39DNA重组技术的基本工具和基因工程的基本操作程序.docx

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1、40 DNA重组技术的基本工具和基因工程的基本操作程序考纲要求1.基因工程的诞生2.基因工程的原理及技术 复习要求1理解基因工程的实质2理解基因工程操作的四步曲及其操作实例基础自查一基因工程的概念基因工程是指 ，通过 技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出 。基因工程是在 水平上进行设计和施工的，又叫做 。二基因工程的基本工具1.限制性核酸内切酶（限制酶）（1） 。（2）功能： 。（3）结果：产生的DNA片段末端通常有两种形式： 。2. DNA连接酶(1)两种DNA连接酶（EcoliDNA连接酶和T4-DNA连接酶）比较：相同点： 。区别：（2）与DNA聚合酶作用的异同: 3.载体（1）载体具备

2、的条件：（2）最常用的是 其它载体： 三基因工程的基本操作程序第一步： . 原核基因采取直接分离获得，真核基因是人工合成。人工合成目的基因的常用方法有 。.PCR技术扩增目的基因（1）原理： （2）过程： 。第二步： 1.目的： 。2.组成： （1）启动子： 。（2）终止子： 。（3）标记基因的作用： 。第三步： 2.常用的方法：a、将目的基因导入植物细胞方法： 。b、将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是 。此方法的受体细胞多是 。C、将目的基因导入微生物细胞：最常用的原核细胞是 ，其转化方法是： 。第四步： 1.首先要检测 ，方法是采用 。2.其次还要检测 ，方法是采用 。3.最后检测 ，

3、方法是 ，用 。4.有时还需进行 的鉴定。如 转基因抗虫植物是否出现抗虫性状。课堂深化探究一对基因工程概念的理解别名基因拼接技术或DNA重组技术操作环境 操作对象 操作水平 基本过程 结果 与杂交育种相比 与诱变育种相比 原理 二基因工程的基本操作工具1与DNA分子相关的酶(1)几种酶的比较种类项目限制酶DNA连接酶DNA聚合酶解旋酶作用底物 作用部位 作用特点 作用结果 (2)限制酶与DNA连接酶的关系 2载体(1)作用 (2)具备的条件(3)种类特别提醒一般来说，天然载体往往不能满足人类的所有要求，因此人们根据不同的目的和需要，对某些天然的载体进行人工改造。限制酶切割位点所处的位置必须是在

4、所需的标记基因之外，这样才能保证标记基因的完整性，有利于对目的基因的检测。三基因工程操作程序基因工程技术生产凝乳酶的过程1基因工程的操作程序分析(1)目的基因的获取途径 (2)基因表达载体的构建特别提醒插入的目的基因的表达需要调控序列，因而用作载体的质粒的插入基因部位之前需有启动子，之后需有终止子。两次使用的限制酶为同一种酶，这样形成的黏性末端碱基之间互补，便于连接。(3)将目的基因导入受体细胞(转化)生物种类植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法 受体细胞体细胞受精卵原核细胞转化过程 (4)目的基因的检测与鉴定类型检测内容方法结果显示分子检测导入检测 转录检测 翻译检测 个体水平检测 特别提醒：

5、1在整个工程中，只有第三步将目的基因导入受体细胞过程中不发生碱基互补配对，其他步骤均发生配对。2切割质粒和目的基因的限制酶必须是同一种酶，以获得相同的黏性末端，利于基因表达载体的构建。3插入的目的基因只是结构基因部分，其表达需要调控序列，因而用作载体的质粒的插入部位前须有启动子，后须有终止子。4PCR技术与DNA复制的比较PCR技术DNA复制相同点原理DNA双链复制(碱基互补配对)原料四种游离的脱氧核苷酸条件模板、ATP、酶等不同点解旋方式DNA在高温下变性解旋解旋酶催化场所体外复制主要在细胞核内酶热稳定的DNA聚合酶(Taq酶)细胞内含有的DNA聚合酶结果在短时间内形成大量的DNA片段形成整

6、个DNA分子对应训练1.下列关于基因工程的叙述，错误的是( )A目的基因和受体细胞均可来自动物、植物或微生物B限制性核酸内切酶和DNA连接酶是两类常用的工具酶C人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性D载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNA的细胞和促进目的基因的表达2.下列有关基因工程中限制性核酸内切酶的描述，错误的是()。A一种限制性核酸内切酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列B限制性核酸内切酶的活性受温度影响C限制性核酸内切酶能识别和切割RNAD限制性核酸内切酶可从原核生物中提取3.如图是利用基因工程技术培育转基因植物，生产可食用疫苗的部分过程示意图，其中Pst 、Sma 、Eco

7、R、Apa为四种限制性核酸内切酶。下列说法错误的是()。A图示过程是基因工程的核心步骤B表达载体构建时需要用到限制酶 SmaC抗卡那霉素基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来D除图示组成外，表达载体中还应该含有启动子和终止子等结构4.下图是获取转基因抗冻番茄植株的过程示意图，有关叙述正确的是()A过程获取的目的基因，可用于基因工程和比目鱼基因组测序B将多个抗冻基因编码区依次相连成能表达的新基因，不能得到抗冻性增强的抗冻蛋白C过程构成的重组质粒缺乏标记基因，需要转入农杆菌才能进行筛选D应用DNA探针技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其完全表达限时训练题组一基因工程及基本操作

8、1.科学家将动物体内的能够合成胰岛素的基因与大肠杆菌的DNA分子重组，并且在大肠杆菌体内表达成功。请根据图回答问题:(1)此图表示的是采取 合成基因的方法获取 基因的过程。 (2)图中DNA是以 为模板， 形成单链DNA，在酶的作用下合成双链DNA，从而获得了所需要的基因。 (3)图中代表 DNA，含 基因。 (4)图中表示 。2下图为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化，图中依次表示限制酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序是()A B C D3下列关于基因工程的叙述，不正确的是(多选)()A基因工程经常以抗菌素抗性基因为目的基因B细菌质粒是基因工程常用的运载体C通常用一种限

9、制性核酸内切酶处理含目的基因的DNA，用另一种处理运载体DNA D为培育成抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体题组二基因工程的操作程序4.下图表示利用基因工程培育抗虫棉的过程，请据图回答下列有关问题。(1)若限制酶的识别序列和切点是GATC，限制酶识别序列和切点是GGATCC，那么在过程中，应用限制酶_切割质粒，用限制酶_切割抗虫基因。(2)将通过过程得到的大肠杆菌涂布在含有_的培养基上，若能够生长说明已导入了普通质粒或重组质粒，反之则说明没有导入。(3)要确定抗虫基因导入后，是否能稳定遗传并表达，需进行检测和鉴定工作，则在个体水平上的鉴定过程可简述为：_。经筛选分析，该

10、植株细胞中含有一个携带抗虫基因的DNA片段，因此可以把它看作是杂合子。理论上，该转基因植株自交产生的F1代中，仍具有抗虫特性的植株占总数的_。(4)过程所用的现代生物技术称为_，从遗传学角度来看，据细胞通过过程，能形成棉植株的根本原因是细胞具有_。5干扰素是病毒侵入人体后由淋巴细胞产生的一种免疫活性物质，它具有广谱抗病毒的作用。利用现代生物技术生产干扰素的流程如下：(1)过程产生的物质A是_，cDNA文库_(大于/小于)人的基因组文库。(2)过程用到的工具酶是_，过程需先用_处理受体细胞，过程通常采用_技术。(3)过程和的关键技术分别是_、_。(4)基因工程的核心步骤是图中的_(填标号)。题组

11、三综合题6.(2011安徽理综31)家蚕细胞具有高效表达外源基因的能力。将人干扰素基因导入家蚕细胞并大规模培养，可提取干扰素用于制药。(1)进行转基因操作前，需用_酶短时处理幼蚕组织，以便获得单个细胞。(2)为使干扰素基因在家蚕细胞中高效表达，需要把来自cDNA文库的干扰素基因片段正确插入表达载体的_和_之间。(3)采用PCR技术可验证干扰素基因是否已经导入家蚕细胞。该PCR反应体系的主要成分应包含：扩增缓冲液(含Mg2)、水、4种脱氧核糖核苷酸、模板DNA、_和_。(4)利用生物反应器培养家蚕细胞时，贴壁生长的细胞会产生接触抑制。通常将多孔的中空薄壁小玻璃珠放入反应器中，这样可以_，增加培养

12、的细胞数量，也有利于空气交换。7(2010天津理综，7)下图是培育表达人乳铁蛋白的乳腺生物反应器的技术路线。图中tetR表示四环素抗性基因，ampR表示氨苄青霉素抗性基因，BamH、Hind、Sma直线所示为三种限制酶的酶切位点。据图回答问题。(1)图中将人乳铁蛋白基因插入载体，需用_限制酶同时酶切载体和人乳铁蛋白基因。筛选含有重组载体的大肠杆菌首先需要在含_的培养基上进行。(2)能使人乳铁蛋白基因在乳腺细胞中特异性表达的调控序列是_(填字母代号)。A启动子 BtetR C复制原点 DampR(3)过程可采用的操作方法是_(填字母代号)。A农杆菌转化 B大肠杆菌转化C显微注射 D细胞融合(4)

13、过程采用的生物技术是_。(5)对早期胚胎进行切割，经过程可获得多个新个体。这利用了细胞的_性。(6)为检测人乳铁蛋白是否成功表达，可采用_(填字母代号)技术。A核酸分子杂交 B基因序列分析C抗原抗体杂交 DPCR8(2009上海卷)人体细胞内含有抑制癌症发生的P53基因，生物技术可对此类基因的变化进行检测。(1)目的基因的获取方法通常包括_和_。(2)上图表示从正常人和患者体内获取的P53基因的部分区域。与正常人相比，患者在该区域的碱基会发生改变，在上图中用方框圈出发生改变的碱基对，这种变异被称为_。(3)已知限制酶E识别序列为CCGG，若用限制酶E分别完全切割正常人和患者的P53基因部分区域

14、(见上图)，那么正常人的会被切成_个片段，而患者的则被切割成长度为_对碱基和_对碱基的两种片段。(4)如果某人的P53基因部分区域经限制酶E完全切割后，共出现170、220、290和460个碱基对的四种片段，那么该人的基因型是_(以P表示正常基因，P表示异常基因)。9(2009福建卷)转基因抗病香蕉的培育过程如图所示。质粒上有Pst、Sma、EcoR、Apa等四种限制酶切割位点。请回答下列问题。(1)构建含抗病基因的表达载体A时，应选用限制酶_，对_进行切割。(2)培养板中的卡那霉素会抑制香蕉愈伤组织细胞的生长，欲利用该培养基筛选已导入抗病基因的香蕉细胞，应使基因表达载体A中含有_，作为标记基

15、因。(3)香蕉组织细胞具有_，因此，可以利用组织培养技术将导入抗病基因的香蕉组织细胞培育成植株。图中、依次表示组织培养过程中香蕉组织细胞的_。高考真题体验1.（2013江苏卷，22）小鼠杂交瘤细胞表达的单克隆抗体用于人体试验时易引起过敏反应，为了克服这个缺陷，可选择性扩增抗体的可变区基因（目的基因）后再重组表达。下列相关叙述正确的是（多选）A.设计扩增目的基因的引物时不必考虑表达载体的序列B.用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列C.PCR体系中一定要添加从受体细胞中提取的DNA聚合酶D.一定要根据目的基因编码产物的特性选择合适的受体细胞 2.(2013安徽卷，6） 下图为通过DNA

16、分子杂交鉴定含有某特定DNA的细菌克隆示意图。下列叙述正确的是A 根据培养皿中菌落数可以准确计算样品中含有的活菌实际数目B 外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制C 重组质粒与探针能进行分子杂交是因为DNA分子脱氧核糖和磷酸交替连接D 放射自显影结果可以显示原培养皿中含有特定DNA的细菌菌落位置3.（2013新课标卷，40）【生物选修3 现代生物科技专题】（15分）阅读如下材料：材料甲：科学家将牛生长激素基因导入小鼠受精卵在，得到了体型巨大的“超级小鼠”；科学家采用农杆菌转化法培育出转基因烟草。材料乙：T4溶菌酶在温度较高时易失去活性，科学家对编码T4溶菌酶的基因进行改造，

17、使其表达的T4溶菌酶的第3位的异亮氨酸变为半胱氨酸，在该半胱氨酸与第97为的半胱氨酸之间形成了一个二硫键，提高了T4溶菌酶的耐热性。材料丙：兔甲和兔乙是同一物种的两个雌性个体，科学家将兔甲受精卵发育成的胚胎移植到兔乙的体内，成功产出兔甲的后代，证实了同一物种的胚胎可在不同个体的体内发育。回答下列问题：（1）材料甲属于基因工程的范畴。将基因表达载体导入小鼠的受精卵中常用 法。构建基因表达载体常用的工具酶有 和 。在培育转基因植物是，常用农杆菌转化发，农杆菌的作用是 。（2）材料乙属于 工程范畴。该工程是指以分子生物学相关理论为基础，通过基因修饰或基因合成，对 进行改造，或制造制造一种 的技术。在

18、该实例中，引起T4溶菌酶空间结构改变的原因是组成该酶肽链的 序列发生了改变。（4）材料丙属于胚胎工程的范畴。胚胎移植是指将获得的早期胚胎移植到 种的、生理状况相同的另一个雌性动物体内，使之继续发育成新个体的技术。在资料丙的实例中，兔甲称为 体，兔乙称为 体。4.（2013北京卷，30）（18分）斑马鱼的酶D由17号染色体上的D基因编码。具有纯合突变基因（dd）的斑马鱼胚胎会发出红色荧光。利用转基因技术将绿色荧光蛋白（G）基因整合到斑马鱼17号染色体上，带有G基因的胚胎能够发出绿色荧光。未整合G基因的染色体的对应位点表示为g。用个体M和N进行如下杂交实验（1）在上述转基因实验中，将G基因与质粒重

19、组，需要的两类酶是 和 。将重组质粒显微注射到斑马鱼 中,整合到染色体上的G基因 后，使胚胎发出绿色荧光。（2）根据上述杂交实验推测：亲代M的基因型是 （选填选项前的符号）。 a. DDgg b. Ddgg子代中只发出绿色荧光的胚胎基因型包括 （选填选项前的符号）。 a. DDGG b. DDGg c. DdGG d. DdGg（3）杂交后，出现红绿荧光（既有红色又有绿色荧光）胚胎的原因是亲代 （填“M”或“N”）的初级精（卵）母细胞在减数分裂过程中，同源染色体的 发生了交换，导致染色体上的基因重组。通过记录子代中红绿荧光胚胎数量与胚胎总数，可计算得到该亲本产生的重组配子占其全部配子的比例，算

20、式为 5.(2013广东卷，28）（16分）地中海贫血症属于常染色体遗传病。一对夫妇生有一位重型地中海贫血症患儿，分析发现，患儿血红蛋白链第39位氨基酸的编码序列发生了突变（CT）。用PCR扩增包含该位点的一段DNA片段l，突变序列的扩增片段可用一种限制酶酶切为大小不同的两个片段m和s；但正常序列的扩增片段不能被该酶酶切，如图11（a）。目前患儿母亲再次怀孕，并接受了产前基因诊断。家庭成员及胎儿的PCR扩增产物酶切电泳带型示意图见图11（b）。（终止密码子为UAA、UAG、UGA。）（1）在获得单链模板的方式上，PCR扩增与体内DNA复制不同，前者通过_解开双链，后者通过_解开双链。（2）据图

21、分析，胎儿的基因型是_（基因用A、a表示）。患儿患病可能的原因是_的原始生殖细胞通过_过程产生配子时，发生了基因突变；从基因表达水平分析，其患病是由于_。（3）研究者在另一种贫血症的一位患者链基因中检测到一个新的突变位点，该突变导致链第102位的天冬酰胺替换为苏氨酸。如果_，但_，则为证明该突变位点就是这种贫血症的致病位点提供了一个有力证据。6.（2013上海卷）（六）回答下列有关遗传信息传递和表达的问题。（9分） 图17表示利用致病病毒M的表面蛋白基因和无害病毒N，通过基因工程制作重组M病毒疫苗的部分过程。其中表示操作流程，ah表示分子或结构。据图回答问题。56基因工程除了微生物基因工程外，

22、还有_。在图17所示过程中，获取目的基因的步骤是流程 （用图中编号回答）；在流程中必需实施的步骤有_。57在图17所示的整个过程中，用作运载体的DNA来自分子_（用图中字母回答）。58下列关于质粒运载体的说法正确的是_（多选）。A使用质粒运载体是为了避免目的基因被分解B质粒运载体只能在与目的基因重组后进入细胞C质粒运载体可能是从细菌或者病毒的DNA改造的D质粒运载体的复制和表达也遵循中心法则E质粒运载体只有把目的基因整合到受体细胞的DNA中才能表达F没有限制酶就无法使用质粒运载体59据图比较结构g和结构h的异同，并解释产生差异的原因_。 7(2012浙江高考)天然的玫瑰没有蓝色花，这是由于缺少

23、控制蓝色色素合成的基因B，而开蓝色花的矮牵牛中存在序列已知的基因B。现用基因工程技术培育蓝玫瑰，下列操作正确的是（ ）A.提取矮牵牛蓝色花的mRNA，经逆转录获得互补的DNA，再扩增基因BB.利用限制性核酸内切酶从开蓝色花矮牵牛的基因文库中获取基因BC.利用DNA聚合酶将基因B与质粒连接后导入玫瑰细胞D.将基因B直接导入大肠杆菌，然后感染并转入玫瑰细胞8. (2012高考全国新课标卷40)根据基因工程的有关知识，回答下列问题：（1）限制性内切酶切割分子后产生的片段，其末端类型有和。（2）质粒运载体用EcoR切割后产生的片段如下：为使运载体与目的基因相连，含有目的基因的DNA除可用EcoR切割外

24、，还可用另一种限制性内切酶切割，该酶必须具有的特点是。（3）按其来源不同，基因工程中所使用的DNA连接酶有两类，即DNA连接酶和DNA连接酶。（4）反转录作用的模板是，产物是。若要在体外获得大量反转录产物，常采用技术。（5）基因工程中除质粒外，和也可作为运载体。（6）若用重组质粒转化大肠杆菌，一般情况下，不能直接用未处理的大肠杆菌作为受体细胞，原因是。9.(2012福建高考)现代生物科技专题。肺细胞中的let-7基因表达减弱，癌基因RAS表达增强，会引发肺癌。研究人员利用基因工程技术将let-7基因导入肺癌细胞实验表达，发现肺癌细胞的增殖受到抑制。该基因工程技术基本流程如图。请回答：（）进行过

25、程时，需用 酶切开载体以插入let-7基因。载体应用RNA聚合酶识别和结合的部位，以驱动let-7基因转录，该部位称为 。（）进行过程时，需用 酶处理贴附在培养皿壁上的细胞，以利于传代培养。（）研究发现，let-7基因能影响RAS的表达，其影响机理如图。据图分析，可从细胞提取 进行分子杂交，以直接检测let-7基因是否转录。肺癌细胞增殖受到抑制，可能是由于细胞中 （RASmRNA/RAS蛋白）含量减少引起的。10 (2012天津高考7)生物分子间的特异性结合的性质广泛用于生命科学研究。以下实例为体外处理“蛋白质-DNA复合体”获得DNA片段信息的过程图。据图回答：（1）过程酶作用的部位是 键，

26、此过程只发生在非结合区DNA，过程酶作用的部位是 键。（2）、两过程利用了酶的 特性。（3）若将得到的DNA片段用于构建重组质粒，需要过程的测序结果与 酶的识别序列进行对比，以确定选用何种酶。（4）如果复合体中的蛋白质为RNA酶聚合，则其识别、结合DNA序列位基因的 。（5）以下研究利用了生物分子间的特异性结合的有 （多选）A.分离得到核糖体，用蛋白酶酶解后提取rRNA B.用无水乙醇处理菠菜叶片，提取叶绿体基粒膜上的光合色素C通过分子杂交手段，用荧光物质标记的目的基因进行染色体定位D将抑制成熟基因导入番茄，其mRNA与催化成熟酶基因的mRNA互补结合，终止后者翻译，延迟果实成熟。11. (2

27、012江苏高考32)图1表示含有目的基因D的DNA片段长度（bp即碱基对）和部分碱基序列，图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列。现有Msp I、BamH I、Mbo I、Sma I4种限制性核酸内切酶，它们识别的碱基序列和酶切位点分别为CCGG、GGATCC、GATC、CCCGGG。请回答下列问题 （1）图1的一条脱氧核苷酸链中相邻两个碱基之间依次由 连接。（2）若用限制酶SmaI完全切割图1中DNA片段，产生的末端是 末端，其产物长度为 。（3）若图1中虚线方框内的碱基对被T-A碱基对替换，那么基因D就突变为基因d。从杂合子中分离出图1及其对应的DNA片段，用限制酶Sma I完全切割，产物中

28、共有 种不同长度的DNA片段。（4）若将图2中质粒和目的基因D通过同种限制酶处理后进行连接，形成重组质粒，那么应选用的限制酶是 。在导入重组质粒后，为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌，一般需要用添加 的培养基进行培养。经检测，部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因D不能正确表达，其最可能的原因是 。12(2011四川理综，5)北极比目鱼中有抗冻基因，其编码的抗冻蛋白具有11个氨基酸的重复序列，该序列重复次数越多，抗冻能力越强。下图是获取转基因抗冻番茄植株的过程示意图，有关叙述正确的是()。A过程获取的目的基因，可用于基因工程和比目鱼基因组测序B将多个抗冻基因编码区依次相连成能表达的新基因，不能得

29、到抗冻性增强的抗冻蛋白C过程构成的重组质粒缺乏标记基因，需要转入农杆菌才能进行筛选D应用DNA探针技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其完全表达13.（2011 浙江）将ada（腺苷酸脫氨酶基因）通过质粒pET28b导人大肠杆菌并成功表达腺苷酸脱氨酶。下列叙述错误的是（）A每个大肠杆菌细胞至少含一个重组质粒B每个重组质粒至少含一个限制性核酸内切酶识别位点C每个限制性核酸内切酶识别位点至少插入一个adaD每个插入的ada至少表达一个腺苷酸脱氨酶分子 14(2010全国，5)下列叙述符合基因工程概念的是()。AB淋巴细胞与肿瘤细胞融合，杂交瘤细胞中含有B淋巴细胞中的抗体基因B将人的干

30、扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌，获得能产生人干扰素的菌株C用紫外线照射青霉菌，使其DNA发生改变，通过筛选获得青霉素高产菌株D自然界中天然存在的噬菌体自行感染细菌后其DNA整合到细菌DNA上15(2010浙江理综，2)在用基因工程技术构建抗除草剂的转基因烟草过程中，下列操作错误的是()。A用限制性核酸内切酶切割烟草花叶病毒的核酸B用DNA连接酶连接经切割的抗除草剂基因和载体C将重组DNA分子导入烟草原生质体D用含除草剂的培养基筛选转基因烟草细胞16(2010江苏卷)下列关于转基因植物的叙述，正确的是()。A转入到油菜的抗除草剂基因，可能通过花粉传入环境中B转抗虫基因的植物，不会导致昆虫群体抗

31、性基因频率增加C动物的生长激素基因转入植物后不能表达D如转基因植物的外源基因来源于自然界，则不存在安全性问题17(2009浙江卷)下列关于基因工程的叙述，错误的是()。A目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物B限制性核酸内切酶和DNA连接酶是两类常用的工具酶C人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性D载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNA的细胞和促进目的基因的表达答案与解析基础自查一基因工程的概念基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施

32、工的，又叫做DNA重组技术。二基因工程的基本工具1.限制性核酸内切酶（限制酶）（1）主要是从原核生物中分离纯化出来的。（2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，具有专一性。（3）结果：产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。2. DNA连接酶（1）两种DNA连接酶（EcoliDNA连接酶和T4-DNA连接酶）比较：相同点：都缝合磷酸二酯键。区别：EcoliDNA连接酶来源于T4噬菌体，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。（

33、2）与DNA聚合酶作用的异同:DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。3.载体（1）载体具备的条件：能在受体细胞中复制并稳定保存。具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。（2）最常用的是质粒, 其它载体： 噬菌体的衍生物、动植物病毒 三基因工程的基本操作程序第一步：目的基因的获取. 反转录法和化学合成法 .PCR技术扩增目的基因（1）原理：DNA双链复制（2）过程： DNA解链；引物结合到互补DNA链，热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成。第二步：基因表达载

34、体的构建1.目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。2.组成：目的基因启动子终止子标记基因（1）启动子：是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。（2）终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段 ，位于基因的尾端。（3） 鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因。第三步：将目的基因导入受体细胞 2.常用的方法：a、 农杆菌转化法 基因枪法和 花粉管通道法等。b、 显微注射技术 受精卵。C、 大肠杆菌 先用 Ca2+ 处理细胞，使其成为感受态细胞 ，再将重组表达

35、载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。第四步：目的基因的检测和表达1.转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因 DNA分子杂交技术。2.目的基因是否转录出了mRNA 用标记的目的基因作探针与 mRNA杂交。3.目的基因是否翻译成蛋白质 转基因生物中提取蛋白质 抗体进行抗原抗体杂交。4.个体生物学水平的鉴定。 课堂深化探究一对基因工程概念的理解别名基因拼接技术或DNA重组技术操作环境生物体外操作对象基因操作水平DNA分子水平基本过程剪切拼接导入表达结果人类需要的基因产物与杂交育种相比克服远缘杂交不亲和的障碍与诱变育种相比定向改造

36、生物性状原理基因重组二基因工程的基本操作工具1与DNA分子相关的酶(1)几种酶的比较种类项目限制酶DNA连接酶DNA聚合酶解旋酶作用底物DNA分子DNA分子片段脱氧核苷酸DNA分子作用部位磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键碱基对间的氢键作用特点切割目的基因及载体，能专一性识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开了的两个核苷酸之间的磷酸二酯键只能将单个脱氧核苷酸添加到脱氧核苷酸链上将DNA两条链之间的氢键打开作用结果形成黏性末端或平末端形成重组DNA分子形成新的DNA分子形成单链DNA分子(2) 原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。DNA连接酶起作用时不需要模板。2载体(1)作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞内。利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制。(2) 能在宿主细胞内稳定保存并大量复制。有多个限制酶切割位点，以便与外源基因连接。具有特殊的标记基因，以便进行筛选。(3)质粒：一种祼露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，能够自我复制的很小的双链环状DNA分子。噬菌