 5、诱导生根v 将生成不定芽的材料转到生根培养基上诱导生根（一般在基本培养基中加入生长素，超净台上进行无菌操作）。u 6、炼苗、移栽v 试管苗从一个无菌、光温恒定和基本异养的环境转移到有菌、光温变动和完全自养的环境，需要多方面的调整，适应不好会影响成活。v 幼苗根长到一定长度瓶口打开，自然光照3天移
23、出幼苗自来水冲洗根上培养基移入基质（珍珠岩、蛭石等）清水喷湿炼苗1d移入大田栽培u 七、植物组培的应用 1、无性系快速繁殖（用材少，不受季节限制） 2、获得脱毒苗（茎尖生长点、花器培养） 3、选育新品种l （1）突变育种l （2）原生质体融合和细胞杂交l （3）花药、花粉培养与单倍体植株 4、有助于遗传、生理生化、病理研究 5、保存种质资源 6、产业化生产u 八、人工种子l 将植物组培产生的胚状体包裹上用有机化合物和营养物质制作的人工种皮，就成了人工种子。u 人工种子的优点：l 1、快速繁殖，便于运输、贮藏；l 2、可以加入有益成分配制，更利于种子生长；l 3、可以固定杂种优势，加速良种繁育；
24、l 4、可作为植物基因工程和遗传工程的桥梁；l 5、可以保存珍贵品种。u 体细胞胚包埋制作人工种子的流程：l 选取目标植物从合适的外植体诱导愈伤组织形成愈伤组织转到液体培养基愈伤组织增生愈伤组织转到无激素培养基形成体细胞胚包裹人工种皮温室播种获得目标植物 影响体细胞胚发生：N源（Gly、NH4Cl） C源（蔗糖、果糖） 基本培养基：MS或改良MS培养基u 人工胚乳及人工种皮的理想包埋材料应具备下列特性：l 1、无毒、无害，有生物相容性，能支持胚状体；l 2、有一定透气性、保水性，既不造成人工种子在贮藏保存过程中丧失生活力，又能保证其将来正常萌发生长；l 3、有一定强度，能维持种子的完整性，便于
25、人工种子贮藏、运输和播种l 4、可容纳和传递胚胎发育所需的营养物质、生长和发育的控制剂、以及为延长贮藏寿命而添加的防腐剂、杀菌剂等u 人工种子的包埋剂：海藻酸盐、琼脂、白明胶、角叉菜胶、槐豆胶等。海藻酸盐是一种由古洛糖醛酸和甘露糖醛酸组成的多糖，在Ca2+等离子存在时，糖中的羧基和阳离子之间形成离子键，从而形成胶体颗粒。具有成胶容易、操作条件温和、使用方便、毒性极低、成本低廉、可防机械碰伤等优点，不足是保水性较差，表面易结团、营养成分易流失。如用磷酸、柠檬酸、EDTA等离子复合剂处理，胶体颗粒又会释放出细胞。u 海藻酸盐包埋制作人工种子具体操作：v 先配置一定浓度的海藻酸钠溶液，比如2%，高温
26、高压灭菌，将植物细胞悬浮液与海藻酸钠溶液混合倒入注射器中，然后慢慢滴入含有CaCl2的培养基中，不断搅拌就会形成球形颗粒，过滤收集颗粒，用含有的Ca2+培养基清洗，转入摇瓶中进行培养。u 九、植物组织与器官的生物反应器培养l 气升式生物反应器、自旋过滤式反应器u 十、植物组织与器官培养存在的问题l 1、研究：理论研究不够深入，且难培养植物研究不够l 2、技术：技术不够成熟，效率偏低，生物反应器技术不成熟，组培工业化、产业化尚未实现l 3、可应用性范围：很多有价值的植物未培育成功，应用范围较小第4节 植物细胞培养u 4.1定义u 4.2植物细胞培养的方法u 4.3植物细胞培养的培养基u 4.4植
27、物单细胞培养u 4.5植物细胞培养的应用u 4.6植物细胞的生物反应器大规模培养u 4.7植物细胞两相培养技术u 4.8植物细胞的生物反应器固定化培养u 4.9植物细胞培养存在问题与发展趋势u 一、定义l 在离体条件下，将愈伤组织或其他易分散的组织置于液体培养基中进行振荡培养，得到分散成游离的悬浮细胞，通过继代培养使细胞增殖，从而获得大量细胞群体的一种技术。l 植物中含有数量极为可观的次生代谢物质，是各种色素、药物、香精、酶等天然产物的主要来源。l 植物细胞培养具有以下优点：v 1、提高产率v 2、缩短周期v 3、提高产品质量v 4、易于管理，减轻劳动强度v 因此主要用于生产色素、药物、食品、
28、酶、精细化工产品等次生代谢物。紫杉醇是一种二萜类化合物，是一种新发现的细胞有丝分裂抑制剂，其作用机理在于阻止微管正常生理聚集，抑制癌细胞的有丝分裂和纺锤体的形成，从而使癌细胞的复制受到阻断而凋亡。广泛用于治疗卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌等十几种癌症，是20世纪后期最受人们重视的一种抗癌新药，被公认为是最有开发前途、最有效的抗癌药物，获汤姆森科技桂冠奖。u 二、方法l 琼脂培养l 固体培养细胞培养l 固定化培养（吸附、包埋等）l 摇瓶悬浮培养（实验室）l 液体培养 分批培养l 反应器大 半连续培养l 规模培养 恒化培养l 连续培养l 恒浊培养u 固定化培养：v 将细胞固定在载体上，使活细胞固定在
29、一定的空间范围内进行生命活动的技术。这种方法保持了细胞的生命活动能力，可以反复或连续进行培养，有利于提高生产能力和产物的分离纯化，并且省去了含酶细胞的处理过程，所需的酶系完整，方法简单，成本低。v 固定化技术有吸附法、包埋法、结合法、交联法等，通常采用包埋法，将细胞包埋在海藻酸盐或卡拉胶中。u 反应器大规模培养：v 1、分批培养：一次性添加培养液培养，期间不更换培养液。v 2、半连续培养：在培养过程中每隔一定时间更换一部分培养液或添加某种营养成分。又称流加培养。v 3、连续培养：连续地以一定速度添加培养液或营养盐，同时排出旧培养液，总培养液体积不变。u 连续培养：v 1、恒化培养2、恒浊培养相
30、关项目恒化培养恒浊培养装置恒化器恒浊器控制对象培养液流速培养液密度生长限制因子有无培养液流速恒定不恒定生长速度低于最高最高产物不同生长速度细胞大量细胞或与细胞生长平衡的代谢产物应用范围实验室为主生产为主u 三、培养基l 常用MS培养基，另外还有B5、N6、NT、AA、KM8p等培养基u 四、单细胞培养 1、制备方法l （1）机械法（机械磨碎、切割）l （2）酶解法（目前最有效的获得单细胞方法）l （3）愈伤组织诱导法（高频振动愈伤组织）u 2、培养方法 （1）平板法（似微生物平板培养） （2）看护培养与饲养层培养法l 看护培养：将单个细胞接种到滤纸上再置于愈伤组织之上进行培养。l 饲养层培养：
31、用处理过（如X射线）的无活性的或分裂很慢、不具分裂能力的细胞来饲养细胞。 （3）液体浅层静置培养法：将一定密度的悬浮细胞在培养皿中形成浅薄层，封口静止培养。 （4）悬浮法：将细胞接种到液体培养基中，在摇床或生物反应器中培养。目前多采用这种方法进行植物细胞大规模培养。u 成功的细胞悬浮培养体系应当满足3个基本条件：l 1、悬浮细胞分散性良好，细胞团较小；l 2、细胞均一性好，在倒置显微镜下观察，细胞形状和细胞团大小大致相同；l 3、细胞生长迅速，一般23天甚至更短时间可增加一倍。影响悬浮细胞生长的因素：1、 起始愈伤组织的质量2、 接种细胞密度3、培养条件：方式、温度、4、 继代周期u 愈伤组织
32、要求：松散性好，增殖快，再生能力强。其外观一般是鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒状，松散易碎。n 如何获得符合要求的愈伤组织？ 1、选择适宜的外植体：胚、胚轴、子叶是最常用的外植体，特别是幼胚。 2、选择适宜的培养基：生长素浓度很重要,配合一定浓度的细胞分裂素等。 3、愈伤组织要进行继代选择：选择疏松性好、生长状态好的细胞不断继代培养。基本的悬浮培养体系均是将细胞分散在一定容积的培养液中进行，在一个培养周期不添加培养基。这种培养体系基本是处于封闭状态。当一种营养物质耗尽时，细胞即停止生长。在这种悬浮培养体系中，细胞扩增生长成S形曲线。u 3、悬浮培养同步化方法 （1）物理法l 冷处理、体积选择
33、（2）化学法l 饥饿l 加尿苷抑制细胞分裂l 加秋水仙素抑制细胞有丝分裂细胞同步化：同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。植物细胞在悬浮培养中的游离性较差，容易团聚进入不同程度的分化状态，因此要达到完全同步化相当困难。低温法：冷处理可提高培养体系中细胞同步化程度。分选法：通过细胞体积大小分级，直接将处于相同周期的细胞进行分选，然后将同一状态的细胞继代培养于同一培养体系中。饥饿法：在一个培养体系中，如果细胞生长的基本成分丧失，则导致细胞因饥饿而分裂受阻，从而停留在某一分裂时期。抑制剂法：通过一些DNA合成抑制剂处理细胞，如尿苷等，使细胞滞留在DNA合成前期，当解除抑制后，即
34、可获得处于同一细胞周期G1期的同步化细胞。u 4、保存l （1）继代培养（高等植物、海藻等）l （2）低温（ 5 10）l （3）冷冻（ -20 或液氮）l 植物细胞冷冻保存方法：l 在冰浴条件下加入预冷的冰冻保护剂，密封，继续冰浴15min，在-40停留2h后投入-196液氮罐中保存。l 植物细胞冷冻保护剂组成：l 7.5%二甲基亚砜（DMSO）0.5molL山梨醇5%甘油5%蔗糖u 五、植物细胞培养的应用l 1、生产药用植物代谢产物（紫杉醇、苷类等）l 2、生产天然食品、食品添加剂（可可碱等）l 3、生产杀虫剂、杀菌剂（鱼藤酮、除虫菊脂） l 4、生产饲料、精细化工产品（桑叶、橡胶等）u
35、六、植物细胞的生物反应器大规模培养 1、培养特性l （1）细胞本身特性（生长慢、易结团、易损伤、易污染）l （2）培养液流变特性（黏度增高）l （3）气体传递与影响（O2与CO2需平衡）l （4）泡沫与器壁表面黏附性（气泡增多、黏度大、易黏附，可用硅油、脂肪酸酰胺等消除）l （5）悬浮细胞生长与增殖（静止期前继代）u 2、培养过程 （1）细胞的驯化、筛选与细胞株的建立l 愈伤组织诱导与培养单细胞分离细胞无性系分离细胞株筛选 （2）扩大培养l 采用逐级增加体积的容器将优良的细胞株经过多次扩大繁殖得到大量细胞，用作生物反应器培养的种子细胞。 （3）生物反应器培养u 3、植物细胞大规模生物反应器培养
36、l 搅拌式、鼓泡式、气升循环式u 4、植物细胞的生物反应器高密度培养l 例：培养紫草细胞、水母雪莲细胞u 5、植物细胞生物反应器培养存在的主要问题l 生长缓慢；次级代谢物含量低；培养细胞不稳定等；多数产物积累于胞内；不耐受剪切力。l 必须首先解决的重要问题：细胞生长及代谢途径基础研究、反应器结构与工艺优化u 七、植物细胞两相培养技术l 两相培养技术在培养体系中加入水溶性或脂溶性的有机物或者具有吸附作用的多聚化合物，使培养体系形成上、下两相，细胞在水相中生长，合成的次生代谢产物分泌出来后转移到有机相中的技术。其优点是：不仅减少了产物的反馈抑制作用，提高产物含量，而且通过有机相的回收循环使用实现了
37、连续培养。这种技术最初是应用于蛋白质提取、乙醇发酵及微生物培养上的。u 两相培养系统满足条件：l 1、添加的有机物或多聚化合物对植物细胞无毒，不会影响细胞生长。l 2、产物能比较容易被有机物吸附或溶解于有机相中。l 3、两相容易分离 l 4、有机物或多聚化合物不能吸收培养基中的有效成分。u 八、植物细胞的生物反应器固定化培养l 细胞固定化将游离的细胞包埋在多糖或多聚化合物制备成的网状支持物中，培养液呈流动状态进行无菌培养的一门技术。l 常用的固定化方法：吸附法、包埋法、结合法、交联法等。常采用包埋法，可以采用海藻酸盐、卡拉胶、琼脂、琼脂糖、角叉藻胶、白明胶等作为包埋剂。u 九、植物细胞培养存在
38、的问题与发展趋势 1、存在问题l （1）技术问题l 生物反应器设计缺陷多l 细胞易聚集分层、易变异l 放大培养不足l （2）经济方面l 成本高、工业化经济效益低 2、发展趋势l （1）高效细胞系的筛选l （2）发展大规模细胞培养所用的培养基，降低成本l （3）开发出适合植物细胞大规模培养的生物反应器系统l （4）两相培养、固定化培养技术是极具发展前景的技术l （5）对细胞分化、次生代谢产物和培养条件之间的关系进行基础研究第5节 植物原生质体培养u 5.1定义、特点及用途u 5.2原生质体的制备u 5.3原生质体的培养u 5.4原生质体的发育和植株再生u 一、原生质体n 1、定义l 在植物细胞中
39、除细胞壁以外的成分就称为原生质体，植物原生质体实际上就是除去细胞壁的裸露球形细胞。u 2、特点及用途l 含有核、质、膜及各种细胞器，只是没有细胞壁。方便进行各种遗传操作，并能摄取外源基因、细胞器、染色体、质粒、病毒、细菌等外源物质，是植物细胞工程进行遗传操作、基因转移的良好实验材料。也可以进行细胞生理生化研究，并且原生质体具有细胞全能性，能够再生出细胞壁并生长发育成完整植株，也可研究细胞壁的形成。另外也容易克服不同种细胞间的不亲和障碍，容易实现细胞融合和细胞杂交，培育新品种。u 二、原生质体的制备n 1、来源l 植物体的细嫩部分是制备原生质体的理想材料，比如双子叶植物的幼叶、子叶、根、下胚轴的
40、切段、花粉等。叶片由于取材容易而广泛采用，但单子叶植物特别是禾本科植物叶片表面常含有硅质不易被酶液降解，不适宜用来制备原生质体，通常用其组培产生的愈伤组织或悬浮培养的细胞。u 2、分离n （1）机械法（最初方法）l 先将材料放在高渗蔗糖溶液中使细胞发生质壁分离，最后原生质体收缩成球形完全与细胞壁脱离，此时用剪刀剪碎组织、切破细胞壁，使原生质体释放出来。这种方法操作难度大，产量低，费时费力，且无法从分生组织中分离得到原生质体。n （2）酶解法（常用方法）这是1960年英国诺丁汉大学的科金创立的分离制备大量植物原生质体的方法。利用从漆斑霉提取的纤维素酶粗制剂，从番茄幼苗根尖分离出大量原生质体。这种
41、方法条件温和、原生质体完整性好、活力高、得率高。制备原生质体常用的酶有：纤维素酶、果胶酶、半纤维素酶、琼脂酶、蜗牛酶等。n 例：科金分离制备番茄根尖原生质体方法步骤：l （1）取材消毒：l 将鲜嫩植物组织水洗后用70%酒精浸泡1min，再用8%次氯酸钠浸泡1min表面消毒，无菌水洗34次。l （2）酶解制备l 超净台上2528恒温水浴6090min。l （3）原生质体收集l 用300400目不锈钢网过滤酶解材料，弃去残渣，600r/min离心10min，弃上清，沉淀悬浮在0.16mol/LCaCl22H2O溶液中，缓缓注入20%蔗糖溶液，同速离心10min，收集两液面间原生质体带备用。u 3、
42、纯化l （1）过滤-离心法l 40100m网筛低速离心数次l （2）漂浮法l 25%蔗糖溶液中漂浮吸管l （3）沉降法与漂浮法结合l 低速离心21%蔗糖悬浮离心洗涤液离心（2次以上）u 4、鉴定 （1）低渗爆破（低渗吸水膨胀）l 吸水胀破后不成形真原生质体l 吸水胀破后保持一定形状带有部分细胞壁 （2）荧光染色（0.05%0.1%荧光增白剂）l 发红光真原生质体l 发绿光细胞壁未分解完全u 5、活力测定 （1）染色法（FDA、酚藏花红、伊文思蓝）l FDA（荧光素双醋酸盐）法：本没有荧光，能透过原生质膜，并在内酯酶作用下水解为不能排出、积累在质膜内的荧光素。l 发绿光活不发荧光死l 酚藏花红染
43、料法：不着色活红色死l 伊文思蓝染色法：不着色活蓝色死 （2）胞质环流法 （3）渗透压变化：吸水、失水活，不变死 （4）氧电极法：O2活，不变死u 三、原生质体培养l （1）液体培养法l （2）固体平板法l （3）双层培养法u 四、原生质体的发育和植株再生l （1）细胞壁再生l （2）细胞分裂l （3）愈伤组织或胚状体的形成l （4）植株再生（愈伤组织诱导、诱导胚状体）所采用技术的理论基础 植物细胞工程通常采用的技术手段 植物组织培养 植物原生质体培养与体细胞杂交植物细胞的全能性植物细胞培养 第三章小结：v 一、植物组织培养（概念、原理、培养条件、常用仪器、步骤、应用、人工种子等）v 二、植物细胞培养（概念、理论基础、方法分类、培养条件、常用仪器、制备方法、培养方法、保存方法、应用、固定化培养及方法等）v 三、两相培养技术（概念、优点、条件）v 四、植物原生质体培养（概念、用途、制备、培养、再生植株方法及技术路线等）思考题：1、什么是植物组织培养和细胞培养？有怎样的区别？2、举例说明植物组织培养的快速繁殖技术的步骤和方法。3、植物组织培养的主要意义有哪些？最新进展如何？4、
