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1、,八、 大孔吸附树脂分离技术,1、什么是大孔吸附树脂分离技术？,2、什么是大孔吸附树脂？,一、先提两个问题？,大孔吸附树脂吸附分离技术是以大孔吸附树脂为吸附剂，通过物理吸附从中药及其复方提取液中有选择性地吸附其中的有效部分，去除无效部分的一种提取纯化的新工艺，可以达到分离、富集中药有效部位或有效成分的目的。,大孔吸附树脂（Macroporous Resin，MR）是20世纪60年代发展起来的、继离子交换树脂之后的一类新型分离材料，是一类没有可解离基团，具有多孔结构，不溶于水的固体高分子物质。,性状：白色、乳白色至微黄色颗粒粒度：2060目。稳定性：不溶于水、酸、碱及有机溶剂，加热不溶，可在15
2、0以下使用。含水量：4075%。,1.1 主要理化性质,1.2 关于大孔,大孔吸附树脂是一种高分子聚合物，由聚合单体、交联剂、致孔剂、分散剂等添加剂经聚合反应制备而成。聚合物形成以后，致孔剂被去除，在树脂中留下了大大小小、形态各异、互相贯通的孔穴。孔形状是不规则的，将其看作近似圆形，其直径称为孔径。一般所说的吸附树脂的孔径都是平均孔径。,引申,大孔吸附树脂的分类,1、非极性MR：分子上不存在正负电荷相对集中2、中等极性MR：存在酯基一类的基团3、极性MR：存在酰胺基、亚砜、腈基等极性较大的基团4、强极性MR：存在吡啶基、氨基、氮氧基团等强极性基团,引申,1.3 关于吸附,吸附作用,内部分子之间
3、的相互作用均等；表面分子有一面没有受力；这部分分子存在吸引其他分子的剩余力，从而产生吸附作用。该吸附力可从溶液中吸附其他物质；被吸附的分子同时受到吸附剂表面的吸附力和溶剂的脱吸附力；一段时间之后，建立起吸附平衡。,比表面积,比表面积=表面积/质量 单位m2/g树脂颗粒的外表面积很小，一般在0.1 m2/g左右，但内部孔洞的表面积很大，可达500-1000 m2/g ，这是树脂良好吸附的基础。,二、吸附原理,大孔吸附树脂是吸附性和分子筛性原理相结合的分离材料。它的吸附性是由于范德华引力或产生氢键的结果。分子筛性是由于其本身多孔性结构所决定的。因此，有机化合物根据其分子量的大小及与大孔吸附树脂吸附
4、力的不同，在大孔吸附树脂柱上实现分离。,快写笔记,树脂孔径较大、比表面积越大，吸附量越大。,三、吸附规律,遵从类似物质吸附类似物的“相似相容”原则非极性MR宜于从极性溶剂中吸附非极性物质；强极性MR宜于从非极性溶剂中吸附极性溶质；中等极性MR，不但能从非极性溶液中吸附极性物质，也能从极性溶液中吸附非极性物质。,四、分离规律,分子量相似的成分极性越小，吸附能力越强，则越难洗脱下来；极性越大，吸附能力越弱，则越易洗脱下来。极性相似的成分分子量越大，越易洗脱下来。,六、大孔吸附树脂柱色谱的操作流程,6.1 认识一下大孔吸附树脂技术的基本装置,A 层析柱 B 部份收集器,恒流泵,A 前面 B 上面,装
5、置的连接,药液,水,洗脱剂,再生剂,分段收集,检测器/过程控制器,操作流程,树脂预处理上样吸附洗脱收集洗脱液回收、浓缩干燥成品,操作步骤树脂的预处理,预处理的目的：为了保证制剂最后用药安全，提高树脂洁净度。树脂中含有残留的未聚合单体，致孔剂，分散剂和防腐剂对人体有害。主要步骤用水除去水溶性杂质用有机溶剂除去脂溶性杂质再用吸附介质除去残留的其它溶剂，以免影响树脂的吸附量,预处理的具体方法方法1,乙醇检测：洗至流出液与等量水混合不呈白色浑浊为止,水洗检测：无醇味且水液澄清,乙醇与水交替洗脱2-3次洗脱剂用量为树脂体积的2-3倍最终以水洗脱,预处理的具体方法方法2,乙醇浸泡24h用乙醇洗至流出液与水
6、1：5不浑浊用水洗至无醇味5%HCl通过树脂柱，浸泡2-4h水洗至中性2%NaOH通过树脂柱，浸泡2-4h水洗至中性，备用。检查：取水洗脱液100ml，水浴蒸干后，加入12ml乙醇溶解，滴加水到乙醇溶液中，溶液中无白色浑浊现象。,预处理的具体方法方法3,树脂与有机溶剂一起在水浴上回流，直到洗涤液加水不显浑浊为止，最后用水洗掉所用有机溶剂，备用。,操作步骤树脂的装柱,通常以水为溶剂湿法装柱玻璃柱底部放少量的脱脂棉，厚度1-2cm树脂柱中加少量水，树脂中也加入少量水，搅拌均匀后一次性倒入保持垂直的柱中，倾倒树脂的同时，打开柱底部的阀门，让柱中水流出，树脂自然沉降。最后在柱床顶部加一层脱脂棉。,忌：
7、1、树脂和水分几次加入 2、干柱,将样品溶于少量水中，须为澄清溶液。预先沉淀、滤过处理，pH调节，使部分杂质在处理过程中除去，以免堵塞树脂床或在洗脱中混入成品。将柱中水放至接近柱床平面，将样品液以一定的流速加到柱的上端进行吸附，一边从柱中放出原有溶剂。注意控制流速。,操作步骤上样,先用水清洗以除去树脂表面或内部还残留的许多极性或水溶性大的强极性杂质（多糖或无机盐）然后用所选洗脱剂进行洗脱。一般是醇-水系统，逐渐增加醇的浓度。检测：洗脱的时候同时配合理化反应或薄层色谱检测，相同者合并。流速：流速过快，载样量少；分离效果差；速度慢，载样量大，分离效果好，实验周期长。一般1.5BV/h为佳。,操作步
8、骤解吸（洗脱）,对非极性MR：洗脱剂极性越小，洗脱能力越强极性MR：极性较强的溶剂洗脱能力强酸性化合物：碱解吸碱性化合物：酸解吸,再生的目的：除去洗脱后残留的强吸附性杂质，以免影响下一次使用过程中对于分离成分的吸附。简单再生的方法：一般是用无水乙醇或95%乙醇洗脱至无色后，树脂柱即已再生。然后用大量水洗去醇，可用于相同植物成分的分离。强化再生：若树脂颜色变深，可试用或稀酸（先浸泡、再淋洗，2-5盐酸，5-7BV ）+稀碱（先浸泡、再淋洗，2-5NaOH，5-7BV）溶液清洗，最后水洗至中性。,操作步骤再生,注意：再生后树脂可反复进行使用，若停止不用时间过长，可用大于10%的NaCl溶液浸泡，以
9、免细菌在树脂中繁殖。一般纯化某一品种的树脂，当其吸附量下降30%以上不宜再使用。,分离的工艺一般经验,七、大孔吸附树脂分离效果的影响因素,MR的极性MR的孔径MR的比表面积MR的强度,物质的极性物质的分子大小,对被分离物质的溶解性溶剂pH上样溶剂浓度上样溶剂温度吸附流速,解吸剂种类解吸剂pH解析速度,7.1 大孔吸附树脂对分离效果的影响,1、极性“相似相吸”但MR与被分离物的极性不能过于相似，也不能相差过大。,2、孔径孔径与被吸附分子直径之比（2-6）1为宜太大浪费空间，比表面积小；太小，分子进不去，不利于吸附。,3、比表面积相同条件下，比表面积越大，吸附量越大。,4、树脂强度制备工艺决定。孔
10、隙率越高、孔体积越大，强度越差，使用寿命越短。,7.2 被分离物质对分离效果的影响,1、被分离物质极性“相似相吸”，决定了选择什么样的MR已知结构的物质，通过极性基团与非极性基团的数目和大小来判断未知结构的物质，通过预实验、薄层色谱、纸色谱等色谱行为来判断,2、被分离物质分子大小根据物质大小选择适宜孔径的MR一般来说，分子体积越大，疏水性增加，对非极性MR的吸附力越强,7.3 上样溶剂的性质对分离效果的影响,1、溶剂对被分离物质的溶解度成分在溶剂中溶解度大，在该溶剂中，对MR吸附力小,2、溶剂pH酸性化合物在酸性溶液中吸附碱性化合物在碱性溶液中吸附中性在近中性,3、溶剂浓度浓度增加，吸附量增加
11、，但不能超过MR的吸附量,4、上样温度温度太高影响吸附，50,5、吸附流速20mL/min为宜,溶液pH,树脂对某种物质的吸附，特别是对生物碱和黄酮类物质的吸附，很大程度上受它的解离程度的影响。对非极性吸附树脂来讲，酸性物质在酸性条件下，以分子形式存在，易被树脂吸附.在碱性环境下，以离子形式存在，物质不易被吸附。,吸附液的浓度,对于一定量树脂，浓度太低，尽管吸附效率高，但是不能完全发挥树脂的作用，浪费树脂且生产效率低；浓度太大，树脂的吸附容量增加，但同时泄漏较多，造成了药液的浪费。所以在生产过程中，为了提高生产效率且不造成浪费，单柱吸附时，上柱液含生药量以在泄漏点附近为宜；若多柱串联吸附上柱液
12、含生药量以接近饱和点为宜。,吸附流速,流速过快时，树脂与被吸附物质分子间来不及充分接触，致使分子不能充分扩散到树脂内表面，就随着上样液一起泄露出去，所以造成了随着流速的增加，吸附量下降，泄漏量增大的现象。在实际生产操作中，从尽量缩短吸附时间和增大吸附量的角度出发，应根据不同的吸附柱选择最佳的流速。一般上样时控制流速在20mL/min为宜。,7.4 解吸剂性质对分离效果的影响,解吸剂种类非极性MR采用非极性溶剂洗脱；极性MR同理,2. 解吸剂的pH弱酸性物质用碱液洗脱；弱碱物质采用酸液洗脱,3. 解吸速度0.5-5mL/min为宜。,玻璃柱粗细,在分离、纯化过程中，玻璃柱子的粗细影响分离结果，当
13、柱子太细，有机溶剂洗脱时，树脂易结块，柱子壁上有很多气泡，使得流速越来越慢、到最后流速几乎为零，所以选用柱子时不能选用太细的玻璃柱。,此外，还有一点需要我们注意,八、大孔吸附树脂分离工艺条件考察,大孔树脂的泄漏（穿透）曲线与吸附容量的考察大孔树脂的解吸曲线与解吸率大孔树脂的再生树脂分离工艺的验证实验,解吸率的测定解吸剂种类的确定解吸剂pH的确定解吸速度的确定解吸曲线的绘制,8.1 泄漏（穿透）曲线与吸附容量,泄漏曲线：大孔树脂的吸附有一定的吸附容量，当吸附达到饱和的时候，对目标物质的吸附减弱甚至消失，此时化学成分即泄漏（穿透）流出。将提取液按少量多次的原则，在确定的吸附条件下以一定的流速分次通
14、过树脂床，收集流出液，分析药物组分，若在某一时段收集的流出液中测得该提取液目标组分，则从开始到此时所上样的药液体积总和就是树脂在该吸附条件下对这一药物组分的泄漏点,吸附量的测定 静态吸附法:,准确称取经预处理的树脂适量，置适宜的具塞玻璃器皿中，精密加入一定浓度的欲分离纯化的植物提取物的水溶液适量，置恒温振荡器上振荡，震动速度一定，定时测定药液中药物成分的浓度，直至吸附达到平衡。计算吸附量Q. Q=(C0-Cr)V/W Q为吸附量，C0为起始浓度，Cr为平衡浓度，V为溶液体积，W为树脂质量,将等量已预处理的树脂适量，装入树脂吸附柱中，药液以一定的流速通过树脂床，测定流出液的药物浓度，直至达到吸附
15、平衡。计算树脂的比上柱量(S)，然后用去离子水清洗树脂床中未被吸附的非吸附性杂质，计算树脂的比吸附量(A)。静态法较动态法简单，可控性强，但动态法更能真实反映实际操作的情况。,吸附量的测定 动态吸附法:,两个重要的概念比上柱量：达到吸附终点时，单位质量吸附树脂吸附夹带成分的总和。S=(M上-M残)/M比吸附量：单位质量干树脂吸附成分的总和。A=(M上-M残-M水洗)/MM为干树脂质量；M上为药液中成分质量；M残为上柱流出液中成分质量；M水洗为蒸馏水洗脱下来的成分质量,评价树脂吸附、承载能力的重要指标，也是确定树脂用量的参数。,评价树脂真实吸附能力的指标，同时也是选择树脂种类、评价树脂再生效果的
16、参数。,由于树脂极性不同，吸附作用力强弱不同，解吸难易也不同，若吸附过强，解吸太难，解吸率过低，产品回收率低，损失太大，即使吸附量再大，也无实际意义。,8.2 大孔树脂的解吸曲线与解吸率,取充分吸附的各种树脂，分别精密加入解吸剂，解吸平衡后，滤过，测定滤液中吸附成分的浓度。根据吸附量计算解吸率。,解吸法-静态法,解吸法-动态法,将解吸剂以一定的速度通过树脂床，同时配合适当的检测方法以确定解吸终点，然后测定解吸液中药物的浓度。根据吸附量计算解吸率。注意：采用动态法时，如洗脱液浓度较大，应采用梯度洗脱。,解吸率的测定,D(%)=CdVd /(Co-Ce)Vi 100%,D为解吸率Cd解吸液浓度Vd解吸液体积Co起始浓度Ce剩余浓度Vi溶液体积,注意：解吸效果的评价不能只以解吸率的大小来衡量，而应结合产品的纯度和比洗脱量对所选用的树脂和解吸剂作比较全面的评价。,比洗脱量：树脂吸附饱和后，用一定溶剂洗脱至终点，单位质量干树脂洗脱成分的质量。E=M洗脱/WE为比洗脱量；M洗脱为洗脱成分的质量，W为干树脂的质量。,解吸剂种类的确定解吸剂pH的确定解吸速度的确定解吸曲线的绘制,解吸工艺还需要考察：,其余条件明确的前提下，梯度洗脱，分段收集解吸液，测定浓度，绘制解吸曲线。一般解吸曲线越尖锐，不拖尾，解吸率越高，解吸效果越好。,
