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1、第一章 微生物的利用,实验2 分离以尿素为氮源的微生物,课题背景：尿素是一种重要的农业氮肥。但是尿素不能直接被农作物吸收。只有当土壤中的细菌将尿素分解成氨气以后，才能被植物利用。而土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶。,什么是尿素和脲酶？,如何筛选分解尿素的细菌？,原理：培养基中的唯一氮源是尿素，只有能分解尿素的细菌（能合成脲酶）能够在该培养基上正常生长和繁殖。,碳源,氮源,实验原理,利用将尿素作为唯一氮源的选择培养基分离出能利用尿素的细菌，再通过稀释涂布分离法，将该菌分散开来，以形成单菌落。 细菌合成的脲酶能将尿素分解成NH3，致使 pH 升高，碱性增强，使酚红指示剂变红。,酸
2、碱指示剂：酸黄碱红,例题：下列能选择出分解尿素的细菌的培养基是（ ）A. KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4.7H2O、葡萄糖、尿素、琼脂、水B. KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4.7H2O、葡萄糖、琼脂、水 C. KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4.7H2O、尿素、琼脂、水D. KH2PO4、NA2HPO4、MgSO4.7H2O、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、水,选择培养基：只能以尿素为唯一氮源。,实验设备及用品,三角瓶、试管和试管架、培养皿、超净台、移液器、玻璃刮刀、酒精灯。,从土壤中采集微生物,土壤采样方法：用小铲子去除5 cm表土，取离地面5-15cm处的土样1克，盛于预先
3、灭菌的牛皮纸袋中扎紧。,从有哺乳动物排泄物的地方取得,稀释涂布分离法,玻璃刮刀,Step1：培养基的配制和灭菌,特别注意：尿素溶液用G6玻璃漏斗过滤，使之无菌。,Step2：倒平板,将已灭菌的LB固体培养基和尿素固体培养基在酒精灯火焰旁分别倒入培养皿中，在超净台上摇匀，平放至凝固。,冷却至60,Step3：制备细菌悬液,1g 土样,99 mL 无菌水,10-2稀释液,10-3、10-4、10-5稀释液,怎样梯度稀释菌液？,高浓度低浓度，换枪头,微量移液器,平行重复,每一个稀释度的菌液：接种到3个培养皿中。,Step4：用涂布分离法分离细菌,需要倒3个LB平板，9个尿素平板,重复1 重复2 重复
4、3,重复1 重复2 重复3,重复1 重复2 重复3,取10-3、10-4和10-5的土壤稀释液各0.1 mL，分别加到有LB培养基和尿素培养基的培养皿中。,在酒精灯火焰旁打开培养皿，用玻璃刮刀将菌液涂布到整个平板上。,70%酒精,恒温培养箱,Step5：恒温培养箱中37培养,培养皿要倒置,将培养皿倒置，在37恒温箱中培养2448 h。,实验结果：全营养培养基中有较多的菌落，而尿素培养基中只有少量的菌落。,Step6：观察培养基中的菌落数,Step7：统计菌落数目,统计菌落数目：选择菌落数在30300的平板计数。每个稀释度取3个平板取其菌落的平均值。统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。,例题：用
5、稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中得到以下几种统计结果，正确的是（ ） A. 涂布了一个平板，统计的菌落数是230 B. 涂布了两个平板，统计的菌落数是215和260，取平均值238 C. 涂布了三个平板，统计的菌落数分别是21、212和256，取平均值163 D. 涂布了三个平板，统计的菌落数分别是2l0、240和250，取平均值233,例题：稀释涂布平板法分离纯化土壤中微生物的正确操作步骤是（ ）土壤取样称取10 g土壤加入盛有90 mL无菌水的锥形瓶中，制备土壤提取液吸取0.1 mL溶液进行平板涂布依次稀释至101、102、103、104、105、
6、106、107的稀释度 A B C D,思考与练习,（1）为什么要用琼脂糖代替琼脂配制固体培养基？（2）有脲酶的细菌在生态稳态上起什么作用？（3）有脲酶的细菌菌落周围为什么有着色的环带出现？（4）与全营养培养基上的菌落数比较，为什么尿素培养基上只有少数菌落？,琼脂是未被纯化的混合物，内含一定量的含氮化合物。能将尿素转化为氨，供植物利用，而对生态系统中N元素的循环有重要作用。细菌合成的脲酶能将尿素分解成NH3，致使 pH 升高，使酚红指示剂变红。能利用尿素的细菌在土壤菌群中只占极少数量。,例题：（2012浙江高考）幽门螺杆菌（Hp）感染是急慢性胃炎和消化性溃疡的主要致病因素。在患者体内采集样本并
7、制成菌液后，进行分离培养。实验基本步骤如下：请回答：（1）在配制培养基时，要加入尿素和酚红指示剂，这是因为Hp含有，它能以尿素作为氮源；若有Hp，则菌落周围会出现色环带。（2）下列对尿素溶液进行灭菌的最适方法是灭菌。A.高压蒸汽 B.紫外灯照射C.70%酒精浸泡 D.过滤,脲酶,红,（3）步骤X表示。在无菌条件下操作时，先将菌液稀释，然后将菌液到培养基平面上。菌液稀释的目的是获得菌落。（4）在培养时，需将培养皿倒置并放在中。若不倒置培养，将导致。（5）临床上用14C呼气实验检测人体是否感染Hp，其基本原理是Hp能将14C标记的分解为NH3和14CO2。,接种,涂布,单（个）,恒温培养箱,无法形
8、成单菌落,尿素,倒平板,平板划线分离,练一练，识一识,稀释涂布分离,接种环,玻璃刮刀,例题：（2011新课标全国卷）有些细菌可分解原油，从而消除由原油泄漏造成的土壤污染。某同学欲从污染的土壤中筛选出能高效降解原油的菌株。回答问题：（1）在筛选过程中，应将土壤样品稀释液接种于以 为唯一碳源的固体培养基上，从功能上讲，该培养基属于培养基。（2）纯化菌种时，为了得到单菌落，常采用的接种方法有两种，即和。（3）为了筛选出高效菌株，可比较单菌落周围分解圈的大小，分解圈大说明该菌株的降解能力。（4）通常情况下，在微生物培养过程中，实验室常用的灭菌方法有灼烧灭菌、和。无菌技术要求实验操作应在酒精灯 附近进行，以避免周围环境中微生物的污染。,（1）原油、 选择 （2）划线法 涂布法 （3）强（4）高压蒸汽灭菌 干热灭菌 火焰,
