发酵工程复习重点.docx

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1、微生物生物技术重点 第一章1 发酵的概念传统概念：指酵母作用于果汁或发芽谷物，进 行酒精发酵时产生CO2的现象。生物学概念：发酵是指微生物在无氧条件下分 解代谢有机物质释放能量的过程。（生化）工业生物学家概念：利用微生物在有氧或无氧条件下的生命活动来制备微生物菌体或其代谢产物的过程现代概念：培养生物细胞（含动植物和微生物）来制取产物的所有过程 2 生物工程（ Microbial engineering ）是利用微生物的特定性状和功能，通过现代化工程技术 生产有用物质或直接应用于工业化生产的技术体系；是将传统发酵与现代DNA重组、细胞融合、分子修饰和改造等新技术结合并发展起来的现代发酵技术。发酵

2、工程的发展简史1、传统的发酵时期天然发几千年酒 （古埃及龙山文化）啤酒、黄酒、酱油、泡菜等特点 多数产品为嫌气性发酵 非纯种培养 单凭经验传授技术，使产品质量不稳定（不了解微生物与发酵的关系）2、近代发酵工程时期纯培养技术1665 英国物理学家Robert Hooke（罗伯特胡克）细胞壁1680 荷兰列文虎克(Antonie vanLeeuwenhoek) 活细胞人类认识到微生物的存在特点多数产品为嫌气性发酵 非纯种培养 单凭经验传授技术，使产品质量不稳定（不了解微生物与发酵的关系）由天然发酵阶段转向纯培养发酵（ 第一次转折过程特点产品的生产过程较为简单，对生产要求不高，规模不大3、近代发酵工

3、程时期深层培养技术 出现于20世纪40年代，以抗生素的生产为标志 青霉素的发现与大量需求表面培养法(surface culture) 效价40U/mL，纯度20%，收率30% 二战期间，青霉素发酵生产成功青霉素发酵生产的成功，给发酵工业带来两大功绩： 开拓了以青霉素为先锋的庞大抗生素发酵工业 建立深层培养法（submerged fermentation），把通气搅拌技术引入发酵工业。它使得需氧菌的发酵生产从此 走上了大规模工业化生产途径。通气搅拌液体深层发酵 技术是现代发酵工业最主要的生产方式机械搅拌通气发酵技术的建立是第二次转折4、近代发酵工程时期代谢控制发酵技术 定义：以动态生物化学和微生

4、物遗传学为基础，将微生 物进行人工诱变，得到适合于生产某种产品的突变株，再 在人工控制的条件下培养，即能选择性地大量生产人们所 需要的物质。1956日本人Kinoshita（木下祝郎）谷氨酸发酵已用于氨基酸、核苷酸、有机酸以及一部分抗生素的发 酵代谢控制发酵技术的建立是第三次转折5、近代发酵工程时期连续化、自动化发酵技术6、近代发酵工程时期开拓发酵原料时期7、现代发酵工程时期现代分子生物学技术定义：应用分子生物学和分子遗传学的方法，人为的将任意生物的特定又有用的遗传基因组合到特 定微生物的基因中去，在分子水平上选育新的物 种，创造新的微生物，从而达到定向改变自然界微 生物所不能合成的产物。（基

5、因工程阶段）现代分子生物学技术的应用是第四次转折初级代谢产物： 指微生物从外界吸收各种营养物质，通过分解代谢和合成 代谢，生成维持生命活动所需要的物质，如氨基酸、核苷酸、 脂类、有机酸、糖等，即为初级代谢产物次级代谢产物： 指某些微生物在一定的生长时期（通常是稳定期），能合 成一些具有特定功能的产物，而这些产物与微生物的生长繁殖 无明显关系，如抗生素、色素、生物碱、胞外多糖等，即为次 级代谢产物比较初级代谢产物和次级代谢产物初级代谢产物： 与菌体生长相伴随的产物， 氨基酸、核苷酸、维生素、有机酸、溶剂 菌体对其合成反馈控制严密，一般不过量积累次级代谢产物： 与菌体生长不相伴随，以初级代谢产物为

6、原料而合成 抗生素、生物碱、毒素、胞外多糖等 结构常较复杂对环境条件敏感甾体转化 化学转化：步骤繁多、得率低、价格昂贵（Savett, 576kg脱氧 胆酸，30多步反应，两年938mg醋酸可的松） 生物法：高效、收率高（1952年，Munrry等，黑根霉，仅1步就将孕酮11位上导入一个羟基，使从孕酮合成皮质酮只需3步，这样才使可的松问世）第二章发酵工业对微生物菌种的要求1、能在廉价原料制成的培养基上迅速生长，并形成所需的代谢产物，产量高2、可以在易于控制的培养条件下迅速生长和发酵，且所需酶活力高3、根据代谢控制的要求，选择单产高的营养缺陷型突变株或调节突变株或野生菌株4、选育抗噬菌体能力强的

7、菌株，使其不易感染噬菌体5、菌种纯，不易变异退化，以保证发酵生产和产品质量的稳定性6、菌种不是病原菌，不产生有害的生物活性物质和毒素，以保证安全细菌、酵母菌、霉菌和放线菌细菌1、枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis生芽孢、需氧菌，G+，30-39，pH6.7-7.2分布广，常存在于枯草、土壤等，一般为腐 生菌；生产各种酶制剂：如淀粉酶和蛋白酶2、大肠杆菌Escherichia coli可利用大肠杆菌制取天冬氨酸、苏氨酸、缬氨酸等大肠杆菌的谷氨酸脱羧酶在工业上被用来进行谷氨酸 的定量分析基因工程的很好材料3、乳酸杆菌(Lactobacillus sp.) 革兰氏阳性，无芽孢，厌氧或兼

8、性厌氧可生产乳酸干酪的成熟、乳脂的酸化和腌菜、泡菜制作6、醋酸杆菌 (Acetobacter) 不形成芽孢，G，好气性分两群：1）只将乙醇氧化成醋酸2）将产生的醋酸继续氧化成CO2和水可生产醋酸7、棒状杆菌 (Corynebacterium)以葡萄糖为原料发酵产生酸，是谷氨酸和其他氨基酸的高产菌生产谷氨酸等9、黄单胞菌 (Xanthomonas) 细胞直杆状，G，无芽孢，极生鞭毛在含蔗糖的琼脂平板上形成圆形、边缘整齐、粘稠光滑的黄色菌落；液体培养形成黄色粘稠的胶状物荚膜多糖，其黄色为一种水溶性色素 野油菜黄单胞菌(X. campestris) 可以淀粉生产黄原胶(Xanthan gum)放线菌

9、链霉菌属 ( Streptomyces )灰色链霉菌(Streptomyces griseus)生产链霉素金霉素链霉菌 (Streptomyces aureofaciens)在PDA培养基上生长时，基内菌丝产生金黄色 色素生产金霉素红霉素链霉菌 (Streptomyces erythreus)产红霉素龟裂链霉菌 (Streptomyces rimosus)菌落灰白色，表面后期有皱折，呈龟裂状 生产土霉素小单胞菌属 (Micromonospora)与一般放线菌不同，菌丝体长入培养基内，不形成气生菌丝，而在基内菌丝体上长出 孢子梗，其顶端生一个球形、椭圆形孢子。菌落致密，与培养基紧密结合在一起，表

10、面凸起，多崎岖，疣状；菌落常为橙黄色、红色、深 褐色、黑色和兰色。酵母菌啤酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)啤酒酵母在液体培养基中的生长行为有两类上面酵母发酵度较高，不易凝集沉淀，浮于上面下面酵母发酵度较低，易凝集沉淀啤酒酵母的应用非常广，常用于传统的发酵行业，如啤酒、白酒、果酒、酒精、药用酵母、面包 制作，故又称酿酒酵母。5、假丝酵母 (Candida) 能形成假丝，液体培养时能形成浮膜可生产SCP、甘油、脂肪酶毕赤氏酵母( Pichia ) 霉菌 曲霉Aspergillus米曲霉 ( Aspergillus oryzae )有较强的蛋白分解能力，同时又具有糖化能力

11、； 酿酒中的糖化菌；蛋白酶和淀粉酶的生产菌；还可以用于L-乳酸的生产黑曲霉 ( Aspergillus niger )1具有多种强大的酶系，如淀粉酶、蛋白酶、果 胶酶、纤维素酶和葡萄糖氧化酶等；2还能产生多种有机酸，如抗坏血酸、柠檬酸、 葡萄糖酸和没食子酸等3是生产柠檬酸和葡萄糖酸的重要菌种产黄青霉 ( Penicillum chrysogenum )生产青霉素，也可用来生产葡萄 糖氧化酶、葡萄糖酸、柠檬酸和抗坏 血酸橘青霉 ( P. citrinum ) :许多菌系可产生橘霉素，也能产生脂肪酶、葡 萄糖氧化酶和凝乳酶微生物工程工业生产水平的三个决定要素:1生产菌种的性能2发酵和提取工艺条件3

12、生产设备分离与筛选菌种的具体做法一般分4个步骤：样品采集 增殖培养 纯种分离 生产性能测定富集(enrichment)培养是在目的微生物含量较少时，根据微生物的 生理特点，设计一种选择性培养基，创造有 利的生长条件，使目的微生物在最适的环境 下迅速地生长繁殖，数量增加，由原来自然 条件下的劣势种变成人工环境下的优势种，以利分离到所需的菌株。目的菌种的分离与筛选分离的效率取决于培养基养分、pH值和加入的选择性抑制剂通常有两种方法1 涂布法 将菌液梯度稀释后以灭菌的涂布器涂布于平板培养 基表面。（易污染菌落，且一种菌/平板）2 影印平板法 把长有许多菌落的母培养皿倒置于包有灭菌丝绒布 的圆木柱上，

13、然后把这一“印章”上的细菌一次接种 到一系列选择培养基平板上。（不适用不长孢子的 链霉菌和游动细菌）可显著提高分离筛选效率的方法有1、透明圈法在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培养基混浊能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明圈，圈的大小初步反应菌株利用底物的能力。2、变色圈法对于一些不易产生透明圈产物的产生菌，可在底物平板中加入指示剂或显色剂，使目的微生物菌落周围 呈现变色圈，从而能被快速鉴别出来；3、生长圈法通常用于分离筛选氨基酸、核苷酸和维生素的产生菌将待检菌涂布于高浓度指示菌并缺少所需营养物的平板上进行培养，若某菌株能合成平板所需的营养物，在该菌株的菌 落周围便会形成一个混浊的生长

14、圈4、抑菌圈法常用于抗生素产生菌的分离筛选据估计，筛选1万个菌株才能得到1株有用的抗生素 产生菌；因此，设计一个准确、快速的筛选模型十 分重要。抑菌圈法是常用的初筛方法。若被检菌能分泌某些抑制菌生长的物质，如抗生素等，便会在该菌落周围形成指示菌不能生长的抑菌圈菌种选育定义：应用微生物遗传和变异理论，用人工方法(或自然变异的方法)造成变异，再经过筛选以得到人们所需菌种的过程。菌种选育的目的是：a.为了不断提高发酵工业产品的产量和质量；b.增强对所用原辅料的适应性；c.增强对不良培养条件的抵抗；d.缩短生产周期；e.简化发酵和下游处理工艺。诱变育种就是利用物理或化学诱变剂等处理均匀分散的微生物细胞

15、群，促使其突变率大幅度提高，然后采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选少数符合育种目标 的突变株用于生产和研究表型迟延现象：指某一突变在DNA复制和细胞分裂后，才在细胞表型上显示出来，造成不纯的菌落的现象。（如多核）生理性延迟现象：菌体虽然发生了突变，并且突变基 因由杂合状态变成了纯合状态，但仍然不表现突变性 状。如营养缺陷型凡能引起生物体遗传物质发生变异的因素，统称诱变剂分为 物理 化学 生物诱变剂（亚硝酸盐）菌种退化通常指在较长时期传代保藏后，菌株的一个或多个生理 性状和形态特征逐渐减退或消失的现象。防止菌种退化的方法控制传代次数合理的育种：单核（避免表型延迟） 选用合适的培养基 创造良

16、好的培养条件采用有效的菌种保藏方法及多种保藏方法菌种的复壮在菌种的生产性能尚未衰退前，就经常有意识的进行纯种分离和生产性能的测定工作，从而逐步提高 菌种的生产特性。（广义）概念：在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和测定生产性能等方法，从衰退的群体中找出少数尚未衰 退的个体，从而达到恢复该菌原有典型性状的目的。（狭义）菌种复壮的方法退化菌种的复壮：稀释分离法、平板划线法、组织分离法通过寄主进行复壮：适用退化的寄生型微生物联合复壮：诱变育种菌种保藏主要是根据菌种的生理、生化特性，在人工创造的条件下，使其代谢活动处于不活泼的休眠状态，生长繁殖受到 抑制。这样也减少了菌种的变异率。方法 1真空冻干

17、保藏2蒸馏水悬浮法3矿物油中浸没保藏 4干燥载体保藏种子扩大培养指将保存在沙土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐 逐级放大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子种子的制备过程分两个阶段：实验室种子制备、生产车间种子制备实验室种子制备1、孢子的制备：适用于产孢子能力强及孢子发芽、生长繁殖快细菌孢子的制备： C限制，N丰富；霉菌孢子的制备：大米、小米、麸皮、麦粒等 放线菌孢子的制备：含适合产孢子的物质组成，如麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨及无机盐等如：谷氨酸棒杆菌、青霉、龟裂链霉菌2、液体种子的制备：产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种好氧培

18、养：如产卡那霉素的S.kanamuceticus（卡那链霉菌）用摇瓶液体培养法。 斜面试管三角瓶摇床种子罐厌氧培养：如酵母菌 斜面试管三角瓶卡式罐种子罐生产车间种子的制备1、种子罐的作用：使孢子发芽，生长繁殖成菌（丝）体保持种子的活力 保证种子的数量2、种子罐级数的确定种子罐级数是指制备种子需逐级扩大培养的次数，菌种生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度，所采用发酵罐的容积如：细菌，二级；霉菌，三级；放线菌，三级或四级3、确定种子罐级数需注意：种子级数越少越好。简化工艺和控制，减少染菌太少，导致接种量小发酵时间长，降低生产率，增加 染菌机会 级数随产物的品种及生产规模确定。但工艺或其他条件改变（如工

19、程菌）时，也有可能影响级数二、种子质量的控制 （重要）影响孢子质量的因素及控制影响因素通常有：培养基、培养条件、培养时间和冷藏时间等培养基原材料（主要原因）：产地、品种、加工方法、用量等 无机离子 水质解决的措施：1培养基所用原料要经过发酵试验合格才可使用 2严格控制灭菌后培养基的质量 3斜面培养基使用前，需在适当温度下放置一定时间4单一氮源（生产），较复杂的有机氮源（选种或分离）培养条件温度：有显著影响。如龟裂链霉菌在高于37培养C代 谢、氨基氮回升提前、菌丝过早自溶、效价降低等措施：严格控制孢子斜面的培养温度培养时间和冷藏时间培养时间：衰老的孢子不如年轻的孢子，过于衰老的导致生产能 力下降

20、措施：严格控制在孢子量多、成熟、发酵产量正常阶段终止培养湿度：对数量和质量有较大影响。 措施：严格控制孢子斜面的培养湿度冷藏时间：对孢子的生产能力有影响。如灰色链霉菌在6冷藏2个月比1个月发酵单位下降18%；3个月下降35%措施：根据生产计划有规律的培养成熟孢子影响种子质量的因素及控制影响因素通常有：孢子的质量、培养基、培养条件、种龄、接种量等培养基1营养成分适合种子培养的需要2选择有利于孢子发芽和菌体生长的培养基3营养上要易于被菌体直接吸收和利用4营养成分要适当丰富和完全，N和Vitamin要高5最后一级种子罐的培养基成分应尽可能与发酵培养基相同培养条件 温度：选择最适温度 通气量：选择适宜

21、的通气量种龄定义：指种子罐中培养的菌（丝）体开始移入下一级种 子罐或发酵罐时的培养时间 通常以处于生命力极旺盛的对数生长期，菌体量还未达到最大值时的培养时间较为合适接种量定义：指移入的种子液体积占接种后培养液体积的比例接种量大可以缩短发酵周期 接种量的大小决定生产菌种在发酵罐中生长繁殖的速度采用较大接种量的优缺点：优点：缩短延滞期和对数期的时间，产物形成速度加快；种子液中大量的体外水解酶有利于原料的利用菌量大，可减少污染杂菌机会缺点：菌体生长过快，培养液粘度增加溶氧不足，影响产物合成培养种子费工费时同时也移入了过多的代谢废物，影响正常发酵生产中通常进行两项检查 菌种稳定性的检查（筛选） 无杂菌

22、检查种子质量标准 细胞或菌体 生化指标 产物生成量 酶活力第三章培养基按生产工艺分 孢子培养基 种子培养基 发酵培养基1）孢子培养基供制备孢子用的，要求此种培养基能形成大量优质孢子。常用固体培养基孢子培养基基本要求：基本要求是能使菌体迅速生长，产生较多优质孢子，且不易引起菌种发生变异。配制时需注意：A）营养不要太丰富（特别是有机氮源），否则不易产孢子。C）注意pH和培养基的湿度。常用孢子培养基： 麸皮培养基 小米培养基 玉米碎屑培养基 大米培养基用葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏和食盐等配制的琼脂斜面培养基2）种子培养基供孢子发芽或菌体生长繁殖用的，营养成分应容易被菌体吸收利用。营养要求比较丰富和完全，

23、氮源和维生素的含量也要高些，但总浓度以略稀薄为好，这样可达较高的溶解氧，供大量菌体生长和繁殖。种子培养基的成分要考虑在代谢过程中能维持稳定的pH，其成分还要根据不同菌种的主要特征而定。一般种子培养基都用营养丰富而完全的天然有机氮源，因为有些氨基酸能刺激孢子发芽。但无机氮源容易利用，有利菌体的迅速生长，所以在种子培养基中常包括有机氮源和无机氮源。最后一级的种子培养基的成分最好能较接近于发酵培养基，这样可使种子进入发酵培养基后能迅速适应，快速生长。 （营养成分要求速效）氮源凡是作为微生物细胞结构或代谢产物中氮的来源的营养物质， 都称为氮源有机氮源 豆饼（粕）粉、花生饼粉、鱼粉、蚕蛹粉、酵母粉、玉米

24、浆、 尿素、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏等无机氮源 铵盐、硝酸盐等无机氮源和尿素、玉米浆等可被迅速利用，为速效氮蛋白质氮则需先水解成肽和氨基酸后才能被吸收利用，属迟效氮在常用的无机氮中，象硫酸铵那样被微生物代谢后形成酸性物质的，为生理酸性物质；硝酸钠被同化时则引起培养液pH上升，为生理碱性物质前体(precursor)：指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成过程中结合到产物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因此有较大的提高。淀粉水解糖的制备酸解法（acidhydrolysis method）以酸（无机酸或有机酸）为催化剂，在高温高压下将淀粉水解转化为葡萄糖的方

25、法。优点 生产简易,对设备要求简单;水解时间短; 设备生产能力大等优点。缺点: 要求有耐腐蚀，耐高温、高压的设备; 副反应的发生，这将造成葡萄糖的损失而使淀粉转化率降低; 对淀粉原料要求严格，淀粉颗粒不宜过大,大小要均匀；颗粒大，易造成水解不透彻；淀粉乳浓度也不宜过 高,浓度高,淀粉转化率低。酶解法（enzyme hydrolysis method）是用酶将淀粉水解为葡萄糖。（双酶水解法）酶解法可分两步：第一步：利用-淀粉酶将淀粉转化为糊精和低聚糖，使淀粉的可溶性增加，此过程称“液化”；第二步：利用糖化酶将糊精或低聚糖进一步水解，转变为葡萄糖，此过程称“糖化”。双酶法优点： 1）淀粉水解是在酶

26、的作用下进行的，酶解反应条件温和，对设备要求较低。2）微生物酶作用的专一性强，淀粉的水解副反应少，因而水解糖p液H纯6.度0-7高.0，；淀用粉糖的化转酶化，率反（应出温糖度率50）-60高。C， pH3.5-5.03）可在较高淀粉乳浓度下水解，且可采用粗原料。4）酶法制得的糖液色浅、较纯净、无苦味、质量高。双酶法缺点： 酶解反应时间较长（需2-3天），要求的设备较多，需具备专门培养酶的条件，由于酶本身是蛋白质，易造成糖液过滤困难。酸酶结合法酸酶法 淀粉糊精或低聚糖+（糖化酶葡萄糖值（DE值;dextroseequivalentvalue ） 指葡萄糖（所有测定的还原糖都当作葡萄糖）占干物质的

27、百分率，用于表示淀粉水解程度及糖化程度。酸酶法特点1液化速度快； 2糖化是由酶来进行的，对液化液要求不高，可采用较高的淀粉乳浓度，提高生产效率；3用酸较少，产品颜色浅，糖液质量较高。酶酸法 淀粉+（-淀粉酶）糊精或低聚糖+（酸）葡萄糖酶酸法特点：可用于粗原料淀粉，淀粉浓度也较酸法高，糖液色浅培养基优化1、确定起始培养基；2、单因素试验,确定最适宜的培养基成分；3、多因素试验，进行各组分之间浓度优化和最佳配比；4、放大试验5、确定最终培养基第四章按照不同的工业发酵方式分类：根据微生物需氧或不需氧 厌氧发酵 好氧发酵根据培养基是固态或液态 液态发酵 固态发酵根据发酵位置是表面或深层 表面发酵 深层

28、发酵根据发酵是间歇或是连续进行（重点）分批发酵 连续发酵 补料分批发酵根据菌种是否被固定 游离发酵 固定化发酵根据所用的菌种是单一或多种 单一纯种发酵 混合发酵分批发酵定义：营养物和菌种一次加入进行培养，直到结束放罐，中间除了空气进入和尾气排出，与外部没有物料交换。特点操作简单，除了控制温度、泡沫和pH及通气以外，不进行任何其他控制从细胞所处的环境看，发酵初期营养物质过多，可能抑制微生物生长；发酵中后期又可能因为营养物减少而降低培养效率从细胞的增殖来看，初期浓度低，增长慢；后期浓度高，但营养物浓度低，也生长不快；总的生长能力不是很高。分批发酵的具体操作过程种子培养系统开始工作（空消、实消） 接

29、种（摇瓶种子接入种子罐） 培养（同时进行主发酵罐的准备工作，若为大型发酵罐，则对培养基连消）种子转移到主发酵罐中 发酵（控制温度、pH值；搅拌和通气） 结束后提取、精制补料分批发酵定义：是介于分批发酵和连续发酵之间的一种发酵技术，是指在微生物分批发酵中，以某种方 式向培养系统补加一定物料的培养技术，又称半连续发酵。分两种类型： 单一补料分批发酵：在开始时投入一定量的基础培养基，到发酵过程的适当时期，开始连续补加碳源、 氮源和其他的必需基质，直到发酵液体积达到发酵罐最 大操作容积后，停止补料，最后将发酵液一次全部放出。 特点：受罐容积的限制反复补料分批发酵：在单一补料分批发酵的基础上，每隔一定时

30、间按一定比例放出一部分发酵液，使发酵液体积始终不超过发酵罐的最大操作容积，从而在理论上可以延长发酵周期，直至发酵产率明显下降，才最终将发酵液全部放出。 特点：保留了优点，避免了缺点补料分批发酵的优点同分批发酵相比： 可以解除营养物基质的抑制、产物反馈抑制和葡萄糖效应；可以避免在分批发酵中因糖过多，造成细胞大量生长，耗氧过多，以致通风搅拌设备不能匹配的状况；可以减少菌体量，提高有用产物的转化率。葡萄糖效应：葡萄糖被快速分解代谢，所积累的产物在抑 制所需产物合成的同时，也抑制了其它一些碳源、氮源的分解利用。（葡萄糖分解阻遏效应）发酵工艺控制微生物发酵是一个复杂的生化过程，涉及诸多因素。这里主要讲温

31、度、pH值、溶氧、泡沫及补料等因素对发酵的影响及其控制一、温度对发酵的影响及其控制 Q发酵 = Q生物 + Q搅拌 - Q蒸发 Q辐射方法：罐壁调温 夹层调温 罐内调温二、溶氧浓度对发酵的影响及控制1、供氧方面1）增加空气中氧的含量，使氧分压增加，进行富氧通气2）提高罐压3）改变通气速率4）增加搅拌速度2、需氧方面1）调整养料的浓度2）调节控制温度3、提高溶解氧的措施（重点）1）搅拌是提高溶氧的重要的措施2）在培养基方面：控制限制因子，以降低菌的生长速率，限制菌对氧 的大量消耗，提高溶氧水平3）改善发酵液的黏度：降低黏度，增大流动性，能有效的提高传质效果， 尤其是溶氧染菌，是指在发酵培养基中侵

32、入了有碍生产的其它微生物。从染菌的现象分析染菌的原因1）从染菌的时间分析 早期（如接种后12h或24h），除了种子带菌外，主 要是培养基或设备灭菌不彻底。 相反，中、后期染菌则可能与中间补料、设备渗漏以 及操作不合理等有关，也可能是空气过滤器不严所致。2）从污染的杂菌类型分析 污染耐热的芽孢杆菌，多数是因培养基灭菌不彻底或 设备存在死角所致； 污染无芽孢杆菌、球菌等不耐热菌，可能是从蒸汽的 冷凝水中带来的，或空气系统不严造成。3）从发酵罐及批次分析大批发酵罐染菌是指整个工厂各个产品的发酵罐都出现 杂菌现象，而且染的是同一种菌，主要是空气过滤器除 菌不净，空气带菌而造成的。个别发酵罐连续染菌，较

33、多地是由于设备问题而造成的。 如阀门的渗漏或罐体破损，特别是蛇形管的穿孔，有时不易察觉。有时设备破损引起的染菌会出现每批染菌时间前移现象。染菌通常通过3个途径发现：无菌试验、发酵液直接镜检、发酵液的生化分析。其中无菌试验是判断染菌的主要依据。无菌试验方法有平板培养、斜面培养、肉汤培养等， 其中以双碟和肉汤培养为主。 第五章优良的发酵设备应具有：严密的结构良好的液体混合性能较高的传质传热速率配套而又可靠的检测及控制仪表 判断发酵设备好坏的唯一标准：能否适合工艺要求，获得最大生产效率通用式发酵罐（机械搅拌通风发酵罐）基本条件1、适宜的径高比。高：直径约为1.742、能承受一定的压力。3、搅拌通风装

34、置要能使气泡分散细碎、气液充分混合，保证发酵液必须的溶解氧，提高O2的利用率。4、应具有足够的冷却面积。代谢产热5、发酵罐内应抛光，尽量减少死角。避免积污、染菌6、轴封应严密，尽量减少泄漏。部分配件1、搅拌器机械搅拌的作用：（重点） 打碎空气气泡，增加气液接触面积，以提高气 液间的传质速率；使发酵液充分混合，液体中的固形物料保持悬浮状态。2、挡板作用： 改变液体的方向，由径向流改为轴向流，使液体激烈翻动，增加溶解氧。3、空气分布装置作用：通入无菌空气并使分散均匀位置：罐底中央类型：环形管：环径=0.8d; 多喷孔，向下；易堵单管式：普遍采用 向下的管口距罐底约3060mm 分散器（防止空气喷击

35、、蚀穿罐底）灭 菌一、空罐灭菌1、目的：1）消除罐内死角，确保下一批发酵的成功2）杀灭与罐直接相通的各管路、阀门的微生物2、步骤： （热蒸汽法）1）先彻底清洗作用：a）有利于消除死角b）免于料受热（尤其是干热的部位）干焦于罐体、管或阀门2）从底部通入蒸汽 3）排冷气4）升压 打开各个需灭菌的管路、放气阀等（如接种管、取样管、空气进管、流量计等）5）保压 通常1kg/cm2, 3060min6）降温 关闭各放汽阀、进汽阀；然后慢慢放汽，或自然冷却，或泵循环水加速冷却二、实罐灭菌1、在进行培养基灭菌之前，通常应先把发酵罐的分空气过滤器灭菌并用无菌空气吹干。2、预热 向夹套或蛇管中通入蒸汽，间接将培

36、养基加热至70左右。作用：利于糊化；减少冷凝水的生成；减轻噪音3、开启蒸汽管，向培养基中通入蒸汽，升温。（3 4两步为升温阶段）4、罐压达1kg/cm2 (0.1MPa)时，装在发酵罐封头的接种管、补料管、消泡剂管等应排汽。5、保温 调节好各进汽和排汽阀门，使罐压和温度保持在一稳定水平，维持一定时间。在保温阶段，凡进口在培养基液面下的各管道都应通入蒸汽；在液面上的其余管道则应排放蒸汽，这样才能保证灭菌彻底，不留死角。6、保温结束后，依次关闭各排汽、进汽阀；待罐内压力降至0.50.8kg/cm2时，向罐内通入无菌空气，向夹套或蛇管中通入冷水，使培养基降至所需温度。通入无菌空气的作用：加速降温；

37、保持罐内正压 （降温阶段） 第六章一、啤酒生产的原料 以大麦为主要原料，以其他谷物等为辅料，并添加少量啤酒花等。1、大麦（主原料）2、辅助原料 辅料以不发芽谷类为主，如大米和脱胚玉米等 降低生产成本， 提高啤酒的非稳定性，降低啤酒的色度，改善麦汁浸出物组成3、酒花（hop）酒花的功能：1）赋予啤酒香味和爽口苦味2）增进啤酒泡持性和稳定性3）与麦汁共沸时能促进蛋白凝固，利于澄清4）增加麦汁和啤酒的防腐能力酒花的成分：1）-酸 具苦味和防腐能力，其多少是衡量酒花质量的重要标准2）酒花油 花粉内，味芳香；萜烯、酯类等3）多酚物质能与蛋白结合，促进凝固沉淀（双重性稳定、浑浊）抗生素定义：由微生物(包括

38、细菌、真菌、放线菌等)或动植物等 在其生命活动过程中所产生的，或经过其他方法（生物化学或半合成）衍生的，在一定(低微)浓度下，具有抑制或杀灭病原体的一类化学物质。根据微生物来源分类：放线菌产生的抗生素：链霉素、金霉素等真菌产生的：青霉素、头孢菌素类、灰黄霉素 等细菌产生的：短杆菌肽（地衣芽孢杆菌） 植物或动物产生的：大蒜素、乳铁蛋白 (Lactoferrin)等以放线菌产生的最多，真菌次之，细菌再次之，动植物很少。放线菌中以链霉菌属产生的抗生素最多根据抗生素的作用分类：抗细菌类抗生素：青霉素族抗生素、头孢菌族抗生素、喹诺酮类抗生素等抗真菌类：两性霉素B、制霉菌素等 抗结核分枝杆菌类：氨基糖苷类

39、等 抗癌细胞类：丝裂霉素等 抗病毒和噬菌体类： 抗原虫类：灭滴虫素根据抗生素的作用机制分类：抑制细胞壁合成的抗生素：青霉素、头孢菌素、杆菌肽等影响细胞膜功能的：多粘菌素、短杆菌素等抑制核酸合成的：丝裂霉素、利福霉素等 抑制蛋白质合成的：链霉素、庆大、卡那等 抑制生物能作用的：抗霉素（antimycin）（抑制电子转移）根据化学结构分类：-内酰胺类：青霉素、头孢菌素氨基糖苷类：链霉素、庆大、卡那等 大环内酯类：红霉素、乙酰螺旋霉素等 四环类：四环素、金霉素、土霉素等 多肽类：多粘菌素、杆菌肽德国 多烯类：制霉菌素、两性霉素B 苯烃基胺类：氯霉素等 蒽环类：罗红霉素、正定霉素等 环桥类：利福霉素等

40、青霉素的生产工艺作用机理：抑制肽聚糖合成的第三阶段只生长中的细胞有效，静止细胞无效发酵工艺过程1、生产孢子制备工艺斜面种子：砂土孢子用甘油、葡萄糖、蛋白胨组成的固体培养基进行培养 米孢子：移植到小米或大米固体培养基 上，生长7天，25 注意：每批孢子必需进行严格摇瓶试验，测定效价及杂菌情况。2、种子罐培养工艺一级种子发酵：发芽罐，孢子萌发，形成菌丝。培养基：葡萄糖，玉米浆，碳酸钙，玉米油，消沫 剂等。空气流量1：3（体积比）；300-350rpm；pH自然，温度271,40h二级种子罐：繁殖罐，大量繁殖。接种量10培养基：葡萄糖、玉米浆，玉米油，消沫剂等。1:1-1.5；250-280rpm；

41、pH自然，251。10-14h 质量：菌丝致密，粗壮，III期，倍增期6-8h3、生产罐培养工艺三级罐：生产罐；接种量12-15培养基：花生饼粉，葡萄糖，尿素，硝酸铵，硫代硫酸钠，苯乙酰胺，CaCO3, 玉米油, 参数条件：通气量1：0.8-1.2；150-200r/min； 前60小时:pH6.4-6.6，26；60小时后: pH6.7, 24。4、发酵培养与过程控制操作方式：补料分批式发酵发酵罐：100M3，装料80M3.带放: 6-10次，带放量10，间隔24h。发酵周期：180-220h添加青霉素侧链前体时期：合成阶段 种类：苯乙酸及其衍生物，苯乙酰胺、苯乙胺、苯乙酰甘氨酸 毒性：抑制

42、细胞生长和青霉素合成。 策略：低浓度流加 浓度：苯乙酸0.1%，苯乙酰胺0.05-0.08% 控制：保持供应速率略大于生物合成需要。提炼工艺过程1、预处理与过滤青霉素的存在部位：发酵液浓度较低：3060Kg/M3（青霉素G钠盐0.6ug为1个IU ）含有大量杂质：菌体细胞、核酸、杂蛋白质、细胞壁多糖等、残留的培养基、色素、盐离子、代谢产物等目的：浓缩目的产物，去除大部分杂质，改变发酵液的流变学特征，利于后续的分离纯化过程。预处理:发酵液加少量絮凝剂沉淀蛋白2、萃取（溶媒萃取法）目的：提纯浓缩 萃取：23次。原理：青霉素游离酸易溶于有机溶剂，而青 霉素盐易溶于水。萃取剂：青霉素分配系数高的有机溶剂。 工业上通常用：醋酸丁酯和醋酸戊酯。萃取：23次。3、脱色-活性炭脱色目的：除去色素、热原步骤：在BA液中加活性炭，除去色素、热原，过滤，除去活性炭4、结晶-用丁醇共沸结晶法15