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1、临床免疫定性试验室内质量控制,汪一萍,临床免疫定性试验室内质量控制 汪一萍,临床免疫检测类型,1）定量分析：确定被分析物的含量。 产生一个与待测分析物的浓度相关的光谱信号，如果有已知浓度的分析物制剂做校准，分析物的实际浓度就可以被确定。2）定性分析：只关注分析物的有或无，而不关心有多少即定量。 又分为用肉眼和经验判断结果的纯定性试验和用读数仪根据CUT OFF 值或域值判定结果的量值化定性试验。阳性结果只说明分析信号超过了分析阈值（检测限）或cut-off值（cut-off值的设定给出了简要的敏感性和特异性组合）。一般针对感染原和来自天然感染或免疫接种的相关抗体的出现相关的检测。,临床免疫检测
2、类型1）定量分析：确定被分析物的含量。,一 质控目的,为满足检测的目的而采取一定的程序和方法监控和维持检测方法学或试剂盒的性能指标稳定在一定范围内，这个范围由实验室依据行业标准、临床需求、制造商规定以及实验室的实际设置。 免疫定量分析的室内质控方法参照临床化学的执行，本节只针对用读数仪根据CUT OFF 值或域值判定结果的量值化的标记免疫定性试验如ELISA、发光技术定性试验等。,一 质控目的为满足检测的目的而采取一定的程序和方法监控和维持,分析性能（定性）,CLSI文件规定： 1 灵敏度（分析和诊断） 2 特异性（分析和诊断） 3 符合率（诊断效率） 4 重复性（总不精密度）,分析性能（定性
3、）CLSI文件规定：,CUTOFF值的确定和验证,CUTOFF值的确定和验证,临床免疫定性试验的性能指标,灵敏度(sensitivity )：（1）分析灵敏度（Analytical sensitivity）也可用检测限（Detection limit）表述是指可以将样品中分析物检出的最少分析物的量。（2) 诊断灵敏度(Clinical sensitivity)是指确诊的病人中检测结果为阳性或超过了检测限的病人的比例或指大量样本中阳性病人的检出能力。特异性（Specificity）：分析特异性指实验方法只检测目的构成物的能力；临床特异性指实验只对样本中的特异的分析物起反应而不对的其它物质有反应的
4、能力。,临床免疫定性试验的性能指标灵敏度(sensitivity ),阳性预测值（Predictive value of a positive）：实际患病的受试者实验结果为阳性的概率。阴性预测值（Predictive value of a negative）：实际未患病的受试者实验结果为阴性的概率。符合率（Efficiency）：阳性或阴性结果中真实值的比例。精密度（Precision）：在规定条件下,各测定值的符合程度。精密度不是作为数值来表示的，而是在数量上以不精密度的方式表示一系列重复检测结果的s和cv。,阳性预测值（Predictive value of a po,定性免疫检测的用途,
5、筛选试验 用来检测全体人群或人群亚群一个特征的出现（如感染原或相关抗体的出现）。 一般要求趋向二个极端： 要么有高的临床敏感性（即超过95%的临床检出率），检测结果保证阴性筛选结果具有高可能性的没有这些特征，而阳性结果可能需要做进一步的确证试验；血站系统的传染病筛查属于此类。 要么有高的特异性，检测结果保证阳性筛选结果具有高可能性的具有这些特征。,定性免疫检测的用途筛选试验,诊断试验 用来评价具有可疑给予特征（如一种感染的特殊类型）的人。 敏感性和特异性应该处于相对平衡状态。如果此特征对治疗或预后考虑很重要，那么敏感性要尽可能的高；而且后续已有准确的确证试验，可以不需要高的特异性。 感染性疾病
6、的大多数临床试验是用于诊断。,诊断试验,确证试验 获得筛选或诊断试验阳性结果后，增加的试验用于证明和确认此人前面的阳性结果。在这种情况下，主要考虑的性能常常是特异性和阳性预测值，而不是敏感性和阴性预测值；特异性应该超过98到99%。确证试验可以是非免疫化学的（如，培养或脱氧核糖核酸研究）或免疫化学的（包括免疫印迹和抗原或抗体中和试验）。 如果筛选和诊断试验已具有高的特异性和阳性预测值，则不需要确证试验。,确证试验,定性试验质控课件,Recommendations and Reports,HIV抗体筛查试验流程图,HIV抗体筛查试验流程图,病毒性肝炎诊断检测路线,病毒性肝炎诊断检测路线,英国HB
7、V血清学诊断的SOP(V.SOP6),HBsAg AssayNegativeReaciveRepo,定性试验质控课件,定性试验质控课件,CUT OFF 值的选择,一个试验一般不可能有完全的（100%）敏感性、特异性或预测值。Cut off值的选择和来自一个检测的结果报告应该考虑这些性能指标哪个更重要。 下面是Galen和Gambino推荐的标准：（1）当疾病是严重的，并且是可治疗的，应该不能漏检；当假阳性结果不会导致严重的精神或经济创伤；和不合适的治疗有轻微的后果（如没有青霉素变态反应的，A群链球菌快速试验阳性个体的治疗）需要高敏感性。（2）当疾病是严重的，但是不能治疗；当没有疾病时具有心理或
8、公众健康价值；或如果假阳性结果可能引起严重的精神或经济上的创伤（如HIV抗体的确证试验）需要高特异性。,CUT OFF 值的选择一个试验一般不可能有完全的（100,（3）当不合适的治疗可能导致严重后果，需要高预测值（如因为抗-风疹抗体水平的增加治疗失败）。（4）当疾病严重但是可治疗，并且假阴性或假阳性结果同样严重（如引起脑膜炎细菌抗原的分析）需要高符合率。在确定这些因素的合适平衡点时，厂商或其它检测的研发者应该用来自三种人群的样本评估检测的性能：感染疾病的人，没有疾病的健康人和非讨论疾病患者的病人。厂商应该标明推荐的cut-off值是怎么定义的以及在什么样的人群应用。理想状态，实验室应该在自己
9、的人群中确定区间和cut-off值。,（3）当不合适的治疗可能导致严重后果，需要高预测值（如因为抗,定性试验质控课件,CUT OFF 值的验证,目前已经有一系列CLSI的文件用于评价或验证免疫分析性能特征的一般研究工作，包括定性分析（cutoff和/或校准曲线的有效性）、定量和半定量分析（确定检出的高限和低限及线性）以及精密度、抗凝剂影响、交叉反应、干扰实验、最小检出浓度和与比较方法相关的偏倚（或对参考测量程序的溯源能力）等。一种分析方法和一个试剂盒的分析性能的确认，由生产者完成。评价方需应用各种PANEL（包括亚型全面性、突变检出能力等）通过实验得出结论。血清PANEL的种类较多，如血清转换
10、panels、参考方法血清panels、权威机构特性panels、Challenge panels包含来自有和没有关心的疾病个体的样本以及待检分析物的不同水平。以及导致假阴性或假阳性结果的来自已知有疾病且可能干扰分析的病人的样本，如多发性骨髓瘤、风湿性关节炎、系统性红斑狼疮和其它自身免疫性疾病；与相关病原有关的感染性疾病（如检测莱姆病的panels应该合并梅毒和其它螺旋体疾病）；和异嗜性抗体等 。常规实验室建议通过验证CUT OFF 值来实现分析性能的验证，因为CUT OFF 值已经确定了该方法或试剂盒的灵敏度和特异性等性能。,CUT OFF 值的验证 目前已经有一系列CLSI的文件用于,依据
11、,国际行业标准：EP12-A User Protocol for Evaluation of Qualitative Test Performance; I/LA2-A2 Quality Assurance of Laboratory Tests for Autoantibodies to Nuclear Antigens: (1) Indirect Fluorescence Assay for Microscopy and (2)Microtiter Enzyme Immunoassay MethodsI/LA18-A2 Specifications for Immunological Te
12、sting for Infectious DiseasesI/LA21-A Clinical Evaluation of ImmunoassaysI/LA23-A Assessing the Quality of Immunoassay Systems: Radioimmunoassays and Enzyme,Fluorescence, and LuminescenceImmunoassaysI/LA30-P Immunoassay Interference by Endogenous Antibodies,依据国际行业标准：,确认（ validation, where the specif
13、ied requirements are adequate for an intended use 确认，对于预期的用途，有充分规定要求） ： 适用厂商（Are we producing the right product? 我们生产的是正确产品吗？）验证 （verification， provision of objective evidence that a given item fulfils specified requirements 提供客观证据证明特定项目符合规定要求）： 适用用户（ Are we producing the product right? 我们生产的产品正确吗？
14、）,确认（ validation, where the spec,1 IU/ml=0.58PEI/ml=1.93“法国”ng/ml=5.59雅培ng/ml,1 IU/ml=0.58PEI/ml=1.93“法国”ng/,定性试验质控课件,定性试验质控课件,定性试验质控课件,定性试验质控课件,定性试验质控课件,定性试验质控课件,定性试验质控课件,摘自中国输血杨芳，邢文革等,摘自中国输血杨芳，邢文革等,定性试验质控课件,CUT OFF值的验证方法（1）阴性来源： 选择没有疾病的健康人和非讨论疾病患者的病人的新鲜血清共120份，分3-5批3-5天进行检测，计算X、s， CUT OFF验证值为： X+3
15、s；（2）阳性来源： 选择弱阳性（CUT OFF 值20%）新鲜血清或质控血清共120份，分3-5批3-5天进行检测，计算X、s， CUT OFF 值验证值为:X-3s。,CUT OFF值的验证方法,定性试验质控课件,按照EP12文件找C50会出现给定C50与实测C50的区别应用的前提是以含量为基础，在C5和 C95间有线性关系infection. for many microbiological qualitative tests is no recognized reference material. For many such antigen or antibody tests, Use
16、rs must then rely on the labeling provided by the manufacturer for specific information on how the cutoff or limit of blank was established; or gain experience with the device in their patient population to correlate test results with clinical findings.,按照EP12文件找C50,CUT OFF验证值用于（1）灰区的设定；（2）Leuey-Jen
17、nings质控框图的控制限确定。美国CAP要求CUT OFF值每六个月验证一次，我们建议更换试剂批号就应进行验证。实验室为适应这样的要求可以调整订购试剂的习惯，尽量在较长一段时间内使同一批号的试剂。,CUT OFF验证值用于,定性试验质控课件,定性试验质控课件,定性试验质控课件,定性试验质控课件,质控物的选择,基质：应尽量选择人血清基质，工程菌或动物源性的基质由于人体内有大量的异嗜性抗体的存在引起非特异或中和反应造成假失控。稀释液也应用人血清，冻干品复溶可以使用生理盐水，避免使用动物源性的小牛血清等。稳定性：室内质控需要观察一段时间，一般选择生产者声明在一定保存条件下如2-8或-20以下有效期
18、为6个月以上。要特别注意开瓶有效期和冻干质控物复溶后分装瓶的有效期与原装瓶有效期的区别，通常前二者的有效期要短许多。实验室应对这些有效期进行验证。,质控物的选择 基质：应尽量选择人血清基质，工程菌或动物源性的,质控物数量、实验位置和频次：质控物数量应满足一个批号至少半年的实验量。每分析批至少安排一个弱阳性和一个阴性质控，检测位置不能固定而应随机放置。试剂盒所设的阴、阳性内对照是用来计算CUT OFF值或阈值的，也有相应的有效性判断标准，但只能在同批号试剂内使用，不能作为质控指标，质控必须是可以监控到不同批号试剂间的变化的外对照。浓度范围：应围绕该CUT OFF值选择。一般建议阳性质控物浓度为2
19、CUT OFF 值左右，阴性质控物浓度为0.5CUT OFF 值左右。高值或超高值阳性血清是用来监控“HOOK效应”的，应该在引进分析方法或试剂盒时评价，不需要长期监控，同时其测定值远高于CUT OFF 值对边缘结果的监控也无任何价值。,质控物数量、实验位置和频次：质控物数量应满足一个批号至少半年,灭活：尽管所有的制造商或生产者均声明对已知的经血传播的病原体如乙肝、丙肝、艾滋、梅毒等病原体进行了灭活处理，但应把质控物视为有传染性，因为可能存在灭活不完全以及其他未知的传染性，实际工作中应按生物安全防护的规定进行操作。,灭活：尽管所有的制造商或生产者均声明对已知的经血传播的病原体,冰冻血清的融化和
20、冻干品复溶：免疫活性的质控血清一般需在-20以下长期保存，从冰箱取出后建议室温自然融化，一次性使用可以37水浴或孵箱快速融化，轻柔地颠倒混匀5次以上；融化的血清置4-8保存，而不应该再次-20以下保存、反复冻融。冻干质控品用生理盐水（非蒸馏水，除非有特殊说明）复溶，按规定的量准确（应保证每瓶操作的一致性）加入质控品容器中，盖盖后轻柔地颠倒10次以上，保证充分溶解和混匀；安琣瓶应先轻敲摇晃使顶部的冻干粉掉入底部，用砂轮划开颈部轻敲顶部使其掉落在锐器盒中，加样器加生理盐水后反复抽吸10次以上。所有操作应避免气泡产生。复溶后的质控品置4-8保存，也可分装小份置-20以下保存，只允许冻融一次。融化、复
21、溶、分装后的血清均在标签上标志操作日期、有效期和操作者。,冰冻血清的融化和冻干品复溶：免疫活性的质控血清一般需在-20,自制质控品,大量的临床免疫项目无商品化的质控物供应，实验室需自制，其步骤为：1 收集阳性血清(无明显溶血、黄胆、脂肪血和污染血清)到一定量（至少够本室使用6个月以上的量）；2 传染性病原体需经56、10小时灭活后使用；3 0.2m生物滤膜过滤，去除纤维沉淀物和细菌；4 稀释，用正常人血清稀释；5 测定值，与定值参考品进行对比、求值，无参考品时选择在2倍Cut Off值附近的阳性值；6 分装小瓶（每日用量），加盖、贴签，-20冻存备用；7 稳定性及瓶间差评价。,自制质控品大量的
22、临床免疫项目无商品化的质控物供应，实验室需自,Levey-Jennings质控图,横坐标（X轴）：每个点表明的是分析批或检测日期，当检测日有多个批次时都应标出。分析批是指测试系统的准确性、精密度保持稳定的一个间隔,一般不超过24小时。ELISA等板式试验应把每块板视为一个分析批；发光等均相免疫试验当一个质控失控，采取了纠偏措施后当天再次做的质控应视为另外的一个分析批，需在质控图上标出。统计学要求至少20个数据才具统计意义，因此在点新的质控点时应保留以前至少19个点，才能观察和分析该点是否在控。质控图横坐标不需要也不应该固化从每月的1日至31日，只要求每月统计s和cv判断是否满足实验室规定的质量
23、目标和质控目的。只有当质控物批号改变时才重新绘制新的质控图，而不能随试剂批号的改变而制作新质控图。,Levey-Jennings质控图 横坐标（X轴）：,定性试验质控课件,定性试验质控课件,纵坐标（Y轴）： 用吸光度值或含量点图，不推荐用S/C.O点图。至少要引出中心线质控物靶（均）值和上下失控限三条线。中心线：靶值这个词特别容易造成歧义，实验室会误认为定值质控物提供的“靶值”就是绘制质控图中心线的靶值，用质控物均值来表示中心线更恰当。质控图的Y轴中心线应用实验室测定的质控物加权均值作图，无论是定值还是未定值质控物均如此。在启用新批号的质控物时应先与旧批号质控物平行检测3批以上，启动即刻法（G
24、rubbs法）质控规则，建议使用2s规则；至有了20个数据后转入常规的质控方法。,纵坐标（Y轴）：,失控限：临床免疫检验的质控目的就是保证检测结果阳性就是阳性、阴性就是阴性，但其方法和试剂由于免疫学的特性、原材料等生产工艺问题使其变异较大，一般批内cv超过15%，而且免疫反应的曲线是非线性的，Westgard质控规则并不完全适合。,失控限：临床免疫检验的质控目的就是保证检测结果阳性就是阳性、,偶然误差的失控规则不能简单地使用13s或武断地使用12s判断是否在控。利用cut off验证值可以直接确定上下失控限，公式为：,偶然误差的失控规则不能简单地使用13s或武断地使用12s判断,例如：某批号的
25、ELISA乙肝表面抗原试剂的cut off值为0.105，其验证值为0.067，阳性质控物均值为0.215，则阳性失控上限为： 0.2151+（0.105-0.067）/0.105=0.292； 阳性失控下限为： 0.2151-（0.105-0.067）/0.105=0.137。 在Y轴上的三个点为：0.292、0.215、0.137。同样，阴性质控物的均值如为0.058，则应用阳性失控限公式得到的cut off 验证值比例为36%，计算得到阴性质控在Y轴上的三个点为：0.079、0.058、0.037。,例如：某批号的ELISA乙肝表面抗原试剂的cut off值为,系统误差的失控规则可以选用
26、41s和/或10 x，也就是要求质控图始终保留20个点以上的原因。阴、阳性质控物的测定值均应在质控图中标出：阳性重点是下限，阴性重点是上限，这样的单个超限判为失控；阴、阳性同时上限或同时下限超限判为失控；阳性上限超限而阴性未超或阴性下限超限而阳性未超，可以视为不失控。,系统误差的失控规则可以选用41s和/或10 x，也就是要求质控,定性试验质控课件,纯定性试验的质控要求,临床免疫纯定性试验大都属于CLIA88豁免的技术（waived testing sites），包括免疫沉淀、凝集试验、标记免疫的金标试纸和斑点渗滤、免疫荧光印迹法等等。对于FDA等批准家庭使用的技术，只要求检测装置有内对照，检
27、测结果满足说明书规定即可；对于需要经验来判定结果的技术仍需在实验室进行，均有质控的要求，但国际上无具体操作的规定和资料。,纯定性试验的质控要求 临床免疫纯定性试验大都属于CLIA8,根据显色或发光直接判定阴阳性的技术，如金标试纸，美国CDC在“CLIA88豁免的HIV抗体快速检测的质量保证指南 ”中要求：除检测装置的内对照外，每检测日或分析批，应使用弱阳性和阴性外对照作为质控。无判定标准，一般理解为阴、阳性质控的检测结果分别为阴性和阳性即表明在控，相反则为失控。根据滴度或稀释度判定阴阳性的技术，如凝集试验，使用弱阳性和阴性外对照质控，阳性质控结果在均值上下一个滴度或稀释度以及阴性质控结果为阴性
28、即为在控，否则视为失控。,根据显色或发光直接判定阴阳性的技术，如金标试纸，美国CDC在,失控原因分析,失控信号的出现受多种因素的影响，包括质控物、试剂、仪器、操作以及质控规则本身等等。一旦出现失控信号，实验室应该仔细地分析原因、查找根源，不要拘泥于推荐的程式化的步骤进行，而应该根据误差的来源和当批工作的实际开展排查工作。 偶然误差造成的失控，首先考虑有无工作条件的变化，如新的质控物、新的试剂、仪器故障、人员变动、操作程序变化等等；其次查找仪器校准、环境因素（水质、温湿度）等原因。 系统误差造成的失控，首先考虑质控物或试剂原因，其次查找仪器校准问题，再次分析操作程序、环境因素等原因。,失控原因分
29、析 失控信号的出现受多种因素的影响，包括质控物、试,失控处理,实验室在确定失控原因后，应有针对性地采取纠正措施；对重复或系统性出现的失控原因需引入预防措施，必要时还应修改程序文件或作业指导书。 对于失控批的患者标本应根据不同情况采取相应的重测方案：阳性失控，重测所有阴性标本；阴性失控，重测所有阳性标本。,失控处理 实验室在确定失控原因后，应有针对性地采取纠正措施；,质控记录,实验室应详细记录开展室内质控工作的情况，按日志、月累积和质控物批号累积形式，内容包括检测日期、环境状况、质控物批号和效期（开瓶）、试剂厂家批号和效期、仪器状况、操作者、失控原因分析、纠正措施、预防措施、审核人、批准人等。,质控记录 实验室应详细记录开展室内质控工作的情况，按日志、月,道生一，一生二，二生三，三生万物。 -老子道德经得道多助！,道生一，一生二，二生三，三生万物。 -老子道,
