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1、离体无性繁殖方法,离体无性繁殖方法,一 引言1 概念（顶芽、不定芽、腋芽、） （1） 顶芽（Terminal）：生长在主干或侧枝顶端的芽。 （2）腋芽（Axllary bud）：着生在叶腋处的芽，也称为侧芽 (Lateral bud)。（3）不定芽（Adventitious bud）从现存的芽以外（顶芽、腋芽/侧芽）的任何器官、组织上通过器官发生重新形成的芽称之为不定芽。,大学课程植物组织培养14章快繁-组培课件,二 无性离体繁殖的概念分析 1 广义的离体无性繁殖植物细胞工程的中心内容是植物细胞和组织的离体培养。从技术上说它是一种从细胞到植株的无性繁殖技术。从遗传的角度来讲具它有双重性，一是遗
2、传的保守性，二是遗传的变异性。利用其保守性我们可以进行植物的无性繁殖，建立植物种质资源库以及生产有用化合物；利用其变异性我们可以进行体细胞诱变、体细胞杂交以及基因工程等。离体无性繁殖是在人工控制的无菌条件下，使植物在人工培养基上繁殖的技术，跟常规的繁殖方法相比它是一种微型操作过程，因此，有时就直接称之为微繁,二 无性离体繁殖的概念分析,离体无性繁殖是在人工控制的无菌条件下，使植物在人工培养基上繁殖的技术，跟常规的繁殖方法相比它是一种离体的、无性的繁殖、微型的操作过程。 整个植物组织培养技术体系中除“离体授粉”外都可以称为离体无性繁殖方法。因此，本节所涉及的离体无性繁殖方法（快繁、微繁），不是一
3、个新的方法，而是从“目的”角度（或层面）上讲的植物组织培养技术。它是基于植物 “全能性-分化-脱分化” 理论且以“离体繁殖-特别是高繁殖系数”为目的的多种植物组织技术的通俗叫法。,大学课程植物组织培养14章快繁-组培课件,广义的离体繁殖技术 根、芽（同时） 愈伤组织 芽 根 根 芽外植体 胚状体（根芽同时） （胚性愈伤） 根、芽 球茎（悬浮或固体培养）,试管苗,外植体,广义的离体繁殖技术试管苗外植体,2 狭义的离体无性繁殖在学术交流及生产中现在一般把直接利用植物根、茎、叶、茎尖等器官或组织进行培养，以取得更多试管苗的技术叫快繁、微繁（Micropropagation, Rapid microp
4、agation ）。,大学课程植物组织培养14章快繁-组培课件,三 快繁的一般程序及几种途径 1 快繁的一般程序外植体的选择外植体灭菌接种培养练苗移栽,大学课程植物组织培养14章快繁-组培课件,2 选择外植体注意问题（1）繁殖对象的品种典型性： 植物在自然条件下的繁殖特点，尽可能取自然繁殖器官的适 当部位作外植体。 离体条件下茎芽的增殖方式。如有些植物在培养条件下苗的生长 要以顶芽、腋芽直接生成小植株，易选择顶芽作为外植体，但大多数植物常常先形成不定芽然后通过生根培养才能最后形成小植株，即要考虑何种器官培养更易产生不定芽，如非洲紫罗兰、大岩桐、秋海棠以叶片为外植体易产生不定芽，而百合、水仙、大
5、蒜、贝母等则以鳞茎为外植体更易产生不定芽。（2）外植体的取材部位和大小、生理状态。,大学课程植物组织培养14章快繁-组培课件,离体植株增殖的几条途径：（1）腋芽增殖 通过外源激素调整（特别是细胞分裂素的使用），最大可能解除顶端优势，促进侧芽萌发。 其特点是：培养方法简单，能高度保持遗传稳定性，能长期继代繁殖。目前采这一方式快速繁殖的植物有石竹、马铃薯、甘薯、草莓、葡萄、月季等。这一繁殖方式需要严格控制激素浓度，以防止产生愈伤组织。,大学课程植物组织培养14章快繁-组培课件,（2）单节茎段增殖 通过培养使不容易萌发侧芽或腋芽的茎条伸长后再截取繁殖的一种快繁方法。常用于顶端优势不易或不能打破的植物
6、的快繁。该方法在离体快繁时不常用。,大学课程植物组织培养14章快繁-组培课件,（3）不定芽增殖从现存的芽以外（顶芽、腋芽/侧芽）的任何器官、组织上通过器官发生重新形成的芽称之为不定芽，在自然条件下，许多植物的器官要以产生不定芽，如苹果的根,凤信子的鳞茎，秋海棠和非洲紫罗兰的叶片等。,风信子,四季秋海棠,非洲紫罗兰,风信子四季秋海棠非洲紫罗兰,特点：繁殖系数高。非洲紫罗兰用常规叶插法，每片叶只能产生几个或十几个芽，但在组培条件下可一次形成几十至几百个芽，一年可以培养成千上万个小植株，遗传稳定性较好，但继代次数有限。培养物继代一定次数以后，不定芽形成能力即减弱，需要重新起始无菌培养物，此外，不定芽
7、需要进行生根培养才能形成真正的植株。诱导不定芽一般需要同时加入外源生长素和细胞分裂素，二者的配比一般是细胞分裂素要略高于生长素，其二者的总体使用浓度应尽可能的低，以免生产过多的愈伤组织，以保证繁殖品种的遗传稳定性。,大学课程植物组织培养14章快繁-组培课件,（4）胚状体增殖特点：增长率高，胚的双极性可免去生根环节，但胚状体休眠的诱导和去除还不能很好把握，其成苗率仍不高。目前除去一些特殊用途外（人工种子），这一途径还没有用于快繁技术。,大学课程植物组织培养14章快繁-组培课件,（5）愈伤组织增殖所有的植物通过组织培养的方法可以诱导愈伤组织，再进一步分化即可获得小植株。这一途径经历了组织培养技术的
8、所有过程（愈伤组织诱导愈伤组织增殖芽分化生根完整植株），它属于真正意义上的组织培养。一切通过其它增殖方式不能成功的植物，均可以通过此途径获得组培苗。其特点是成功率高，繁系数大（但是随着愈伤继代时间的增长，再生繁殖能力逐渐减弱）但遗传稳定性较差。 该途径一般为遗传转化、无性系筛选、原生质体融合等植物离体遗传重组技术的下游步骤。一般不采用这一方法作为快繁途径（不稳定、费时、费力）。,大学课程植物组织培养14章快繁-组培课件,3 影响快繁效果的几个因素：（1）植物种类、品种（2）基本培养基（3）激素（4）培养条件（温度、光照）（4）生根、练苗处理,大学课程植物组织培养14章快繁-组培课件,四 木本植
9、物离体快繁（1）一般情况下比草本植物困难 草本植物-小型木本（灌木、藤类）-大型木本（乔木）（2）周期较长、繁殖系数低（3）培养物易爆发性褐化（4）生根较困难,大学课程植物组织培养14章快繁-组培课件,五 离体快繁中的一些问题（1）试管苗的玻璃化现象 玻璃化苗是植物组织培养中出现的、半透明状的畸形的试管植株，它不能或不易移栽于土壤中。其形态解剖学的特点是整棵植株矮小、肿胀，节间很短或没有节间，疏导组织虽可看到，但导管或管胞木质化不完全，叶片厚而狭长，有时基部较宽，叶片皱缩或纵向卷曲，脆弱易破碎。,大学课程植物组织培养14章快繁-组培课件,生姜在不同激素里的生长情况,玻璃化苗的成因及预防,生姜在
10、不同激素里的生长情况玻璃化苗的成因及预防,（2）培养物的褐化（特别是木本植物） 褐化（褐变）是指外植体在培养过程中体内的多酚氧化酶被激活,使细胞里的酚类物质氧化成棕褐色的醌类物质,以致培养基逐渐变成褐色,培养物也随之进一步变褐而死亡。这是植物组织培养的3大难题之一。 细胞损伤-多酚类化合物+多酚氧化酶=醌类化合物级联放大-爆发性影响褐化的因素及防治方法（3）物种的局限性：裸子植物较困难，周期长，繁殖系数低（4）无性系变异的存在：造成种质衰退，可以解决,褐化、污染、玻璃化,（2）培养物的褐化（特别是木本植物）褐化、污染、玻璃化,六 离体快繁的应用前景1意义（1）快速繁殖新品种，使优良品种迅速应用
11、离体繁殖因为周期短（1-3个月），不受季节限制，繁殖系数高（几十几百倍），因此其繁殖速度是行何其它方法所不能比的。（2）脱毒保持种性快繁已是一个系统技术，在许多无性繁殖作物的种苗生产上均形成了自己的体系。（3）能够有效地保持优良品种的特性任何一个优良品种均需要有一个忠实地保存其遗传性状的繁殖方法。离体无性繁殖由于繁殖体系是建立在体细胞系的基础上，繁殖过程在人工控制的环境条件下所以既不会造成性状分离，也不会产生退化，同时还避免了病虫害的侵染，从而可以很好的保持品种的优良特性，是无异交作物和无性繁殖品种繁育的理想途径。,大学课程植物组织培养14章快繁-组培课件,2 离体快繁的应用范围 用于加速某些
12、难繁殖或繁殖度很低的植物，或某些需要加速繁殖的特殊基因型，如名贵花卉、优良资源、果树芽变分离、工程植株等等。 用于自然繁殖易感染病毒的植物，如马铃薯、甘薯、甘蔗、香蕉、石竹、百合等等。 用于有性繁殖变异范围大而自然条件下又不易无性繁殖的植物，如非洲菊、紫罗兰等。,大学课程植物组织培养14章快繁-组培课件,作业：1 试述茎芽增殖的几种途径及其机理。,大学课程植物组织培养14章快繁-组培课件,取材对非试管苗生根的影响（柳旭 等）,一、繁材的年龄母本的年龄：在选材时应采集年幼的母本,特别对许多难生根树种,应采集12年生植株上的枝条,快繁效果较好。 插材的年龄：插材以当年生健壮枝梢的再生能力最强,这是
13、因为嫩枝繁材内源生长素含量高,细胞分生能力强,有利于不定根的形成。所选插材的部位，是靠近树冠部位的好，还是靠近根系部位的好？,采用母本根颈部位的1年生萌蘖,其发育阶段最年幼,萌枝生长部位靠近根系,使它们积累了较多的营养物质,快繁后易于生根。 相反,树冠部位的插材,由于发育阶段性差异,快繁后生根相对减弱。,取材对非试管苗生根的影响（柳旭 等）一、繁材的年龄,二、繁材的质量用作繁材的枝条是幼嫩好还是成熟好？为什么？,繁材内积存的养分是快繁后形成新器官所需要的营养物质,凡是发育充实、营养物质丰富的繁材,容易发生不定根。快繁试验表明,半木质化的嫩枝,已积累较丰富的营养物质,快繁容易生根。一般不能用太幼
14、嫩的枝条,因幼嫩枝条组织不够健全,对周围环境适应能力差,特别是内含营养物质少、水分多、抗病能力差,快繁后很容易腐烂死亡。,二、繁材的质量繁材内积存的养分是快繁后形成新器官所需要的营养,三、采集时期秋季采集好，还是夏季采集好？为什么？,月季中的一些品种,在夏季嫩枝快繁,生根困难,而在秋后快繁,则较易生根。木槿在6月开花前进行嫩枝快繁,枝条质量最好,快繁生根率非常高,根系也特别发达,生根率可达95%以上,但在7月后开花期繁殖则生根率低。因此,必须通过初试摸清快繁植物的最佳快繁时间,以提高繁材生根率。,三、采集时期月季中的一些品种,在夏季嫩枝快繁,生根困难,而在,四、繁材的大小、所带叶片，及营养条件
15、一般来说,繁材的生根能力在一定程度上随繁材长度的增加而增强,但超过一定长度,生根率反而会下降；宜在715 cm。对于当年生繁殖材料,一般繁材越粗壮,枝条内贮藏营养越丰富,形成层生活力强,生根率也更高。实践表明,当繁材叶面积超过一定限度,会出现不利于生根的现象。低氮对生根有利,而缺氮则可能抑制生根。所以,应选用低氮高碳水化合物的枝条作繁材。,四、繁材的大小、所带叶片，及营养条件,不同的外植体、不同的年龄以及不同的季节所采取的外植体,应选择相应的消毒剂种类、消毒时间和消毒方法,以达到最大限度杀死微生物、最小程度损伤材料的最佳效果。目前,常用的消毒剂有酒精、双氧水、氯化汞、次氯酸钙、次氯酸钠等。一般
16、先用流水冲洗或用洗洁精洗去材料上的尘土和部分细菌,洗时注意不要损伤和弄掉其上幼小嫩芽,然后放入接种室进行消毒并用无菌水冲洗茎尖、茎、叶片的消毒步骤:消毒前先用清水漂洗干净或用软毛刷将外植体上的尘埃刷除,茸毛较多的用皂液洗涤,然后用流动的清水洗去皂液,洗后用吸水纸吸干表面水分;进入无菌的接种室,用70%酒精浸泡外植体3060min;取出后马上用0.1%0.2%氯化汞消毒1015min,或用10%次氯酸钙饱和上清液浸泡1020 min,还可以用2%10%次氯酸钠溶液浸泡615 min;消毒后用无菌水冲洗35次,用无菌纱布或无菌滤纸吸干水分后再接种。,不同的外植体、不同的年龄以及不同的季节所采取的外
17、植体,应选择,试管苗不能立即适应移栽环境,必须有一个驯化过程。一般不定根长度达1 cm左右,且生长旺盛时,即可驯化(炼苗)。首先将生根试管苗移到温室中,除去封口材料,使嫩苗与外界接触,增强其对外界不良因素的抵抗力,此间逐渐增强光照,使苗粗壮,以利于移栽成活。一般炼苗35 d即可将长到一定大小(5 6片真叶或苗高45 cm)、生45条根的组织培养苗。,试管苗不能立即适应移栽环境,必须有一个驯化过程。,洗掉苗上的培养基,移栽到保水、透气性好的基质或苗床土中。移栽后的组织培养苗前期宜生长在适温、适湿的环境中,逐渐使其适应外界环境。为使幼苗正常生长,每35天可叶面喷施营养液一次,710 d给基质浇营养
18、液一次。,洗掉苗上的培养基,移栽到保水、透气性好的基质或苗床土中。,若细胞分裂素浓度过高或细胞分裂素与生长素相对含量高,培养基中离子种类、比例不适,琼脂浓度低,温度过低或过高,光照时间过长或通气不良,易发生玻璃化现象,减少和避免玻璃化苗出现的方法是:选择适合的培养基,如适当降低培养基中细胞分裂素用量,提高Ca2+、Zn2+等离子浓度,降低N与Cl元素的比例,降低铵态氮浓度,适当提高培养基中蔗糖和琼脂的浓度;改善培养环境,温度光照适宜,用具滤层通气孔的塑料封口膜封口改善通气状况,可减少玻璃化苗的产生。,若细胞分裂素浓度过高或细胞分裂素与生长素相对含量高,培养基中,影响褐化发生的主要因素:材料类型
19、差异,一般木本植物单宁、色素含量高的易发生褐变;材料年龄、取材部位及时间差异,一般幼龄材料、幼嫩器官和组织、春季取外植体褐变发生较轻;外植体大小及受伤害程度,外植体太小、受伤害程度深、易引起褐变;培养基中6-BA或KT能促进褐变发生,而生长素类如IAA可减轻褐变发生;强光照、高温加重褐变。所以,选择适宜的外植体并建立最佳的培养条件是防止外植体褐变最主要的手段。,影响褐化发生的主要因素:,控制褐化的主要方法:一般选择幼嫩的器官和组织作外植体,并选择最佳取材时间;切取外植体时尽量减少伤口面积及选择适宜的消毒剂;选择适宜的培养条件,初代培养可适当暗处理;选择适宜培养基,适当降低培养基无机盐浓度,降低pH值,降低细胞分裂素浓度等,可明显减轻培养物褐变;在培养基中加抗氧化剂如硫代硫酸钠等；吸附剂，如活性炭及螯合剂等可有效抑制褐变;缩短转瓶周期,也是控制褐变常用且有效的方法。,控制褐化的主要方法:,
