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1、呼吸道病原体检测,呼吸道病原体检测,1,呼吸道病原体检测 呼吸道病原体检测1,呼吸道感染,呼吸道感染是指病原体感染人体的鼻腔、咽喉、气管和支气管等呼吸系统分为上呼吸道感染和下呼吸道感染,呼吸道病原体检测,2,呼吸道感染呼吸道感染是指病原体感染人体的鼻腔、咽喉、气管和支,上呼吸道感染,常见急性上呼吸道感染，指鼻腔、咽或喉部急性炎症的概称，是呼吸道最常见的一种传染病常见病因为病毒，少数由细菌引起。患者不分年龄、性别、职业和地区。不仅具有较强的传染性，而且可引起严重并发症,呼吸道病原体检测,3,上呼吸道感染常见急性上呼吸道感染，指鼻腔、咽或喉部急性炎症的,下呼吸道感染,包括急性气管/支气管炎、慢性支
2、气管炎、肺炎、支气管扩张等由病毒、细菌、支原体、衣原体、军团菌等微生物引起，其防治应遵循预防为主、准确诊断、及时治疗的原则，治疗时必须明确引起感染的病原体以选择有效的抗生素,呼吸道病原体检测,4,下呼吸道感染包括急性气管/支气管炎、慢性支气管炎、肺炎、支气,呼吸道病原体,常见的呼吸道病原体主要有病毒、细菌、支原体、衣原体和立克次体等据统计，90%以上急性呼吸道感染由病毒引起一种病原体可引起多种临床症状，同一临床表现可由多种病原体引起,呼吸道病原体检测,5,呼吸道病原体常见的呼吸道病原体主要有病毒、细菌、支原体、衣原,呼吸道病原体,细菌：细菌引起呼吸道感染的机会比病毒少。一旦感染，症状多较严重，
3、定位比较明显，如扁桃体炎、中耳炎、鼻窦炎等。由细菌引起的儿童肺炎往往是流感嗜血杆菌、肺炎链球菌或金黄色葡萄球菌,呼吸道病原体检测,6,呼吸道病原体细菌：细菌引起呼吸道感染的机会比病毒少。一旦感染,呼吸道病原体,病毒，包括鼻病毒、冠病毒、呼吸道合胞病毒、流感病毒、副流感病毒、腺病毒等,呼吸道病原体检测,7,呼吸道病原体病毒，包括鼻病毒、冠病毒、呼吸道合胞病毒、流感病,呼吸道病原体,支原体、衣原体感染导致的呼吸道感染与其它病原体感染的早期临床表现类似。可能在2-3天后咳嗽的症状会表现比较突出。在小于30岁的年轻人中，肺炎支原体是最重要的下呼吸道病原体,呼吸道病原体检测,8,呼吸道病原体支原体、衣原
4、体感染导致的呼吸道感染与其它病原体感,非典型呼吸道病原体,是指除肺炎链球菌以外的病原体，包括嗜肺军团菌(LP)、肺炎支原体(MP) 、肺炎衣原体(CP) 、Q热立克次体(贝纳柯克斯体) 、腺病毒(ADV) 、呼吸道合胞病毒(RSV) 、流感病毒(IFV)和副流感病毒(PIV)等,呼吸道病原体检测,9,非典型呼吸道病原体是指除肺炎链球菌以外的病原体，包括嗜肺军团,非典型呼吸道病原体,这些病原体变异快，传播广，由于不易形成长期免疫力而难以预防和控制,流感病毒 副流感病毒病毒 呼吸道合胞病毒 腺病毒,呼吸道病原体检测,10,非典型呼吸道病原体这些病原体变异快，传播广，由于不易形成长期,呼吸道病原体检
5、测,现有的主要方法：病毒分离培养抗原检测抗体检测分子生物学方法等,呼吸道病原体检测,11,呼吸道病原体检测现有的主要方法：呼吸道病原体检测11,检测方法的比较,呼吸道病原体检测,12,检测方法的比较检测方法优点缺点病毒分离培养特异性高，金标准培,抗体、抗原检测的比较,呼吸道病原体检测,13,抗体、抗原检测的比较抗体IgM检测病原体抗原检测检测最佳时间,IgMIgG,呼吸道病原体检测,14,IgM呼吸道病原体检测14,机体产生IgM一般需要一周左右的时间，而有免疫缺陷或免疫系统不健全的个体如儿童，特别是3岁以下的小孩，其产生抗体往往需要更久，且抗体产生的水平也较低若检测的是IgG，则不能很好地区
6、分既往感染和急性感染,呼吸道病原体检测,15,机体产生IgM一般需要一周左右的时间，而有免疫缺陷或免疫系统,因此，抗原检测的方法对婴幼儿和儿童的呼吸道感染的病因诊断、鉴别诊断和临床用药指导比抗体法更有优势检测抗体IgM比IgG更有临床意义,呼吸道病原体检测,16,因此，抗原检测的方法对婴幼儿和儿童的呼吸道感染的病因诊断、鉴,采样,抗原检测拭子伸入鼻部后向鼻咽部水平伸入，不是向鼻腔伸入。伸入距离为从耳垂部到鼻尖长度的一半，一般针对两周岁以下儿童，伸入距离约为拭子绒毛头的长度两倍拭子伸入后要轻轻捻动拭子转3圈。取样后在一小时之内洗脱到生理盐水中，12小时内送检,呼吸道病原体检测,17,采样抗原检测
7、呼吸道病原体检测17,抗原检测采样,呼吸道病原体检测,18,抗原检测采样呼吸道病原体检测18,采样,抗体检测,呼吸道病原体检测,19,采样抗体检测呼吸道病原体检测19,采样对结果影响较大非典型感染多为干咳，无痰/少痰阳性率低（标本问题，病毒颗粒小）抗原在体内存在时间短,抗原检测的劣势,呼吸道病原体检测,20,采样对结果影响较大抗原检测的劣势呼吸道病原体检测20,九项呼吸道感染病原体IgM抗体检测,呼吸道病原体检测,21,九项呼吸道感染病原体IgM抗体检测呼吸道病原体检测21,检测原理,间接免疫荧光法（IFA）是基于待测样本中的抗体与吸附在载玻片上的抗原发生的反应。样本中存在的特异性抗体和抗原反
8、应，未与抗原结合的免疫球蛋白在洗涤步骤中除去。在下一步骤中，抗原-抗体复合物与荧光素标记的抗人球蛋白反应，用免疫荧光显微镜观察结果,呼吸道病原体检测,22,检测原理间接免疫荧光法（IFA）是基于待测样本中的抗体与吸附,试剂盒组成,呼吸道病原体检测,23,试剂盒组成组分成分和用途载玻片检测的物理载体，覆有聚四氟乙烯,实验步骤1,样本的稀释：血清标本与PBS按1:1比例稀释稀释后的血清加入吸附剂中，彻底混匀。处理后的血清要离心10-15分钟除去沉淀，以防干扰检测,呼吸道病原体检测,24,实验步骤1样本的稀释：血清标本与PBS按1:1比例稀释呼吸道,实验步骤2,呼吸道病原体检测,25,实验步骤2呼吸
9、道病原体检测25,结果判断,呼吸道病原体检测,26,结果判断呼吸道病原体检测26,阴性结果荧光图谱,军团菌、肺炎衣原体和立克次体无荧光；支原体、腺病毒、甲型和乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒的细胞呈现红色,呼吸道病原体检测,27,阴性结果荧光图谱军团菌、肺炎衣原体和立克次体无荧光；支原体、,阳性结果荧光图谱,腺病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒或副流感病毒对阳性血清的1-15%细胞的细胞核、胞浆或胞膜出现苹果绿色荧光；军团菌、衣原体或立克次体中所有的细菌呈现出苹果绿色荧光；支原体对阳性血清在细胞外围呈现苹果绿色荧光,呼吸道病原体检测,28,阳性结果荧光图谱腺病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒或
10、副流感病毒,呼吸道病原体检测,29,病原体形态或荧光模式嗜肺军团菌杆状肺炎支原体细胞外围荧光模式,嗜肺军团菌,阴性：荧光弱、少、不规则,呼吸道病原体检测,30,嗜肺军团菌阴性：荧光弱、少、不规则呼吸道病原体检测30,嗜肺军团菌,阳性：荧光密集，且亮度较好，杆状形态,呼吸道病原体检测,31,嗜肺军团菌阳性：荧光密集，且亮度较好，杆状形态呼吸道病原体检,肺炎支原体,阴性：红色细胞周围无或少量荧光，亮度弱,呼吸道病原体检测,32,肺炎支原体阴性：红色细胞周围无或少量荧光，亮度弱呼吸道病原体,肺炎支原体,阳性：荧光占视野50%以上，亮度好，形态为明显的细胞膜或胞浆,呼吸道病原体检测,33,肺炎支原体阳
11、性：荧光占视野50%以上，亮度好，形态为明显的细,Q热立克次体,阴性：荧光弱、少、不规则,呼吸道病原体检测,34,Q热立克次体阴性：荧光弱、少、不规则呼吸道病原体检测34,Q热立克次体,阳性：荧光亮度强且数量多，形态典型,呼吸道病原体检测,35,Q热立克次体阳性：荧光亮度强且数量多，形态典型呼吸道病原体检,肺炎衣原体,阴性：荧光弱、少,呼吸道病原体检测,36,肺炎衣原体阴性：荧光弱、少呼吸道病原体检测36,肺炎衣原体,阳性：荧光密集，且亮度较好,呼吸道病原体检测,37,肺炎衣原体阳性：荧光密集，且亮度较好呼吸道病原体检测37,腺病毒,阴性：荧光弱、少,呼吸道病原体检测,38,腺病毒阴性：荧光弱
12、、少呼吸道病原体检测38,腺病毒,阳性：荧光亮度强且数量多，平均每个视野的阳性细胞3-5个,呼吸道病原体检测,39,腺病毒阳性：荧光亮度强且数量多，平均每个视野的阳性细胞3-,呼吸道合胞病毒,阴性：荧光弱、少,呼吸道病原体检测,40,呼吸道合胞病毒阴性：荧光弱、少呼吸道病原体检测40,呼吸道合胞病毒,阳性：荧光亮度强且数量多，平均每个视野的阳性细胞3-5个,呼吸道病原体检测,41,呼吸道合胞病毒阳性：荧光亮度强且数量多，平均每个视野的阳性细,甲型流感病毒,阴性：荧光弱、少,呼吸道病原体检测,42,甲型流感病毒阴性：荧光弱、少呼吸道病原体检测42,甲型流感病毒,阳性：荧光亮度强且数量多，平均每个
13、视野的阳性细胞3-5个,呼吸道病原体检测,43,甲型流感病毒阳性：荧光亮度强且数量多，平均每个视野的阳性细胞,乙型流感病毒,阴性：荧光弱、少,呼吸道病原体检测,44,乙型流感病毒阴性：荧光弱、少呼吸道病原体检测44,乙型流感病毒,阳性：荧光亮度强且数量多，平均每个视野的阳性细胞3-5个,呼吸道病原体检测,45,乙型流感病毒阳性：荧光亮度强且数量多，平均每个视野的阳性细胞,副流感病毒,阴性：荧光弱、少,呼吸道病原体检测,46,副流感病毒阴性：荧光弱、少呼吸道病原体检测46,副流感病毒,阳性：荧光亮度强且数量多，平均每个视野的阳性细胞3-5个,呼吸道病原体检测,47,副流感病毒阳性：荧光亮度强且数
14、量多，平均每个视野的阳性细胞,方法的局限性,抗体水平无显著上升时不能排除感染的可能性单一样本抗体检测结果不能帮助作出近期感染的诊断。应采集双份样本（急性期和康复期）同时检测来观察血清转化或抗体水平的明显升高,呼吸道病原体检测,48,方法的局限性抗体水平无显著上升时不能排除感染的可能性呼吸道病,方法的局限性,对患有自身免疫性疾病病人的血清，用IFA检测时，支原体、腺病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒，会在细胞上发生非特异性反应，这些血清不能用此方法评价质控孔用于检测这种现象,呼吸道病原体检测,49,方法的局限性对患有自身免疫性疾病病人的血清，用IFA检测时，,方法的局限性,在嗜肺军团菌和
15、Q热立克次体中，有时血清会含有与卵抗原反应的抗体，所以使用卵黄囊固定抗原会出现非特异性荧光。当出现这种情况时，该血清就不能用IFA进行分析了,呼吸道病原体检测,50,方法的局限性在嗜肺军团菌和Q热立克次体中，有时血清会含有与卵,临床实际效果图,呼吸道病原体检测,51,临床实际效果图呼吸道病原体检测51,呼吸道病原体检测,52,呼吸道病原体检测52,九联检,呼吸道病原体检测,53,九联检呼吸道病原体检测53,呼吸道病原体检测,54,呼吸道病原体检测54,呼吸道病原体检测,55,呼吸道病原体检测55,呼吸道病原体检测,56,呼吸道病原体检测56,呼吸道病原体检测,57,呼吸道病原体检测57,呼吸道病原体检测,58,呼吸道病原体检测58,思考题,质控孔的作用是什么？,呼吸道病原体检测,59,思考题质控孔的作用是什么？呼吸道病原体检测59,谢谢！,呼吸道病原体检测,60,谢谢！ 呼吸道病原体检测60,
