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1、人类基因组DNA提取及琼脂糖凝胶电泳分析,中南大学生命科学学院,第一节 实验目的,掌握人类基因组DNA提取的基本原理和方法,掌握琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA方法,第二节 实验原理,核酸提取思路：,破膜：细胞膜、核膜 分离：通过酶，有机溶剂，调节pH值，离心等 纯化：去除杂质,DNA提取原则：,保证DNA一级结构的完整性 排除其他分子的污染，使其纯度尽可能高 排除有机溶剂和金属离子的污染 蛋白质、多糖、脂类等降低到最低程度 排除其他核酸分子的污染,样品来源：,培养细胞 组织标本 血液样本,用细胞裂解液裂解细胞膜，收集细胞核，加入SDS破裂核膜，用蛋白酶K使核蛋白降解成小片段并从DNA上解离下来
2、，经苯酚氯仿抽提去除蛋白质，无水乙醇沉淀DNA，75%乙醇洗涤DNA沉淀，真空干燥后，溶解于TE中即得到高分子量的DNA。,本次实验使用的试剂盒系直接加入裂解液裂解细胞后，用蛋白酶K使核蛋白降解成小片段并从DNA上解离下来，再利用特殊硅基质膜吸附DNA的特性，可快速、高效地纯化回收基因组DNA。,离心吸附柱内的硅基质膜在高盐，低pH值状态下选择性地结合溶液中的DNA，再通过漂洗液将杂质去除，最后低盐，高pH值的洗脱缓冲液或去离子水将DNA从硅基质膜上洗脱。,高盐，低pH值：选择性结合DNA,漂洗,低盐，高pH值：DNA从硅基质膜上洗脱,第三节 主要试剂,主要试剂,培养细胞 RNase A（10
3、0mg/ml） ProteaseBuffer GR Buffer GL 无水乙醇 Buffer GW1 Buffer GW2 Buffer GE,第四节 主要仪器,微量移液器,台式微量离心机,电泳仪,凝胶成像系统,主要仪器,LIFE,第五节 操作步骤,1.样品处理：取1管细胞，做好标记，5000rpm离心3分钟，弃上清，收集细胞。,3.向以上溶液中加入20 l Protease K，混匀。,4.加入200 l Buffer GL，颠倒混匀15次，剧烈震荡至少1分钟。 注意：不要直接将Protease直接加入到Buffer GL。,5. 56孵育10分钟，其间颠倒混匀数次,6.加入200 l无水
4、乙醇，颠倒混匀10次，剧烈震荡。短暂离心，使管壁和壁盖上 的液体集中到管底。,第五节,操作步骤,7.将步骤5所得溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱中，一次不能加完溶液，可分多次转入。12,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中废液，吸附柱重新放回收集管中。,2.加入200l GR，用移液器反复吸打几次，使细胞悬浮。,10.吸附柱置于一个新的离心管中，向吸附柱中间部位悬空加入60l Buffer GE， 室温放置2分钟，12,000 rpm离心1分钟，收集DNA溶液，-20保存DNA。,7.向吸附柱中加入500 l Buffer GW1，12,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的 废液，将吸
5、附柱重新放回收集管中。,8.向吸附柱中加入500 l Buffer GW2，12,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的 废液，将吸附柱重新放回收集管中。,9.10,000 rpm离心2分钟，倒收集管中的废液。吸附柱置室温2分钟，以彻底晾干。,第五节,操作步骤,11.取5 -10l基因组DNA，并加入2 l上样缓冲液，混匀，加样到1琼脂糖凝胶点样孔中，电泳检测分析。,第六节 注意事项,（1）试剂配制及保存规范，离心管及Tip头需经高压灭菌处理。,（2）基因组DNA长而弯曲，易断裂。操作过程中尽量轻缓，避免过度的 溶液吹打转移，以及过高的温度。,第六节,注意事项,第七节 结果分析,第七节,结果
6、分析,量：越多越好。量越多电泳区带越明亮。质量： a. 纯度越纯越好。A260/A280越接近1.8越好 b. 分子量越大越好。DNA分子量大于30KB，可满足一般实验要求。1.0的琼脂糖凝胶电泳，理想电泳结果:靠近点样孔，落后于Marker最后一条区带(约21KB)的位置可见一条明亮的区带。区带前方，不应有拖尾（降解），或较弥散的小分子量区带（RNA）。,M: DNA/HindIII+EcoRI DNA Marker；1-5: 基因组DNA基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳结果图,第七节,结果分析,LIFE,课程相关资源,课程简介,课程简介,医学分子生物学-国家精品资源共享课，2013（http:/202.197.64.71:4505/）,医学分子生物学-国家精品课程(本科），2008（ http:/,生命科学学院资源共享平台（ http:/）,谢谢！,0731-8480 5449,
