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1、,血清LDH及其同工酶测定,刘湘帆,LDH作用： 乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LD或LDH）在辅酶I（NAD+）为氢受体时，催化L-乳酸为丙酮酸。L-乳酸 丙酮酸 NAD+ NADH+H+,LDH,分布：特异性差 心肌、骨骼肌、肾脏 、肝、脾、胰、肺、肿瘤、红细胞肾 心肌 骨骼肌 肝 脾 胰 肺,1 方法,(1) 分光光度法 1）利用顺向反应（pH 8.8-9.8）：340nm处连续观察NADH的产生速度。 2）利用逆向反应（pH 7.4-7.8）：340nm处连续观察NADH的消失速度。 分光光度法能利用顺、逆双相反应，线性范围较广。但要求保持测定体系于最适温度
2、下，否则会影响测定的准确性。,(2)比色法测定LD总活性,1） 原理： 乳酸脱氢酶（LD） 乳酸 丙酮酸 丙酮酸 2,4-二硝基苯肼 丙酮酸-二硝基苯腙 碱性溶液中呈棕红色颜色的深浅与丙酮酸的浓度呈正比。,2） 试剂：基质缓冲液（pH 8.8）NAD+溶液（11.3mmol/L）丙酮酸标准液（0.5mmol/L）2,4-二硝基苯肼溶液（1mmol/L）氢氧化钠溶液（0.4mmol/L）,单位定义：以100ml血清，37与基质作用15min，生成1umol丙酮酸为一个金氏单位。参考值： 血清LD：190-437金氏单位。,3)操作步骤,1 LD活性测定 加入物 对照管 测定管 血清 - 0.05
3、 基质缓冲液 0.5 0.5 混匀，放37C水浴5min NAD+溶液 - 0.1 混匀，放37C水浴15min 2，4-二硝基苯肼溶液 0.5 0.5 NAD+溶液 0.1 - 混匀，放37C水浴15min 0.4mol/LNaOH 5.0 5.0 室温放置5min进行比色，波长440nm,2 LD校正曲线制作,加入物（ml） B 1 2 3 4丙酮酸标准液 0 0.05 0.1 0.15 0.20 基质缓冲液 0.5 0.45 0.40 0.35 0.30蒸馏水 0.15 0.15 0.15 0.15 0.152,4二硝基苯肼 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 混匀，放37C水浴15
4、min0.4mol/LNaOH 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0LD活性单位 0 250 500 750 1000,临床意义,心肌损害： 心肌梗塞、充血性心衰、心肌炎肝脏疾病:病毒性肝炎、肝硬化、原发性肝癌其它:骨骼肌的损伤、恶性肿瘤（白血病、淋巴瘤等）、肺梗塞等,注意事项：标本不能溶血，也不能用草酸盐抗凝血。由于LD4，LD5对冷不稳定，不宜冰箱存放，血清标本在室温下可稳定2-3天。,LD同工酶的测定,LD同工酶 H亚单位 心肌 M亚单位 肌肉 LD1 （H4） 心肌 LD2 （H3M） 心肌 LD3 （H2M2） 肺、脾 LD4 （HM3） 肝、骨骼肌 LD5 （M4） 肝、骨骼肌
5、正常成人：LD2LD1LD3LD4LD5,人体某些组织中LDH同工酶电泳图谱,LDH1 LDH2 LDH3 LDH4 LDH5心肌 + + + + +红细胞 + + + + +肾上腺 + + + + +骨骼肌 + + + + +肝 + + + + +,总之：复基因位点同工酶在生物体内可以各个同工酶独自存在，也可以以杂化体形式存在。,H,M,LD1,LD2,LD3,LD4,LD5,二、测定方法：柱层析法免疫化学法热稳定性和抑制法*电泳法：,醋酸纤维素薄膜聚丙烯酰胺凝胶琼脂糖,原理：根据LD同工酶一级结构和等电点的差异，在一定电泳条件下，使LD在支持物上被分离。 乳酸脱氢酶（LD） 乳酸 丙酮酸,
6、NADH + 氧化型PMS 还原型PMS + NAD+还原型PMS + 四氮唑盐类 氧化型PMS + 甲臢当有LD活性的区带存在即显紫红色，颜色深浅与酶活性成正比，借助于扫描仪或光密度仪，可进一步求出相对含量。,（+）,（-）,例如，LDH同工酶LDH2、LDH3、LDH4、LDH5都比LDH1有较多的碱性氨基酸，在pH8.6的巴比妥缓冲液中LDH1带有更多的负电荷，因而向阳性泳动最快。,试剂：巴比妥缓冲液（pH 8.6）巴比妥盐酸缓冲液（0.082mol/L， pH 8.2）EDTA-Na2溶液（10mmol/L）缓冲琼脂糖凝胶（8g/L和 5g/L）底物显色液和固定漂洗液,（3）操作凝胶板
7、制备加样电泳显色固定和漂洗,（4）计算：,A总（吸光度总和）= A1 + A2 + A3 + A4 + A5（A1A5 相应为LD同工酶LD1LD5的吸光度。）LD同工酶的百分比（%）为：LD1 = A 1/ A总 100%LD2 = A 2/ A总 100%LD3 = A 3/ A总 100%LD4 = A 4/ A总 100%LD5 = A5 / A总 100%,临床意义,心脏疾病心肌梗塞 LD1 LD2充血性心衰，心肌炎 LD1 LD2肝脏疾病 病毒性肝炎 LD5 LD4肝硬化，原发性肝癌 LD5，LD5 LD4恶性肿瘤白血病、结肠癌等 LD3，LD3LD1肌肉疾病肌肉损伤、肌萎缩 LD
8、5,注意事项,不宜用溶血标本。严格控制温度（LD4和LD5，特别是LD5对热敏感，如底物显色液温度超过50，LD5易失活）。底物显色液需避光保存，因PMS对光敏感，否则显色后的凝胶板背景颜色深而影响结果。LD同工酶对冷的敏感性不同，尤其是LD5对冷不稳定。因此血清标本应该放室温保存,CK及其同工酶的检测,分布骨骼肌心肌脑组织平滑肌（胃肠道、子宫）在肝及红细胞中测不到CK的活性。,Creatine Kinase（CK, EC 2.7.3.2， ATP:肌酸磷酸转移酶）pH9.0ATP + 肌酸 磷酸肌酸 + ADP pH7.0 CK: MM, MB, BB, Mt MW 86 000,原理,AD
9、P + 磷酸烯醇式丙酮酸 丙酮酸激酶 丙酮酸 + ATP丙酮酸-2，4-二硝基苯腙,实验操作,加入物 B S U血清 - - 0.1 标准 - 0.1 -（1mmol/L;200U/L） H2O 0.1 - -酶试剂 0.5 0.5 0.5 37 15minDNP O.5 0.5 0.5 37 15minNaOH 4 4 4 室温 5min 440nm比色,肌酸、ATP、丙酮酸激酶、磷酸烯醇式丙酮酸,临床意义（1）引起血清CK活性升高的疾病 1）心脏疾病： 急性心肌梗塞 （病毒性）心肌炎 心外膜炎,2）肌性疾病： 进行性肌营养不良、多发性肌炎、皮肌炎 肌萎缩3）中枢神经系统疾病 脑血管意外、脑
10、膜炎、颅脑外伤4）肺疾病 肺栓塞等,（2）引起血清CK活性降低的疾病（较少） 甲状腺功能亢进 全身性红斑狼疮 严重感染、败血症等,7、注意事项（1）本实验的许多试剂都易失效，故最好在每次实验前临时配制。（2）肌酸呈色不稳定，振荡充分与否直接影响呈色的深浅及过程，用旋涡混合器充分振荡15s，37水浴5min后，颜色可达最高点，并持续30min以上。,CK同工酶,CK同工酶测定原理,磷酸肌酸 ADP CK 肌酸 ATP ATP 葡萄糖 己糖激酶 葡萄糖-6-磷酸 ADP 葡萄糖-6-磷酸 NADP+ 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶6-磷酸葡萄糖酸 NADPH H+,1. 电泳法测定CK-MB 琼脂糖介质，
11、醋酸纤维素薄膜 酶定位: CK-BB 白蛋白区 CK-MB 2 区 CK-MM 区 CK-Mt 后 参考值： CK-BB 0% CK-MB 0 3% CK-MM 97 100% CK-Mt 0% CK-MB 阳性决定水平为5%,CK-MB测定,试剂（1）50mmol/L Tis-巴比妥缓冲液（pH 8.0）（2）30mmol/L Tis-巴比妥缓冲液（pH 8.6）（3）5g/L 琼脂糖（4）400mmol/L Bis-Tis缓冲液（pH 7.0）（5）辅酶溶液（6）底物显色液（7）混合底物显色液,操作（1）制备凝胶玻片（2）加样（3）电泳（4）显色（5）固定和漂洗（6）观察结果,参考值（1）
12、CK-BB： 0%（2）CK-MB： 0% 3%（3）CK-MM： 97% 100%（4）CK-Mt： 0%,引起CK-BB升高的疾病急性颅脑外伤脑血管疾病急性细菌性脑膜炎引起CK-BM升高的疾病急性心肌梗塞心肌炎进行性肌营养不良,注意事项,（1）电泳需较高的pH值，酶反应需较低pH。（2）CK不稳定，对光、热及高pH敏感，最好将及时分出的血清充CO2后塞紧管口，置冰室或-30保存，至少可稳定半个月，及时测定效果更好。（3）血清CK活性随温度升高而升高，直至45，更高温度时CK活性迅速下降，56很快失活，琼脂糖电泳法测CK同工酶时，决不能像作LD同工酶用温度较高的琼脂糖底物显色液，否则CK活性
13、丧失，而非脱氢酶（NDH）反应显著。,CK-MM亚型,CK-MM亚型: MM3基因型、组织型 M2M2 MM2 -Lys M1M2 MM1 -2 Lys M1M1 CK-MB亚型: CK-MB1 -2Lys, CK-MB2（组织型）,CK-MM亚型电泳法测定原理,在电泳缓冲液中加入Polybuffer, 通电后形成一pH梯度，进行等电聚胶电泳，自阳极至阴极依次为CK-MM1、CK-MM2和CK-MM3。然后以常规CK同工酶电泳法原理进一步定量。 参考值CK-MM1 57.04.7% CK-MM2 26.55.3% CK-MM3 15.82.5% CK-MM3/CK-MM1 0.280.05（0
14、.15-0.39）,1诊断心肌坏死和损伤 （1）早期诊断心肌梗死 心肌酶 初次升高的 峰值时间 回复正常 通常采样 时间范围(h) (非溶栓) 时间 时间表 CK 4 24 35d CK-MB 312 24h 4872h 每12h*一次3 CK-MM3 16 12h 38h胸痛后60min90min CK-MB2 26 18h 未知 同上 LDH 1218 3d 714d LDH1 810 2448h 1014d 胸痛后24h一次 AST 68 4860 45d ASTm 12 36h 5d 胸痛后12h一次3,心肌酶谱测定的临床意义,心肌梗死诊断的实验室指标的特性,实验室 分子量 生理半衰期
15、 升高时间 峰值时间 恢复正常时间 指标 (KD) (h) (h) (h) (d)CK 86 17 312 1224 34CK-MB活性 86 13 312 1224 23CK-MB质量 86 13 26 1224 3,早期急性心肌梗死的诊断灵敏度, 胸痛后时间(h) 指 标 - 02 34 56 -CK 15 35 70 CK-MB活性 10 25 55 CK-MB质量 30 70 90 -,1诊断心肌坏死和损伤 （1）早期诊断心肌梗塞 （2）有助于非Q波急性心肌梗死的诊断 （3）诊断梗塞延展或再梗死 （4）估计心肌梗死面积 （5）围手术期和围产期心肌损伤的诊断 （6）监护心肌损害或药物对心肌的损害,心肌酶 建议标准 敏感性（%） 特异性（%） CK 达峰值时间3.1%/h 87 7490 60min内CK-MM3/CK-MM10.35 60 100 CK-MM3升高率0.18%/min 92 100 CK-MB 1h升高率0.04UL-1min-1 92 20 下壁心梗90min后增加2.2倍 77 100 前壁心梗90min后增加2.5倍 92 100 CK-MB亚型 2h CK-MB2/CK-MB1峰值3.8 82 78,2判断心肌再灌注,
