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1、附件一：基因工程（跨课程）综合实验讲义基因工程发酵工艺原理生物技术药物药剂与药动学广东药学院生命科学与生物制药学院2006年6月（非正式出版物，请勿外传）目 录一、实验安排日程表.二、目的和意义. 2三、课程介绍和课堂讨论四、实验实施五、实验考核六、附录 9附录一：讲义 9 附录二：知识竞赛规则及试题 28一、实验安排日程表上午下午晚上第一周一课程介绍和课堂讨论（黄、邵）准备试剂（董、段）二放大培养（董、段）、动物操作练习（袁、杨）质粒提取（董、段）三电泳、装柱（董、段）过柱纯化（董、段）四电泳检测、小结（董、段）动物操作练习（袁、杨）五荷瘤昆明小鼠模型的建立（袁、杨）六日第二周一细胞培养技术
2、讲解（沈、吴）转染实验（沈、吴）二加血清（沈、吴）细胞培养技术讲解（沈、吴）三细胞换液、MTT法原理讲解（沈、吴）流式细胞技术讲解（沈、吴）四MTT法和Annexin V/PI法的细胞接种（沈、吴）流式细胞技术检测TCR V7.1的表达（卢）五MTT法检测淋巴细胞的杀肿瘤细胞能力（沈、吴）流式细胞技术检测肿瘤细胞的凋亡（沈、吴）六用经基因工程药物处理的PBLC处理动物膜型（袁、杨）日第三周一蛋白类基因工程药物发酵原理讲解（赵）实验准备（赵）二起始菌浓度及诱导时间对蛋白产物量的影响（赵）三培养温度对菌体生长及蛋白产物量的影响（赵）四起始pH值对蛋白产物量的影响（赵）五发酵过程还原糖含量的变化及补
3、糖对发酵的影响（赵）六核酸药物TCR V7.1在荷瘤昆明小鼠体内的分布（示教）（袁、杨）日二、目的和意义 基因工程技术是生物学、医学、制药学以及相关专业最重要的课程之一，特别是对于生物制药专业的学生来说，基因工程技术是他们学习的核心内容之一，在本科阶段培养他们对这门课程的兴趣，使他们掌握基因工程基本的操作技能和方法，熟悉基因工程的操作流程，并对他们的动手能力和科学思维进行锻炼，对于他们今后的工作和进一步的学习具有非常重要的意义。本院是一个院所合一的单位，为了发挥以科研促教学的优势，同时为了使学生对基因工程在制药专业上的应用有一个更加全面的认识，我们选取了自己一部分的科研工作用于学生的基因工程综
4、合性实验，其中涵盖了核酸类基因工程药物和蛋白多肽类基因工程药物的关键技术。本次综合实验按照从上游到下游的顺序分为数个单元，主要包括分子生物学技术、细胞生物学技术、实验动物技术、药剂与药代动力学技术以及蛋白发酵技术等。三、课程介绍及课堂讨论第一部分：基因工程介绍一、基因工程技术概述基因工程制药：利用基因工程的手段生产药物。70年代基因工程诞生，1977年出现第一个重组的生长激素抑制因子，1982年基因重组产品人胰岛素在美国问世，自20世纪80年代以来，仅美国、日本开发的生物新技术新药物便达200多种，大都是重组蛋白质药物和重组DNA药物。美国是现代生物技术的发源地，也是应用现代生物技术研制新型药
5、物的第一个国家，多种新型药物首创于美国。现有的近1300多家生物制药技术公司，资本总额已超过400亿美元。基因工程药物大体分为：蛋白类药物（酶、细胞因子、激素、单抗等）、核酸类药物（基因治疗）基因工程制药的特点：方便、快捷、可工业化生产二、基因工程制药的流程1、核酸类基因工程制药的流程获得目的基因插入载体导入表达宿主诱导表达提取纯化目的蛋白检测活性动物实验临床试验。2、蛋白多肽类基因工程制药的流程获得目的基因插入载体扩增后提取纯化质粒导入特定细胞检测活性动物实验临床实验。3、两者异同点测活：方法不一样，但目的一样。工艺：核酸药的制备一般来说较简单，给药方式：核酸药的给药方式较复杂三、基因工程技
6、术中一些关键的技术核酸提取和纯化、逆转录、PCR、重组载体的构建、转化/转染、诱导表达、蛋白提取和纯化四、基因工程技术需要注意的一些问题1、目的基因的获取2、载体的选择原则3、表达系统的选用原则4、活性检测的方式方法五、与本次实验有关的实验内容介绍1、 结合科研工作介绍当初的选题背景和研究思路肿瘤一直是困扰人类的一类重大疾病，对它的治疗一直是医生和科学家们重点研究的目标之一。研究发现，机体内发挥主要抗肿瘤作用的细胞是淋巴细胞，淋巴细胞通过体液免疫和细胞免疫两种方式发挥抗肿瘤作用，一般认为其中细胞免疫发挥着主要的抗肿瘤作用。目前寻找肿瘤特异抗原的工作进展不是很顺利，给肿瘤的诊断、治疗和研究其发病
7、机理带来了很大的困难。我们从TCR负责识别抗原这一理论基础出发，应用基因优势取用方法，利用不同的肿瘤细胞刺激T细胞，检测TCR家族的表达谱变化，从而初步确定特异性识别不同肿瘤抗原的TCR分子家族，在我们的研究中发现，肿瘤患者的TCR V基因表达均有不同程度的减弱，即优势表达一个或少数几个TCR V亚家族，同时其它TCR V亚家族显著减少或完全缺如，即有受体偏移现象。如图：我们将与肝癌识别有关的可变区属于V7家族的TCR基因转入淋巴细胞，然后将该种淋巴细胞同肝癌细胞共孵育，发现该TCR分子不仅具有识别肝癌细胞的作用，还有激活T细胞并增强其杀伤能力的功能，如图：体内实验也显示转染了该TCR分子的淋
8、巴细胞能够有效杀伤接种于SCID小鼠体内的人肝癌细胞。如图：肿瘤组织大体照片A对照组 B单纯PBMC组 C TCR转基因组TCR基因转染组HE染色，20 TCR基因转染组LCA染色，20HE染色和免疫组化显示淋巴细胞浸润2、 本次实验所要操作的具体内容介绍结合大家以前的基础，本次综合性实验主要包括以下主要内容：（1）核酸类基因工程药物部分a、 提取和纯化携带V7.1家族TCR基因的重组质粒；b、 将纯化的质粒转染人淋巴细胞，然后利用流式细胞仪检测所转基因的表达情况；c、 分别利用流式细胞仪和MTT法检测转基因淋巴细胞对肝癌细胞的体外杀伤情况；d、 构建荷人肝癌细胞瘤昆明小鼠模型（考虑到学生人数
9、较多和饲养条件的限制，用昆明小鼠代替SCID鼠）；e、 将转基因淋巴细胞注射至荷瘤小鼠体内的癌旁组织，并检测其在荷瘤小鼠体内的分布；f、 利用免疫组化检测所转TCR基因在小鼠体内的分布（因时间所限，将以前所做结果利用多媒体形式向学生展示、讲解）。（2）蛋白多肽类基因工程药物部分考虑到以前学生已经进行过基因扩增、重组、转化和克隆等相关实验，本次就以摸索发酵条件为主要内容，包括：a、 起始菌浓度及诱导时间对表达产物的影响；b、 培养温度对表达产物的影响；c、 起始诱导pH值对表达产物的影响；d、 通气量对表达产物的影响；e、 还原糖含量和补糖对表达产物的影响。3、阐明本次实验所要达到的目的，帮助学
10、生理解基因工程技术在制药上应用的。第二部分：课堂提问与讨论第三部分：学生复述自己对基因工程制药技术的理解小结四、实验实施在实验实施的过程中，每个实验单元由一位主讲教师总体负责，每个单元的实验课开始前首先由主讲教师对实验原理、实验内容、操作要点等进行详细的讲解，点明需要特别注意的地方，并承上启下地点明本次实验在整个综合实验中的位置，这样的集体授课保证了学生知识的统一性。在实验的具体实施过程中，学生分组进行操作，每个组由一位带教老师具体负责，针对学生实验过程中出现的各种问题进行及时的纠正和指导，回答学生的提问，并负责组织学生对实验结果进行讨论，这样不仅可以保证学生能够得到及时、正确的指导，同时也加
11、深了学生们对实验内容的理解和掌握，对于提高他们的操作技能、锻炼他们分析问题解决问题的能力都很有帮助。在实验过程中，除了保证实验整体流程的完整性和一致性，我们还在不同小组间安排了一些差异化的实验内容。比如，在重组蛋白发酵条件优化实验中，我们安排不同的小组分别对构建在不同载体上的两个重组蛋白进行发酵条件的摸索，这无形中在学生们中间形成了一种竞争，每个小组都争取把自己的结果做得更好，更能说明问题，这样就需要整个组的成员相互协作、共同努力，通过这样的实验，学生的团队精神得到了培养。不仅如此，我们还将每个组细分为五对搭档，将要优化的几个发酵条件，如，起始诱导OD浓度、诱导时间、诱导温度、还原糖含量、通氧
12、状况等分别交由每组不同的搭档组合轮流负责，其他同学为他们做一些辅助工作，这又更进一步地培养了学生的相互合作精神。通过这样的实验，我们希望学生不仅能学到专业知识也能够学到团队合作精神，这对于他们今后的工作和学习都是很有好处的。实验讲义见附录一。五、实验考核在大实验结束之后，为了检验学生对实验内容的掌握情况，我们组织学生开展了一次知识竞赛，竞赛要考察的内容就是一些关于基因工程的重要的基础知识和试验操作中需要注意的一些重要环节。通过这种生动活泼的形式，有力地激发了学生们的学习兴趣，同时使他们的知识和技能在不知不觉中得到了进一步的巩固和提高。另外，为了锻炼学生的写作能力，并使他们对这次的综合性实验进行
13、进一步的总结和提炼，我们要求学生按照学术论文的格式撰写实验报告，全文包括摘要、前言、材料与方法、结果与讨论等几部分。我们从科学期刊中选取例文给学生们详细讲解了撰写科技论文时要注意的一些问题。通过这样的模拟训练，我们希望能够使学生更多地了解关于科研工作的一些东西，次外，这样的写作经历对于学生今后毕业论文的写作以及进一步的学习与深造也是很好的锻炼。知识竞赛的内容见附录二。学生实验报告范例见附录三。六、附录附录一：实验讲义（一）质粒pCDNA3.1-TCRV7.1的提取和纯化实验目的：利用层析技术分离质粒DNA实验原理：经过碱裂解制备的质粒DNA，还含有基因组DNA、RNA以及蛋白质的污染，纯度不是
14、很高，不能满足后续的实验操作。常见对质粒DNA进一步纯化的方法包括酚/氯仿、CsCL密度梯度离心、离子交换层析等。在pH8.0条件下，质粒DNA带负电荷，且电荷数目与基因组DNA、RNA等存在一定的差异，因此，可利用该性质，通过离子交换层析，将其分开。所用试剂：LB培养基（300ml）：称取胰蛋白胨10g，酵母抽提物 5g，NaCl 10g，置于500ml三角瓶中，加H2O至300ml，用NaOH调pH至7.0，于121灭菌20min，冷却后备用 临用前按1:500倍体积加入卡拉霉素溶液(10mg/ml)质粒提取试剂：300ml 溶液I：50mM葡萄糖、25mMTris-HCl，pH8.0,
15、10mMEDTA100ml 溶液II：0.2M NaOH，1%SDS(新鲜配置)100ml 溶液III：5M乙酸钾60ml、冰乙酸11.5ml、水28.5mlDEAE-sepharose层析试剂：300ml Buffer A：0.1M Tris-HCl，pH8.0200ml Buffer B：0.1M Tris-HCl，pH8.0，1M NaClDEAE-Sepharose FF 每组20ml填料纯水50ml 2M NaCl溶液实验流程图 操作步骤3ml菌种接种于300ml LB卡那抗性培养基中，37，250rpm，培养3hr；放大培养离心收菌将振荡培养的菌液转入离心管中于4， 6000rpm
16、，离心10min，弃上清；洗涤沉淀以5ml 溶液I重悬沉淀，然后于6000rpm离心10min，弃上清，再依次重复两次；重悬沉淀加入5ml溶液I重悬沉淀，室温放置10min；碱裂解菌体加入10ml溶液II后，迅速颠倒离心管46次；中和、复性加入7.5ml溶液III，轻柔但彻底颠倒离心管46次，冰浴10min；然后于12000g，离心10min，小心转移上清至一新离心管中；沉淀质粒加入2倍体积的预冷无水乙醇，颠倒混匀，室温放置5-10min，12000g离心10min，弃上清；洗涤沉淀加入70%乙醇，12000g离心10min，弃上清，室温干燥510min；溶解沉淀以10ml 0.1M Tris
17、-HCl （pH8.0，并含20g/ml的RNase A）溶解沉淀，37，保温2 hr后电泳检测；DEAE- Sepharose FF 层析以0.1M Tris-HCl（pH8.0）平衡，上样5ml，冲平，以0.1M Tris-HCl（pH8.0），1M NaCl线性洗脱。设置8-10个柱床体积，收集各吸收峰；电泳检测琼脂糖电泳检测各洗脱峰，确定质粒所在洗脱峰；测定所得质粒260、280吸收值，计算浓度和纯度。检测浓度和纯度（二）淋巴细胞的转染及转染后淋巴细胞杀肿瘤活性的检测和TCR V7.1基因表达的检测全班62人分为6组，十到十一人一组一）细胞培养（人PBLC，肿瘤细胞BEL-7402）1
18、、利用淋巴细胞分离液从外周血中分离PBLC，置于50ml培养瓶中，用完全培养基（1640培养基含10%FBS, IL-2）培养（老师已帮助完成）。2、肿瘤细胞BEL-7402按 密度接种于50ml培养瓶中，用全培养基（1640培养基含10%FBS）培养（老师已帮助完成）。老师为每一组提供PBLC和肿瘤细胞BEL-7402各一瓶，由每组中挑选2位同学负责培养，每组指定一名老师负责培训指导，要求负责同学学会无菌操作技术、细胞换液、细胞消化传代及细胞冻存技术，所培养细胞以供后续实验所用。实验室共有无菌操作台三台，每两组指定使用一台（以后有关细胞培养实验都用此台），负责操作台的卫生及维护。二）用含TC
19、R V7.1基因的质粒转染人PBLC实验目的：1将PCDNA3.1-TCRV7.1转染至人淋巴细胞2了解脂质体转染的原理，掌握基本技术。实验原理：转染是用于将克隆获得的外源基因导入哺乳动物细胞的一系列技术的通用名称。通常将转染技术分为生化方法转染（包括脂质体转染、磷酸钙介导的转染、DEAE（二乙基氨基）葡聚糖介导转染等）和物理方法转染（包括电穿孔及生物粒子作用）。脂质体作为一种可供选择的基因载体，具有无毒、无免疫原性、可生物降解的特点。脂质体是由磷脂双层构成的具有水相内核的脂质微囊。因为脂质体具有磷脂双层结构,与细胞膜类似,因此可以与受体细胞膜融合,从而将外源DNA转入宿主细胞，而质粒DNA则
20、被包裹在水相内核中，免受核酸酶降解。当阳离子脂质体与DNA混合后，将形成一种稳定的复合物，这种复合物可直接加在培养细胞中，然后粘附于细胞表面，通过与细胞膜溶合，将外源基因释放到胞浆中。实验材料：人PBLC两瓶（1x106个/ml），重组质粒PCDNA3.1-TCRV7.1，1640培养基、胎牛血清、白介素2溶液（IL-2）、青霉素、链霉素，转染试剂Lipfectamin2000，6孔细胞培养板1个灭菌10ml离心管5个，灭菌玻璃滴管、灭菌枪头（1000ul、200ul和10ul）,无菌转染用塑料管1支，实验步骤：1将培养的人淋巴细胞悬液转移至10mL离心管中，离心使细胞沉淀（1600rpm，5
21、min）。加入无血清1640培养液1ml，重悬细胞。2 调节淋巴细胞浓度：酒精棉球擦净细胞计数板（正反两面）及盖玻片。将盖玻片置于计数板上。用滴管吸取一滴养淋巴细胞悬液，滴加于细胞计数板计数池（盖玻片下）显微镜下计四大格细胞数，计算细胞浓度（如图31）个/mL104细胞数 四大格总数4计算细胞总数（细胞浓度悬液体积）。加入含10小牛血清的1640培养液，将细胞数调节至1106个/mL，滴管吹打均匀。3接种淋巴细胞：将调好浓度的细胞悬液加入培养板孔中，每孔2ml。细胞总数为2106个。共接种3孔。4吸取重组质粒PCDNA3.1-TCRV7.1 60L于1.5mLEP 管中，加入无血清1640培养
22、液690L，轻轻混匀。5吸取脂质体30L于转染管中，加入无血清1640培养液720L，混匀，室温孵育5min。6将第4步制得的质粒溶液加入脂质体溶液中。轻轻混匀，室温孵育25min。7将脂质体质粒混合溶液加至接种有淋巴细胞的6孔板中，500L/孔。8加入IL-2，2.5L/孔，以维持淋巴细胞生长。将培养板放入二氧化碳孵箱，培养过夜9培养过夜后，次日上午向各孔板内加入胎牛血清，270L/孔，使培养液中含有10的胎牛血清，维持细胞正常生长。继续培养10培养至次日，换液，将培养的人淋巴细胞悬液转移至10mL离心管中，离心使细胞沉淀（1600rpm，5min）。加入含10 血清1640培养液，重悬细胞
23、。继续培养至检测其它指标。三）流式细胞仪检测转基因后VB7.1的表达实验原理：活细胞表面保留有较完整的抗原或受体，先用特异性鼠源性单克隆抗体与细胞表面相应抗原结合，再用荧光标记的第二抗体结合，根据所测定的荧光强度和阳性百分率即可知相应抗原的密度和分布。试剂和器材：1、各种特异性单克隆抗体。2、荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。3、10 FCS RPMI1640； DPBS (10, 贮存液)：NaCl 80gKCl 2g 蒸馏水加至1000mlNaHPO 11.5g 临用时用蒸馏水110稀释KHPO 2g 洗涤液：DPBS900mlFCS 50ml (终浓度5)4NaN50ml
24、 (终浓度0.2) 固定液：DPBS1000ml葡萄糖20g (终浓度2)甲醛10mlNaN0.2g (终浓度0.02)4、玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。操作步骤： 转基因后的外周血单个核细胞（细胞数为106107个）用10FCSRPMI1640调整细胞浓度为51010ml取40l细胞悬液加入鼠源性的VB7.1 抗体(550l)的小玻璃管或塑料离心管， 4 30min用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2ml左右1000rpm5min加入荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体(550l)的小玻璃管或塑料离心管， 4 30min用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2ml左右1000rpm5min 加适量固
25、定液(如为FCM制备标本，一般加入1ml固定液，如制片后在荧光显微镜下观察，视细胞浓度加入100500l固定液)FCM检测或制片后荧光显微镜下观察(标本在试管中可保存57天)注意事项：1.整个操作在4下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。2.洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阴性。3.加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体，降低和防止非特异性染色。4.细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。四）MTT检测转染TCR V7.1基因的淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤作用实验目的：检测转染TCR
26、V7.1识别杀伤肿瘤细胞的功能。 掌握MTT法的原理与操作技术实验原理：MTT（四甲基偶氮唑盐）可被活细胞内的线粒体脱氢酶还原为蓝色的甲月赞结晶，颜色的深浅与活细胞数成正比，DMSO溶解结晶后，通过在酶标仪上测定吸光度值，可以比较活细胞的数量。DMSO溶解比色甲月赞琥珀酸脱氢酶MTT实验材料：效应细胞淋巴细胞（未转染组，转染TCR V7.1组）；靶细胞 肿瘤细胞（BEL-7402）实验试剂：MTT（5mg/mL）；胰蛋白酶（0.5%）；DMSO实验步骤：1胰酶消化培养肿瘤细胞。1）滴管吸出培养瓶内的培养液。加入无血清1640培养液 1mL漂洗。吸出培养液。2）加入胰蛋白酶 1mL，轻轻晃动培养
27、瓶。使胰酶完全作用细胞单层。镜下观察细胞，当细胞变圆，细胞间隙增大，（约1min），消化已完成，迅速用滴管吸出胰酶，停止消化。3）加入无血清1640培养液2ml，将细胞从瓶壁上吹打下来（尤其是注意吹打培养瓶的角落），成为单个细胞悬液。2肿瘤细胞计数计算细胞总数（细胞浓度悬液体积）。加入含10小牛血清的1640培养液，将细胞数调节至1105 个/mL，滴管吹打均匀。3调节淋巴细胞浓度（未转染组，转染组）用滴管将培养淋巴细胞悬液转移至10mL 离心管；1600 rpm离心5 min，使淋巴细胞沉淀；加入含血清1640 2 mL重悬细胞沉淀，并吹打均匀；计数，算出淋巴细胞总数；用含血清1640 将淋
28、巴细胞浓度调节至2106个/mL。4取出96孔板，在盖上标记好实验分组，按以下指导加入细胞悬液：共6组，每组5孔，以便最后结果分析时求均值，避免误差。A：空白培养液组（MTT比色时作为空白对照，除去系统误差）。加入含血清1640 培养液200 LB：肿瘤细胞组(作为靶细胞对照组)。加入肿瘤细胞100L，含血清1640 培养液100LC：未经转染淋巴细胞实验组加入未经转染淋巴细胞100L，肿瘤细胞100LD：未经转染淋巴细胞对照组加入未经转染淋巴细胞100L，含血清1640 培养液100LE：转染淋巴细胞实验组 加入转染淋巴细胞100L，肿瘤细胞100LF：转染淋巴细胞对照组 加入转染淋巴细胞1
29、00L，含血清1640 培养液100L537，5CO2培养18小时6吸去上清100L/孔7加入MTT工作液，15L/孔8继续培养4小时，倒去上清，加入DMSO 150L/孔，混匀9平板振荡器振荡30 min 使结晶完全溶解10酶标仪490 nm 处测定各孔吸光度值。11计算杀伤活性：效应细胞实验组OD值效应细胞对照组OD值杀伤活性（）（1）100 靶细胞对照组OD值五）流式细胞仪检测肿瘤细胞凋亡：实验原理：细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面，目前早期识别仍有困难。这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞膜内转移到细胞膜外，使PS暴露在细胞膜外表面。PS是一种带负电荷的磷脂，正常主要存
30、在于细胞膜的内面，在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使PS暴露在细胞膜外。Annexin V是一种Ca+依赖的磷脂结合蛋白，最初发现是一种具有很强的抗凝血特性的血管蛋白，Annexin V具有易于结合到磷脂类如PS的特性。对PS有高度的亲和性。因此，该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的PS。PS转移到细胞膜外不是凋亡所独特的，也可发生在细胞坏死中。两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。因此，可以建立一种用Annexin V结合在细胞膜表面作为凋亡的指示并结合一种染料排除试验以检测细胞膜的完整性的检
31、测方法。实验材料：人PBLC一瓶（1x106个/ml），肿瘤细胞BEL-7402一瓶（1x105个/ml），1640培养基、胎牛血清、白介素2溶液（IL-2）、青霉素、链霉素，胰酶一瓶，灭菌PBS一瓶，灭菌10ml离心管5个，灭菌玻璃滴管、灭菌枪头（1000ul、200ul和10ul）,50ml灭菌玻璃培养瓶一个，1000u l、200ul微量移液器各一支，乳胶手套，消毒用70%酒精棉球一瓶，金属镊一把，封口膜，酒精灯一个，废液缸一个，细胞计数板一个。孵育缓冲液：10mmol/L HEPES/NaOH，PH 7.4，140mmol/L NaCl，5mmol/L CaCl2标记液：将FITC-
32、Annexin V和PI加入到孵育缓冲液中，终浓度均为1ug/ml实验步骤：1、人PBLC的收集1）摆放好无菌操作台，照紫外灭菌30min。2）带手套，用酒精擦手，打开酒精灯取人PBLC一瓶，用滴管转移至10ml离心管中，改紧管盖，用封口膜将盖口封紧。3）将离心管用天平配平后，1000rpm x10min，离心。4）将离心管拿进无菌操作台弃上清，加入1ml完全培养基（加入900ul1640培养基，100ul小牛血清，20ul IL-2，1ul链霉素和1ul青霉素），用玻璃滴管吹打混匀备用，细胞计数，调细胞浓度至1x106个/ml。2、肿瘤细胞BEL-7402的收集1）取肿瘤细胞BEL-7402
33、一瓶，弃去培养基，用移液器吸取灭菌PBS 2ml加入培养瓶中，轻轻洗涤细胞一次，弃上清。2）向瓶中加入1ml胰酶，盖紧瓶盖，室温消化13分钟，盖紧盖子在显微镜下观察细胞状态。3）待细胞变圆成单个细胞后，竖起培养瓶，在操作台上打开瓶盖，倒去胰酶液体。4）向瓶中加入2ml完全培养基，用玻璃滴管吹打混匀备用，细胞计数，调细胞浓度至5x104个/ml3、PBLC与肿瘤细胞混合接种1） 将收集所得的1ml PBLC与2ml肿瘤细胞混合加入一新的培养瓶中。2） 在加入2ml完全培养基（1800ul 1640培养基，200ul小牛血清，2ul链霉素和2ul青霉素），用玻璃滴管吹打均匀。3） 盖紧瓶盖，置于细
34、胞培养箱中，37培养24小时4、Annexin V/PI双染色1）取培养24小时后的细胞，弃去培养基，用灭菌PBS洗涤细胞一次，加入胰酶消化后，加入1ml PBS吹打细胞至单个细胞悬液，进行细胞计数，用PBS调整细胞浓度为1x106个/ml，5001000rpm离心5min，弃去培养液。2）用孵育缓冲液洗涤1次，5001000r/min离心5min。3）用100ul的标记溶液重悬细胞，室温下避光孵育1015min。4）5001000r/min离心5min沉淀细胞孵育缓冲液洗1次。5）加入荧光（SA-FLOUS）溶液4下孵育20min，避光并不时振动。5、流式细胞仪分析：1）流式细胞仪激发光波长
35、用488nm，用一波长为515nm的通带滤器检测FITC荧光，另一波长大于560nm的滤器检测PI。2）结果判断：凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如PI有抗染性，坏死细胞则不能。细胞膜有损伤的细胞的DNA可被PI着染产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此，在细胞凋亡的早期PI不会着染而没有红色荧光信号。正常活细胞与此相似。在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为（FITC-/PI-）；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为（FITC+/PI+）；而右下象限为凋亡细胞，显现（FITC+/PI-）。（三）基因工程药物药剂与药代动力学实验一）实验动物的识别、捕捉固
36、定和标记方法实验目的： 练习如何捉拿小鼠、判断小鼠性别，以及用苦味酸溶液标记小鼠的方法。实验动物：每人1只昆明小鼠，雌雄兼用实验器材和试剂：器材：鼠笼15个，一次性塑胶手套，乳胶手套，棉签试 剂：75酒精，3的苦味酸溶液，鼠粮实验步骤：1 学习如何判断小鼠性别 成年鼠性别很易区分，雄鼠的阴囊明显；雌鼠可见阴道开口和五对乳头。仔鼠或幼鼠则主要从外生殖器与肛门的距离判定，近者为雌性，远者为雄性。2 练习抓取小鼠先用右手抓住鼠尾并提起，放在实验台上，在其向前爬行时，顺势用左手的拇指和食指抓住其两耳和头颈部皮肤，然后把鼠体置于左手心中，把后肢拉直，用左手的无名指及小指按住尾巴和后肢，前肢可用中指固定（
37、有时也可以不固定前肢），即可进行注射或其他实验操作。对于操作熟练者，可采用左手一手抓住法，右手可不必放下注射器等工具。操作时应小心被小鼠抓咬。3 练习用苦味酸标记小鼠用3的苦味酸溶液涂染小鼠背毛标号。用棉签蘸取苦味酸溶液，在小鼠的不同部位上涂染苦味酸黄色斑点来表示不同号码。一般习惯是：左前腿上为1，左腰部为2，左后腿为3，头部为4，背部为5，尾基部为6，右前腿为7，右腰部为8，右后腿为9。染色的一般原则是“先左后右，先上后下”。单一颜色可标1-10号，两种颜色配合使用，一种颜色代表个位数，一种代表十位数，可编到100号。二）实验动物的给药途径和方法实验目的： 学习和掌握通过灌胃、皮下注射、皮内
38、注射、肌肉注射、腹腔注射、尾静脉注射等途径对实验动物（小鼠）进行给药的方法。实验动物：每人1只昆明小鼠，雌雄兼用实验器材和试剂：器材：鼠笼，脱脂棉， 75酒精，广口瓶（装酒精棉球用），灌胃针，小鼠固定器（辅助尾静脉注射用），1mL注射器，一次性塑胶手套，乳胶手套。试 剂：生理盐水，鼠粮实验步骤： 在动物实验中，为了观察药物对机体功能、代谢及形态引起的变化，常常需要将药物注入动物体内。给药的途径和方法是多种多样的。应根据实验目的、实验动物种类和药物剂型等情况确定。1 皮下注射皮下注射比较简单，一般都取动物背部及后腿皮下。注射时用左手拇指及食指轻轻捏起皮肤，右手持注射器将针头刺入，固定后即可进行注
39、射。对于小白鼠，注射时用左手拇指和食指抓住鼠的两耳及头皮，腹部朝上，左手无名指及小拇指夹住鼠尾，右手持注射器在鼠腹部两侧作皮下注射。要注意勿将药液注入皮内。使用注射器和吸取药物时要注意： 注射前要排除针筒及针头内的气泡，调整药液至准确的位置； 注射器一般要平拿，否则需用无名指及中指轻扶针栓，以防滑落或进入空气。2 腹腔注射对大小白鼠，一般一个人即可进行注射，注射时用左手大拇指及食指抓住动物两耳及头部皮肤，腹部朝上，将其固定于手掌内，必要时可用左手无名指及小指夹住鼠尾，右手持连有4号针头的注射器，将针头从下腹部朝头的方向刺入腹腔，抽注射器，如无回血或尿液，表明针头未刺入肝、膀胱等脏器，即可进行注
40、射。进行腹腔注射应注意： 针头刺入部位不宜太接近上腹部或太深，以免刺破内脏； 针头与腹腔的角度不宜太小，否则容易刺入皮下； 所用针头不要太粗，以防药液注射后从注射针孔流出。注射后用棉球按一下注射部位，也可以用不带钩的小镊子轻捏注射针孔。为避免注射后药液从针孔流出，也可以在注射时先把针头在皮下向前推一小段距离，然后再刺入腹腔。3 肌肉注射肌内注射的部位，要选择肌肉丰满或无大血管通过的肌肉，一般采用臀部。给大白鼠、小白鼠等小动物做肌肉注射时，用左手抓住鼠两耳及头部皮肤，右手取注射器，将针头刺入大腿外侧肌肉，将药液注入。4 静脉注射用大号研钵扣住或用固定器固定小鼠，露出尾巴。先用粗玻璃试管盛4550
41、的温水，把鼠尾浸于水中12 min，或用酒精棉擦拭鼠尾，使其尾静脉充血，此时可清楚看到3根暗红色的尾静脉。选择其中较为明显的一条，在尾下1/4处（约距尾尖23cm，因为尾梢端皮薄静脉浅，易于刺入；但不可离尾尖太近，防止尾巴碎断）用左手三指捏住尾巴，右手取连有4号针头的注射器，在左手捏住鼠尾处，使针头与尾巴成一适宜的角度（小于30度）刺入尾静脉。针头在尾静脉内平行推进少许，左手的三指捏住尾巴，并连针头和鼠尾一起捏住，以防鼠活动时针头脱出。先将针栓推进少许药液，注意药液注入静脉时是否畅通。若注射部位皮下发白，而且推进药液觉得阻力较大，说明针头未刺入静脉内，应换部位重刺。但要尽量做到一次注射成功，因
42、为重刺会增加注射的困难；另外，第二次重刺，也可能失去了尾静脉注射的最佳位置。若进针和注入药液都很畅通，表示针头确已刺入静脉，即可按规定剂量及速度（一般每秒钟注入0.050.1 ml为宜）推入药液。要注意不能有气泡进入，否则将导致动物死亡。注射完毕拔出针头，随即用左手拇指按住注射部位，右手放下注射器，取一棉球裹住注射部位并轻轻揉压，使血液和药液不流出。尾静脉注射的要点是：注射前尾静脉尽量充血；要用较细的针头（通常用4号）；针头刺入后，务必使其与血管走行方向平行；当针头进入顺利无阻时，要把针头和鼠尾一起固定好，切勿晃动，以免出血造成血肿或溶液溢出；注射部位尽量选用尾下1/41/3处；操作者要动作轻快而熟练，争取一次成功。大白鼠、小白鼠尾部血管分布有一定特点。尾静脉注射常用鼠尾左右两侧的两根尾静脉，它们位置比较固定，易于注入。背侧一根尾静脉也可做静脉注射，但因其位置容易移动，不如左右两侧的尾静脉易于注射。腹侧一根血管是尾动脉，一般不采用此处进行注射。5 灌胃这是一种用处较多的给药方法。有些药物采用其他注射方法效果不好，而用此法反而效果好；有些药物（如临床上的口服药用于动物实验）不能采取静脉注射、肌肉注射等方法而必须采用此法。 对于大小白鼠，用左手拇指和食指抓住鼠两耳和头部皮肤，其余三指抓住背部皮肤，将鼠抓持在手掌内（这种抓法不要抓得
