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1、.,现代生物医学进展 2008 Vol.8 1729,.,很长时间里，蛋白质翻译后修饰并未引起足够重视，直到2004 年泛素介导蛋白质降解的发现获得诺贝尔奖之后，这一情形才有明显改观。迄今，人们已发现多达200 多种的蛋白质修饰。蛋白质翻译后修饰是调节蛋白质生物学功能的关键步骤之一，是蛋白质动态反应和相互作用的一个重要分子基础，同时，它也是细胞信号网络调控的重要靶点。蛋白质翻译后修饰几乎参与了细胞所有的正常生命活动过程，并发挥十分重要的调控作用，目前已经成为国际上蛋白质研究的一个极其重要的领域。,.,第三章 蛋白质翻译后修饰,第一节 原核生物的翻译后修饰第二节 真核生物的翻译后修饰,.,一些新
2、生肽链从核糖体上释放下来后可以直接折叠成最终的三维结构。但多数情况下是新生肽要经过一系列的加工修饰，才具有功能。,第一节 原核生物的翻译后加工,1.切除加工2.糖基化3.甲基化4.磷酸化5.乙酰化6.泛素化,.,1.切除加工包括去掉N端的甲酰甲硫氨酸和信号肽序列。信号肽（Signal peptide），也叫引导肽（leader peptide），是决定多肽最终去向的一段序列，通常较短，典型情况下位于N端。在细菌中的一个例子就是多肽要插入细胞质膜必须借助信号肽序列。2.糖基化 曾经一度认为糖基化只存在于真核细胞中，但研究表明，原核生物中也存在蛋白质的糖基化修饰，而且由于在糖基的单糖结构和组成上的
3、不同而显得比真核生物中的更加丰富多样。,.,3.甲基化蛋白质的甲基化是指在甲基转移酶催化下，甲基基团由S- 腺苷基甲硫氨酸转移至相应蛋白质的过程，既可以形成可逆的甲基化修饰，如羧基端的甲基化修饰；也可以形成不可逆的甲基化修饰，如氨基端的甲基化修饰。在原核生物中也普遍存在蛋白质的甲基化。在大肠杆菌和有关细菌中发现的一种甲基转移酶能甲基化膜结合的化学受体蛋白的谷氨酸残基。这种甲基转移酶和另外一种甲基酯酶催化的甲基化/去甲基化过程在细菌趋化性的信号转导中起重要作用。,.,4.磷酸化蛋白质的磷酸化是指通过酶促反应将磷酸基团转移到目的蛋白特定的氨基酸残基上的过程，是可逆的。这是生物体内存在的一种普遍的调
4、节方式，在细胞信号的传递过程中占有极其重要的地位。近年来，已经发现由蛋白激酶和蛋白磷酸化酶催化的蛋白质磷酸化/去磷酸化在原核生物中十分普遍。磷酸化/去磷酸化的意义还不太清楚。目前只知在细菌趋化性和氮代谢调空中有瞬间的磷酸化作用。,.,5.乙酰化 乙酰化修饰首先是在真核生物中发现的，发生乙酰化的位点是结合在DNA 上组蛋白的赖氨酸残基着-NH2，对基因转录起到重要的调节作用。随着研究的深入，近些年在原核生物中也发现了蛋白质乙酰化修饰。DNA结合蛋白的乙酰化修饰乙酰辅酶A合成酶(ACS)的乙酰化修饰核糖体蛋白的乙酰化修饰,.,6.类泛素化2008 年之前在原核生物中只发现了蛋白酶体，却从未发现泛素
5、或类泛素的蛋白质的修饰，因此一度认为蛋白酶体对原核生物蛋白质的降解完全依赖于蛋白质自身的组成和结构。2008年,Pearce等在结核分枝杆菌中发现了与泛素功能相似的蛋白质,命名为原核类泛素蛋白(prokaryotic ubiquitin-like protein,Pup)。Pup可以在辅助因子的作用下标记多种功能蛋白,并介导被标记蛋白质通过蛋白酶体降解。Pup-蛋白酶体通路的发现揭示了原核生物中一个崭新的蛋白质降解机制。,.,第二节 真核生物的翻译后加工,许多真核生物的新生肽都要经过翻译后加工或修饰，这种加工修饰可以发生在延伸着的肽链中和翻译后。一般情况下，翻译后修饰一是为了功能上的需要，另一
6、种情况是折叠成天然构象的需要。,1.切除加工2.糖基化3.羟基化4.磷酸化5.脂酰化6.甲基化7.乙酰化8.泛素化9.二硫键形成,.,1.切除加工典型的情况包括切除N-端甲硫氨酸、信号肽序列和切除部分肽段将无活性的前体转变成活性形式。一些酶的前体（称为前体酶proenzyme，或酶原zymegen）或无活性的多肽前体（称为前体蛋白，proprotein）只有切除特定的肽段后才能从无活性形式转变成活性形式。下图是胰岛素的翻译后加工。,.,包含信号肽的胰岛素前体称为前胰岛素原（pre-proinsulin）。去掉信号肽的胰岛素的前体称为胰岛素原(proinsulin)。进一步切除称为C链的肽段后才
7、能形成活性形式的胰岛素（insulin）,.,蜂毒素能溶解动物细胞，也能溶解蜜蜂自身的细胞，在细胞内合成没有活性的前毒素，分泌进入刺吸器后，N端的22个氨基酸残基被蛋白酶水解生成毒素。,.,蛋白质内含子 90年代初，发现了两类新的内含子。一类是蛋白质内含子，其DNA序列与外显子一起转录和翻译，产生一条多肽链，然后从肽链中切除与内含子对应的氨基酸序列，再把与外显子对应的氨基酸序列连接起来，成为有功能的蛋白质。另一类是翻译内含子，mRNA中存在与内含子对应的核苷酸序列，在翻译过程中这一序列被“跳跃”过去，因此产生的多肽链不含有内含子对应的氨基酸序列。,.,.,2.糖基化真核生物中糖基化修饰很普遍。
8、通常情况下，分泌蛋白的寡糖链较复杂，而内质网膜蛋白含有较高的甘露糖。下图是细胞中涉及糖基化的蛋白,.,3.羟基化在结缔组织的胶原蛋白和弹性蛋白中pro和lys是经过羟基化的。此外，在乙酰胆碱酯酶（降解神经递质乙酰胆碱）和补体系统（参与免疫反应的一系列血清蛋白）都发现有4-羟辅氨酸。位于粗糙内质网（RER）上的三种氧化酶（脯氨酰-4-羟化酶，prolyl-4-hydroxylase，脯氨酰-3-羟化酶和赖氨酰羟化酶，lysylhydroxylase）负责特定pro和lys残基的羟化。脯氨酰-4-羟化酶只羟化-Gly-x-pro-，脯氨酰-3-羟化酶羟化Gly-pro-4-Hyp（Hyp: hyd
9、roxyproline），赖氨酸羟化酶只作用于-Gly-X-lys-。胶原蛋白的脯氨酸残基和赖氨酸残基羟化需要Vc，饮食中Vc不足时就易患坏血症（血管脆弱，伤口难愈），原因就是胶原纤维的结构不力（weak collagen fiber structure）。,.,4.磷酸化磷酸化是通过蛋白质磷酸化激酶将ATP 的磷酸基转移到蛋白的特定位点上的过程。大部分细胞过程实际上是被可逆的蛋白磷酸化所调控的, 至少有30%的蛋白被磷酸化修饰。在磷酸化调节过程中，细胞的形态和功能都发生改变。可逆的磷酸化过程几乎涉及所有的生理及病理过程, 如细胞信号转导、肿瘤发生、新陈代谢、神经活动、肌肉收缩以及细胞的增殖、
10、发育和分化等。Fisher 和Krebs 因其在蛋白质可逆磷酸化作为一种生物调节机制方面的研究而获得1992 年诺贝尔生理学及医学奖。,.,.,蛋白质磷酸化,蛋白质磷酸化可分为4类：O-磷酸盐、N-磷酸盐、酰基磷酸盐和S-磷酸盐。O-磷酸盐是通过羟基氨基酸的磷酸化形成的，如丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸、羟脯氨酸或羟赖氨酸磷酸化；N-磷酸盐是通过精氨酸、赖氨酸或组氨酸的磷酸化形成的；酰基磷酸盐是通过天冬氨酸或谷氨酸的磷酸化形成的；而S-磷酸盐则通过半胱氨酸磷酸化形成。,.,有丝分裂原激活蛋白激酶（MAPKs）,MAPKs家族成员存在于所有的真核生物中，在多种信号传递过程中起作用。它们是一类丝氨酸/苏氨
11、酸（Ser/Thr）蛋白激酶，Mr约为38000-55000，具有11个保守的蛋白激酶亚区。,.,该家族成员包括3种类型 ：,1.分裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）；,2.分裂原激活蛋白激酶的激酶（mitogen-activated protein kinase kinase, MAPKK）,3.分裂原激活蛋白激酶的激酶之激酶（mitogen-activated protein kinase kinase kinase, MAPKKK）,在真核细胞中，这3种类型的激酶构成一个MAPK级联系统（mitogen-activated
12、protein kinase cascade）,通过MAPKKK- MAPKK- MAPK逐级磷酸化，将外来信号级联放大并传递下去。,.,MAPKKK位于级联系统的最上游。它能够通过胁迫信号感受器或者信号分子的受体，或者其本身就直接感受胞外信号刺激而发生磷酸化。MAPKKK磷酸化后变为活化状态，可以使MAPKK磷酸化。,MAPKK始终存在于细胞质中。MAPKK磷酸化以后通过双重磷酸化作用将MAPK激活，磷酸化的位点是苏氨酸/酪氨酸（Thr/Tyr）残基。,MAPK被磷酸化后有3种可能的去向：,（1）停留在细胞质中，激活一系列其它的蛋白激酶；（2）在细胞质中使细胞骨架成分磷酸化；（3）进入细胞核
13、，通过磷酸化转录因子，调控基因的表达。,.,5.脂酰化,真核生物体内的许多蛋白质在翻译合成的同时或之后，常与脂类共价连接。其连接方式有的是直接的，有的是间接的；其存在部位有的是在细胞膜外表面，有的是在细胞膜内表面,还有的存在于细胞浆的可溶性区域中；其功能涉及蛋白质与膜的连接、生长调节、形态发生、受体表达、膜融合以及保护蛋白免受水解作用等。尤其对于生物体内的信号转导过程起着非常关键的作用, 脂化蛋白相当于细胞信号转导的开关。脂化修饰多在蛋白质分子的N端甘氨酸残基的氨基或靠近c端半胱氨酸残基的巯基通过酰胺键或硫酯键与脂肪酸连接。能与蛋白质直接相连的脂肪酸有两种，一种是肉豆蔻酸，另一种是棕榈酸。,.
14、,非正常修饰的脂蛋白, 会影响信号转导的过程。在30的人体肿瘤中都发现了Ras 蛋白的变体, 其中80肿瘤为恶性。在细胞内, 产生非正常修饰的原因是Ras 蛋白发生了点突变, 是化学信号刺激还是基因变异导致了Ras 蛋白的突变, 尚不清楚。以蛋白质脂基化作为药物靶点已取得一定成绩。法呢基转移酶把焦磷酸法呢酯(FPP)转移到Ras蛋白的Cys巯基上。法呢基转移酶抑制剂在抗肿瘤治疗中具有很好的疗效, 而对于正常的细胞却没有任何毒性。同样, 棕榈酰基转移酶抑制剂也表现出抗肿瘤特性, 对于乳腺癌、前列腺癌等均有作用。,图片：Ras蛋白的脂化修饰，生命的化学，1996.5,.,6.甲基化蛋白质的甲基化修
15、饰是在甲基转移酶催化下, 在赖氨酸或精氨酸侧链氨基上进行的甲基化。甲基化增加了立体阻力, 并且取代了氨基的氢, 影响了氢键的形成。 因此, 甲基化可以调控分子间和分子与目标蛋白的相互作用。另外也有对天冬氨酸或谷氨酸侧链羧基进行甲基化形成甲酯的形式。天冬氨酸的甲基化能促进已破坏蛋白的修复或降解。,.,组蛋白上的甲基化修饰 组蛋白对于转录等过程至关重要, 它是通过对其末端的化学修饰作用如磷酸化、乙酰化和甲基化等参与细胞核中生命活动。组蛋白赖氨酸和精氨酸的甲基化同转录调节和异染色体的形成有关。组蛋白乙酰化水平增加与转录活性增强有关, 而组蛋白甲基化修饰的结果则相对复杂, 它可以是转录增强或转录抑制。
16、组蛋白赖氨酸甲基化组蛋白精氨酸甲基化,.,组蛋白赖氨酸甲基化。 组蛋白赖氨酸甲基化发生在H3-K4, H3-K9, H3-K27, H3-K36, H3-K79和H4-K20 上, 还可发生于H1 N 端。H3-K9, H3-K27,H4-K20 的甲基化与染色体的钝化过程有关, 而H4-K9 的甲基化可能与大范围的染色质水平的抑制有关。H3-K4, H3-K36, H3-K79 位的甲基化与染色体转录激活过程有关, 其中H3-K4 的单甲基化修饰可以对抗H4-K9 甲基化所导致的基因抑制。,.,组蛋白精氨酸甲基化 组蛋白精氨酸甲基化位点为H3-R2, H3-R4, H3-R17, H3-R2
17、6, 它们都可以增强转录。,.,7.乙酰化组蛋白的乙酰化促进转录，去乙酰化抑制转录。多聚谷氨酰胺疾病是一种神经退行性遗传病是由致病基因CAG 重复片段的扩大引起的。研究显示, 在扩大的多谷氨酰胺诱导的疾病中, 蛋白的乙酰化和去乙酰化的失衡是一个关键的过程。,.,8.二硫键形成 二硫键通常只发现于分泌蛋白（如胰岛素）和某些膜蛋白中，在细胞质中由于有各种还原性物质（如谷胱甘肽glutathione和硫氧还蛋白thioredoxin），所以细胞质蛋白没有二硫键。 因为内质网腔是一个非还原性环境，所以粗糙内质网上的新生肽只暂时形成二硫键。当新生肽进入内质网腔时，一些肽链可能会按氨基酸次序依次暂时形成二
18、硫键，但最终会通过交换二硫键位置的形式形成正确的结构，内质网中可能还有二硫键异构酶（disulfide isomerase）催化该过程。,.,9.泛素化泛素由76个氨基酸组成, 高度保守, 普遍存在于真核细胞内,故名泛素。共价结合泛素的蛋白质能被蛋白酶识别并降解, 这是细胞内短寿命蛋白和一些异常蛋白降解的普遍途径。与消化道内进行的蛋白质水解不同,从泛素与蛋白的结合到将蛋白水解成小的肽段, 整个水解过程需要能量参与。,.,泛素-蛋白酶系统 泛素-蛋白酶系统是存在于所有真核生物细胞的调控系统。20 世纪7080 年代, 泛素调节蛋白质降解的机理之谜被揭开,降解过程中需要三种酶的参与: 泛素激活酶(
19、E1)、泛素结合酶(E2)和泛素蛋白质连接酶(E3)。 泛素化降解蛋白的过程中对蛋白的特异性识别依赖E3。由E2s 和E3s 介导的泛素化过程可以被去泛素化酶(DUBs)逆转。目前发现的DUBs 可分为两大类:泛素碳端水解酶(ubiquitin C-terminal hydrolases,UCHs)和泛素特异性蛋白酶(ubiquitin-spicific processing proteases,UBPs), 两者都是半胱氨酸水解酶。通常情况下, UCHs 主要水解羰基端的酯和泛素的氨基键, 也可以分解泛素前体, 生成活泼的泛素分子; UBPs 分解泛素多聚体链。,.,泛素-蛋白酶系统对蛋白特
20、异性水解机理,E1-SH,E1-SH,E2-SH,E2-SH,ATP AMP+PPi,E3,多泛素化蛋白,ATP,26S蛋白酶体,20S蛋白酶体,ATP,19S调节亚基,去折叠,水解,E1：泛素激活酶 E2：泛素载体蛋白 E3：泛素-蛋白质连接酶,ubiquitin,.,DUBs 参与的泛素化调控,.,不同翻译后修饰过程的相互协调与影响,在体内, 各种翻译后修饰过程不是孤立存在的。在很多细胞活动中, 需要各种翻译后修饰的蛋白共同作用。例如在信号转导的过程中, 位于细胞膜外侧的细胞外信息受体和相应的响应器(一般都是糖基化的蛋白质)与相应的配体结合, 这些糖蛋白会将细胞所处环境中的刺激信号导入细胞
21、膜, 并首先转导到这类与膜结合的脂蛋白上, 而后再通过脂蛋白向下级的蛋白质或激酶转导。同时, 在绝大多数的信号转导过程中, 脂蛋白都是另外一系列蛋白质磷酸化的开端, 这些磷酸化过程分别受到特定的激酶调节, 是信号转导过程中的主体。,.,对于同一个蛋白可以拥有一种以上的后修饰过程。各种翻译后修饰形式相互影响、相互协调。磷酸化与糖基化在很多方面都具有相似性, 尤其是动力学特点和在细胞内普遍存在的特点, 如在转录因子、致癌产物、酶中都存在。,.,由于蛋白质翻译后修饰并不是直接由基因决定的, 研究蛋白质翻译后修饰对蛋白质组学的研究具有更重要的意义, 因此诞生了“翻译后修饰的蛋白质组学”。翻译后修饰的蛋白质组学是目前国际上的一个研究热点。翻译后修饰的蛋白质组学研究, 不仅有助于理解翻译后修饰在生命过程中的重要意义, 还对未来的药物开发提供了极大的保证。找到非正常细胞中变异的分子靶点, 将有利于研究蛋白质的相互作用是如何被翻译后修饰过程控制。理解调控翻译后修饰过程因素, 有利于在分子水平上揭示细胞过程和蛋白质网络的功能, 最终可以指导针对分子的更准确的药物控制。可以预见, 蛋白质翻译后修饰的模拟物在蛋白疗法中将是新的热点。,
