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1、基因工程药物-干扰素的制备,1,基因工程药物1,1 什么是干扰素,概念(interferon,IFN)：机体免疫细胞产生的一类细胞因子，是机体受到病毒感染时，免疫细胞通过抗病毒应答反应而产生的一组结构类似、功能接近的生物调节蛋白。根据分子结构和抗原性的差异分为、等4个类型。,2,1 什么是干扰素概念(interferon,IFN)：机体免,1.1天然干扰素的分类,1. 根据来源、基因序列和氨基酸组成分类 I 型干扰素：IFN、IFN、IFN 、IFN 来源：白细胞、成纤维细胞、病毒感染的组织细胞等 功能 ：抗病毒感染、抗肿瘤生长 、免疫调节(较弱） 其中IFN-为多基因产物，有23种以上的亚型
2、。 II 型干扰素：干扰素（IFN) 来源：活化的T细胞和NK细胞产生 功能：免疫调节,3,1.1天然干扰素的分类 1. 根据来源、基因序列和氨基酸组,提高单核巨噬细胞、树突状细胞的抗原提呈能力 增强Tc细胞和NK细胞的杀伤活性 抑制TH2细胞形成，下调体液免疫应答 趋化作用 抗病毒和抗肿瘤作用（次要） 2. 根据动物来源确定分类 人干扰素（HuIFN），小鼠干扰素（MuIFN）。,4,提高单核巨噬细胞、树突状细胞的抗原提呈能力,不同来源的干扰素,5,5,1.2 重组干扰素的临床应用,广谱抗病毒活性（rhuIFN） 慢性乙型、丙型、丁型肝炎；疱疹、病毒性角膜炎。直接抗肿瘤活性（rhuIFN）
3、毛细胞和慢性髓样白血病、 Kaposi肉瘤、非霍奇金淋巴瘤。免疫调节活性治疗慢性肉芽肿瘤（rhuIFN）多发性硬化症 rhuIFN,6,1.2 重组干扰素的临床应用广谱抗病毒活性（rhuIFN）,2 基因工程大肠杆菌发酵生产工艺,7,2 基因工程大肠杆菌发酵生产工艺7,干扰素生产工艺路线,上市产品：重组人干扰素rhuIFN 1986，rhuIFN-2a， rhuIFN-2b； 1990，rhuIFN-1b；1993，rhuIFN-1b； 20012002： PEG化IFN，PEG-Intron, Pegasys 表达产物：无糖基化，N-met，无活性包涵体工艺特点：发酵过程，随后变性、复性过程
4、。,基因工程大肠杆菌发酵生产工艺:,8,干扰素生产工艺路线上市产品：重组人干扰素rhuIFN基因工程,目的基因的分离,克隆载体,目的基因与克隆载体的体外重组,重组体导入大肠杆菌K12,受体菌的培养及筛选,从受体菌中获取目的基因,表达载体,重组质粒,导入大肠杆菌,受体菌的筛选，表达性、稳定性等检测,工程菌,基因工程菌的制备,9,目的基因的分离克隆载体目的基因与克隆载体的体外重组重组体导,一、目的基因的分离与扩增,1. 破碎细胞，用Trizol法提取总的RNA2. 将生产干扰素的人白细胞的mRNA分级分离然后进行凝胶电泳切取目的基因片段3. 用逆转录试剂盒逆转录，把总mRNA逆转录成cDNA4.
5、以cDNA为模板、干扰素引物为引物，PCR，得到完全的干扰素基因的PCR产物5.人工加尾形成“粘性末端”,10,一、目的基因的分离与扩增10,二、构建重组质粒,1. 提取载体（质粒、病毒等），双酶切，再把干扰素基因的PCR产物用相应的酶酶切，用连接酶连接,EcoR I,BamH I,EcoR I,BamH I,2.连接完成后分离纯化，测序，与原干扰素序列比对。 3.鉴定序列无误后，导入受体细胞，筛选,11,二、构建重组质粒1. 提取载体（质粒、病毒等），双酶切，再把,三、重组体引入宿主细胞,将cDNA克隆到含有四环素、氨苄青霉素抗性基因的质粒中，转化到大肠杆菌，重组的载体 DNA 分子在一定条
6、件下转化入大肠杆菌，形成携带质粒的菌株。,12,三、重组体引入宿主细胞 将cDNA克隆到含有四环素,四、受体菌的筛选,由于质粒重组时有3种基本方式，即：目的基因与克隆载体重组，目的基因片段与目的基因片段重组，克隆载体与克隆载体重组；另外重组过程可能会发生基因突变情况,13,四、受体菌的筛选 由于质粒重组时有3种基本方式，即：目,五、分析保存,对基因工程大肠杆菌进行评价分析，并保存菌种。,14,五、分析保存 对基因工程大肠杆菌进行评价分析，并保,干扰素的发酵工艺过程,启开种子 制备种子液 发酵培养 粗提 精提 半成品制备 半成品检定 分装 冻干 成品检定 成品包装,15,干扰素的发酵工艺过程15
7、,1菌种培养 取70下保存的甘油管菌种（工作种子批），于室温下融化。然后，接入摇瓶，培养温度30，pH7.0，250 r/min活化培养182小时后，进行吸光值测定和发酵液杂菌检查。2种子罐培养 将已活化的菌种接入装有30L培养基的种子罐中，接种量10%，培养温度30，pH7.0，级联调节通气量和搅拌转速，控制溶解氧为30%，培养34小时，转入发酵罐中，同时取样发酵液进行显微镜检查和LB培养基划线检查，控制杂菌,16,1菌种培养 取70下保存的甘油管菌种（工作,3.发酵罐培养 将种子液通入300L培养基的发酵罐中，接种量10%，培养温度30，pH7.0。级联调节通气量和搅拌转速，控制溶解氧30
8、%，培养4小时。然后控制培养温度20，pH6.0，溶解氧60%，继续培养56.5小时。同时进行发酵液杂菌检查，当OD值达9.01.0后，用5冷却水快速降温至15以下，以减缓细胞衰老。或者将发酵液转入收集罐中，加入冰块使温度迅速降至10以下。4. 菌体收集 将已降温的发酵液转入连续流离心机，16000 r/min离心收集。进行干扰素含量、菌体蛋白含量、菌体干燥失重、质粒结构一致性、质粒稳定性等项目的检测。菌体于20冰柜中保存时，不得超过12个月。每保存3个月，检查一次活性。,17,3.发酵罐培养 将种子液通入300L培养基的发酵罐中，,3. 干扰素的分离纯化工艺过程,3.1、干扰素分离工艺过程
9、3.2、干扰素的纯化工艺过程,18,3. 干扰素的分离纯化工艺过程 3.1、干扰素分离工艺,3.1 干扰素分离工艺过程,菌体裂解预处理初级分离,19,3.1 干扰素分离工艺过程19,(1)菌体裂解,裂解缓冲液：纯化水配制，210（pH7.5）使用保护剂：EDTA，PMSF。破碎菌体：2厘米以下的碎块搅拌：加裂解缓冲液，210，2hr冻融: 细胞完全破裂，释放干扰素。,20,(1)菌体裂解裂解缓冲液：纯化水配制，210（pH7,(2)预处理-沉淀,加絮凝剂聚乙烯亚胺: 210，搅拌45min，对菌体碎片进行絮凝。加凝聚剂醋酸钙溶液: 210,搅拌15min，对菌体碎片、DNA等进行沉淀。,21,
10、(2)预处理-沉淀加絮凝剂聚乙烯亚胺:21,(3)离心,连续流离心机：210，16000 r/min收集上清液：含有重组干扰素蛋白质杂质沉淀：121、30min 蒸汽灭菌,焚烧处理。,22,(3)离心连续流离心机：210，16000 r/mi,（4）初级分离,盐析: 硫酸铵，210，搅匀,静置过夜。离心：连续流离心机，16000 r/min保存：收集沉淀，粗干扰素，4保存。,23,（4）初级分离23,3. 2、干扰素纯化工艺过程,溶解粗干扰素沉淀与疏水层析 阴离子交换层析与浓缩 阳离子交换层析与浓缩 凝胶过滤层析无菌过滤分装,24,3. 2、干扰素纯化工艺过程溶解粗干扰素24,(1) 溶解粗干
11、扰素,配制纯化缓冲液： 超纯水，pH7.5磷酸缓冲液，0.45 m滤器和10 ku超滤系统，百级层流下收集。冷却至210。检查: 缓冲液的pH值和电导值。溶解：210，匀浆，完全溶解。,25,(1) 溶解粗干扰素配制纯化缓冲液：25,(2) 沉淀与疏水层析,等电点沉淀（1）：磷酸调节至pH5.0，沉淀杂蛋白，离心收集上清液。疏水层析：干扰素吸附在疏水层析柱中 除非疏水性蛋白 洗脱与收集：0.01M磷酸缓冲液（pH8.0）,26,(2) 沉淀与疏水层析等电点沉淀（1）：磷酸调节至pH5.,等电点沉淀（2）：磷酸调节pH4.5，调节电导值40 ms/cm，210，静置过夜超滤：1000 ku超滤膜
12、过滤，除去大蛋白。透析除盐：调整溶液pH 8.0，电导值，10 ku超滤膜，0.005 M缓冲液。,27,等电点沉淀（2）：磷酸调节pH4.5，调节电导值40 ms/,(3)无菌过滤分装,0.22 m滤膜过滤干扰素溶液分装20以下的冰箱中保存。,28,(3)无菌过滤分装0.22 m滤膜过滤干扰素溶液28,(4)检测项目,干扰素鉴别试验干扰素效价测定蛋白质含量，纯度测定，分子量宿主残余蛋白、残余DNA干扰素结构鉴定：紫外光谱，肽谱，N端序列其他：热原，内毒素，残留抗生素,29,(4)检测项目干扰素鉴别试验29,半成品检定,（1）效价测定 用细胞病变抑制法，以Wish细胞、VSV病毒为基本检测系统
13、，测定中必须用国家或国际参考品校准为国际单位。（2）蛋白质含量测定 福林-酚法，以中国药品生物制品检定所提供的标准蛋白为标准。（3）比活性 效价的国际单位与蛋白质含量的毫克数之比。（4）纯度 电泳纯度用非还原型SDS-PAGE法，银染显色应为单一区带，经扫描仪测定纯度应在95%以上。,30,半成品检定（1）效价测定 用细胞病变抑制法，以Wi,（5）相对分子量测定 还原型SDS-PAGE，加样量不地域微克，同时用已知相对分子量的蛋白标准系列做对照，以迁移率为横坐标，相对分子量的对数为纵坐标作图，计算相对分子量。与理论值比较，误差不得高于10%。（6）残余外源性DNA含量测定 用放射性核素或生物素
14、探针法测定，每剂量中残余外源性DNA应低于100pg。（7）残余血清IgG含量测定 在应用抗体亲和层析法作为纯化方法时必须进行此项检定。（8）残余抗生素活性测定 半成品中不应有抗生素活性存在。,31,（5）相对分子量测定31,（9）紫外光谱扫描 检查半成品的光谱吸收值，最大吸收值应在2802纳米。（10）肽图测定 用CNBr裂解法，测定结果应符合干扰素的结构，且批与批之间应一致。（11）等电点测定 等电聚焦电泳。（12）除菌半成品应做干扰素效价测定、无菌试验和热源质试验。,32,32,成品检定,（1）物理性状 冻干品白色或微黄色疏松体，加入注射水后不得含有肉眼可见不溶物。（2）鉴别试验 应用E
15、LISA或中和试验检定。（3）水分测定 用卡氏法，应低于3%。（4）无菌试验 同半成品。,33,成品检定（1）物理性状33,（5）热原质试验 同半成品检定。 （6）干扰素效价测定 同半成品检定，效价不应低于标示量。（7）安全试验 取体重为350-400克豚鼠3只，每只腹侧皮下注射量为成人每千克体重临床使用最大量的3倍，观察7天，若豚鼠局部无红肿、坏死、总体重不下降，说明成品合格。 取体重18-20克小鼠5只，每只尾静脉注射剂量按人每千克体重临床使用最大量的3倍，观察7天，若动物全部存活，说明成品合格。,34,（5）热原质试验34,4 国内基因工程药物产业发展状况,我国的生物技术药物却一直苦于缺乏自主创新的产品，绝大多数上市药物为仿制药，创新药物的开发一直未能打开局面。 一种新药从研发到投放市场，投入大约为30亿60亿美元。,35,4 国内基因工程药物产业发展状况 35,存在的问题：（1）同种产品生产厂家过多，造成市场恶性竞争， 严重影响产业的健康发展。（2）融资渠道单一、产业发展资金不足。（3）医药市场竞争无序，行业不正之风严重。（4）企业管理相对滞后，技术兼经营型人才匮乏。,36,存在的问题：（1）同种产品生产厂家过多，造成市场恶性竞争，,谢谢！,37,谢谢！37,
