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1、实验二、琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖凝胶电泳是分子克隆的核心技术之一，用于分离、鉴定和纯化DNA片段。凝胶中DNA的位置可以用低浓度的荧光插入染料染色直接观察。,1、学习琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法2、检测质粒DNA的纯度、浓度和分子量,一、实验目的,琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，沸水中溶解，45开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA，其分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛效
2、应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。溴化乙锭(EB)为扁平状分子，在紫外光照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其发射的荧光强度较游离状态EB发射的荧光强度大10倍以上，且荧光强度与DNA的含量成正比。用肉眼观察，可检测到5 ng以上的DNA。（GoldviewI的原理可能类似）质粒DNA有环状超螺旋、开环、和线性三种构型，电泳时其迁移率各不同(超螺旋 线性 开环)。,二、实验原理,不同浓度琼脂糖凝胶的分离范围,1、0.8%：500bp-15kb2、1.0%：250bp-12kb3、 1.2%：150bp-6kb4、 1.5%： 80bp-4kb注意：高电压影响凝胶的分
3、离范围，使分辨率下降！,上次实验提取的质粒 pSK（3 kb） 和MP3 （6 kb）,三、实验材料,关于质粒大小在电泳中的鉴定：酶切后线性化条带电泳时所处的位置指示质粒的大小。,该质粒载体用的是pUC的复制子，拷贝数能达到500-700个。,四、仪器设备,五、实验用具,微波炉 电泳仪 微型电泳槽 紫外透射检测仪 凝胶成像仪,移液器 吸管头若干 加样板量筒100 ml1 三角瓶500 ml1,六、试剂,琼脂糖 5TBE电泳缓冲液 10 载样缓冲液 （loading buffer） GoldView I型核酸染色剂 （10000 ） DNA分子量标准（DNA marker）：Marker III
4、,10 载样缓冲液：10 mM EDTA，0.25%溴酚蓝，50%蔗糖,七、实验步骤,（一）制胶（1% agarose gel）（二）点样（三）电泳（四）观察,1、称取1 g琼脂糖加入盛有100 ml 0.5TBE电泳缓冲液的250 ml三角瓶中，摇匀，用电子天平称三角瓶的总重量。在微波炉上加热至琼脂糖完全溶解，放在天平上加蒸馏水至原重量。冷却到约60后，加入10 l的Goldview I，并摇匀。2、将溶解的琼脂糖（约50）倒入制胶模具中，直至厚度为4-6 mm，插入适当的梳子，在室温下冷却凝固。3、充分凝固后小心垂直向上拔出梳子，以保证点样孔完好。将凝胶置入电泳槽中，加0.5TBE电泳缓冲
5、液至液面覆盖凝胶1-2 mm。,（一）制胶,（二）点样,用微量取液器（P20）吸取质粒DNA样品2 l于点样板小孔中，再加入8 l TE及1 l的载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔，蓝色样品混合物将沉入点样孔下部。同时点5 l Marker作为分子量标准。,打开电源开关，调节电压至3-5 V/cm，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，约一小时后即可观察。,（三）电泳,（四）观察,将电泳好的凝胶置于紫外透射检测仪上，戴上防护观察罩，打开紫外灯，可见到绿色核酸条带，根据条带粗细和荧光强度，可粗略估计该样品DNA的浓度。同时根据已知分子量的标准DNA，通过线性DNA条带的相对位置初步估计样品的分子量。
6、,1、用微波炉煮胶时，胶液的量不应超过三角瓶容量的1/3，否则易溢出。2、煮好的胶应冷却至50左右时再倒，以免制胶板变形，并减少漏胶的机会。3、倒胶注意厚度(4-6 mm)，充分凝固后再拔出梳子，以保持齿孔形状完好。也可待胶稍凝固后，放入4冰箱10分钟，以加速胶的凝固。4、加样前赶走点样孔中的气泡，点样时吸管头垂直，切勿碰坏凝胶孔壁，以免使带型不整齐。5、一般情况下不必每点一个样品都换枪头，吸电泳缓冲液（正极）洗几次即可再点下一个样品。6、 凝胶中含有GoldViewI，切勿直接用手接触胶，废弃胶应集中处理，勿乱丢。,注意事项,常用电泳缓冲液配方,TAE是Tris-乙酸，缓冲容量小，但是溶解度
7、大，易于储存；TBE是Tris-硼酸，缓冲容量大，但是溶解度小，不易长期储存，易产生沉淀；分离大片段最好用TAE，小片段用TBE； TBE存在硼离子，会对一些酶的活性稍有影响。,TAE和TBE的主要区别,有的10 loading buffer中多了一样SDS（1%），它会使酶类（如Taq酶和限制性内切酶）变性，有终止酶促反应的作用。但在电泳时（以PCR产物为例），在电泳泳道上会产生一片弥散，如果电泳跑的距离短，和多出来一条带没有什么区别（大概1000 bp左右）。不加SDS的凝胶加样缓冲液只有电泳指示剂和沉淀样品的作用。,常用6凝胶加样缓冲液配方,Loading buffer的功能：第一、指示
8、剂溴酚蓝和二甲苯青起到指示的作用，显示电泳的进程，以便我们适时终止电泳；第二、甘油或者蔗糖可以加大样品密度，使样品密度大于TAE或TBE，从而沉降到点样孔中，防止样品飘出点样孔。另外，有的Buffer是加有SDS的，一般都会写明。SDS主要是促使聚合酶变性，因为没有除尽的聚合酶会结合在DNA双链上影响它的迁移速率。前沿指示剂溴酚蓝溶液在酸性条件下为黄色，碱性条件下为蓝色。因为提取的核酸一般都是溶解在碱性的TE缓冲液里，所以与loading buffer混合后变为蓝色。Marker跟DNA用一样的上样缓冲液，跑出来的结果才好，如果marker预先混合了上样缓冲液，DNA样品的上样缓冲液还是尽可能
9、找跟marker预混的上样缓冲液一致。,EDTA 是螯合剂，可以螯合钙和镁等金属离子，能够使金属依赖型核酸酶失活，从而防止DNA和RNA降解。,PCR产物电泳一般用6loading buffer就可以；酶切产物电泳和回收一般用10loading buffer以减少上样体积。,在紫外照射透视下，与双链DNA 结合的 吖啶橙呈现绿色荧光，而结合RNA或单链DNA 的吖啶橙则呈现红色荧光。,不同波长的紫外光,短波紫外光：254nm中波紫外光：302nm长波紫外光：365nm,1、为什么分光光度计测定的浓度很高，但电泳检测浓度却很低？,第一次电泳 第二次电泳第一次电泳 第二次电泳2011年结果,Gol
10、dViewI GoldViewII,Plasmid DNA Line 1, -DNA EcoR I/Hind Marker; Line 2, PUC18 (2686bp); Line 3, EcoR I digestion of PUC18; Line 4, Cambia3301 (11220bp); Line 5, EcoR I digestion of Cambia3301,质粒DNA三种构型：环状超螺旋、开环和线性。质粒电泳三条带：超螺旋、开环和复制中间体（即2个没有复制完全的质粒连在了一起）。同一种酶切后电泳谱带的规律：从高分子量到低分子量条带亮度逐渐减弱由于DNA Marker与酶切
11、产物所含成分不同，因此迁移率不一定相同！,质粒酶切电泳结果的分析,注意：如何判断单酶切是否完全？ 如何判断双酶切是否完全？,注意：同样的marker点在不同的胶孔中，电泳迁移率有差异。因为电泳时有边缘效应，边上的跑得快；跑胶时间长了会发热，整快胶受热不均时也会出现这种现象。,但因为抽提质粒时各人的操作差异,造成CCC/OC/L等多种构型，条带多少不一，亮暗也不一。但最典型的有三条：超螺旋、开环和复制中间体。如果RNaseA添加过少或者质量不高，会导致RNA降解不完全，会有一条远离点样孔跑的最快的残余RNA条带；根据RNA降解程度不同，条带亮度会有很大差异。提取过程中加溶液震荡剧烈会导致基因组片
12、段断裂成很小的片段，因此质粒中含有基因组的短片段会导致一些电泳条带的出现。还有电泳时间的长短造成各条带的移动距离也不一，一般较难判断是对是错。电泳跑的时间较短，尽管能分出大小，但习惯上跑开点对分辨差别不大的条带有好处，短胶容易出现误判。,碱裂解法抽提质粒电泳会出现几条带？,1、对于反复使用的琼脂糖凝胶，DNA的电泳效果有所降低，如要获得最佳的电泳图片，请使用新配置的凝胶和电泳缓冲液。2、胶厚度不宜超过0.5cm，胶太厚会影响检测的灵敏度。3、加入GoldView的琼脂糖凝胶反复融化可能会对核酸检测的灵敏度产生一定影响。4、电泳时使用新制的缓冲液可以明显提高电泳效果。注意电泳缓冲液多次使用后，离
13、子强度降低，pH值上升，缓冲性能下降，可能使DNA电泳产生条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。5、必须保证琼脂糖充分完全熔解，否则，会造成电泳图像模糊不清。6、电泳槽中缓冲液使用次数过多，缓冲能力下降。特别是TAE缓冲液，一般用2-3次就要更换，TBE缓冲液则可使用10次左右。7、为了节约成本，没有跑过DNA的凝胶部分可切下来重复利用，但反复熔化会降低分辨效率，建议不要超过3次。,关于琼脂糖凝胶使用的注意事项,思考题,1、DNA在碱性缓冲液中带什么电荷？电泳时向哪一极移动？2、什么是迁移率？影响迁移率的因素有哪些？什么是分辨率？分辨率与凝胶浓度的关系？3、DNA荧光染料的发光原理？4、质粒DNA存在哪些构型？其迁移率有何差异？5、loading buffer成分是什么？各成分有何作用？,
