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1、细菌的分离培养与鉴定,一 培养基的制备二 消毒与灭菌 三 细菌的接种和培养四 细菌的生化反应,一 培养基的制备,步骤：1 称量药品 2 溶解3 调节PH5 过滤分装6 包扎标记7 灭菌,二 消毒灭菌法,物理灭菌法： 干热灭菌法：150-170 维持 1-2h； 高压蒸汽灭菌法121（101.53kPa）15-30min； 其他：过滤除菌法、紫外线灭菌法。化学灭菌法：主要使用一些化学消毒剂进行，如：75酒精、1的新洁尔灭等。,三 细菌的分离、接种与培养,细菌的分离方法： 稀释法、平板分区划线法。细菌的接种方法： 斜面培养基接种法、液体培养基接种法、穿刺接种法、倾注平板法、平板涂布法。细菌的培养方
2、法： 需氧培养法 CO2培养法 厌氧培养法,3.1 细菌的分离培养方法,连续稀释法平板分区划线 分区划线分离法：此法常用于含菌量较多的标本如混合细菌的分离。 连续划线分离法：此法常用于含菌量不多的标本或培养物中的细菌分离培养,1区,2区,3区,4区,1,2,3,4,平板分区划线法（学生操作）,注意事项,划完前一区后，需重新灼烧接种环后再进行下一区的划线。相邻两区要有重叠区域。结果观察：观察各区的生长情况，并看是否有单一菌落长出；菌落的形态、颜色、大小、边缘、透明度都需记录。,平皿送37温箱培养24小时,结果(要求)两种单个菌落分四区无杂菌琼脂不破,3.2 细菌的接种,斜面接种法 该法主要用于单
3、个菌落的纯培养、 保存菌种或观察细菌的某些特性。 液体接种法 多用于一些液体生化试验管或发酵的接种。穿刺接种法 此法主要用于半固体培养基、明胶 及双糖管的接种。,(1) 斜面琼脂培养基接种法（2人一组） 大肠埃希菌/枯草芽孢杆菌/葡萄球菌,送培养24小时(2支/组)一组 37温箱一组 60温箱一组 4 冰箱,用接种环挑菌后在斜面表面划折线,(2) 液体培养基接种法（2人一组）,1. 菌种 (任选一种）大肠埃希菌/枯草芽孢杆菌/葡萄球菌2. 接种每一菌种分别接种pH5.0 / 7.2 / 9.0的营养肉汤各一支3. 送37温箱培养24小时,液体培养基,沉淀生长,混浊生长,表面生长,(3) 琼脂半
4、固体接种法 （1人一份）,1. 菌种大肠埃希菌/枯草芽孢杆菌/葡萄球菌2. 接种用接种针穿刺接种3. 送37温箱 培养24小时,3.半固体培养法观察细菌是否有动力,1、3：有动力： 呈云雾状2：无动力： 沿穿刺线生长，并变粗,四、细菌的生化反应,1 糖发酵试验(Fermentation of sugars) 2 IMViC 试验靛基质产生试验（吲哚试验）甲基红试验V-P试验枸橼酸盐利用试验3 硫化氢产生试验4 尿素分解试验,糖发酵试验,不同细菌分解糖类的能力和代谢产物不同。例如大肠杆菌能发酵葡萄糖和乳糖；而痢疾杆菌可发酵葡萄糖，但不能发酵乳糖。即使两种细菌均可发酵同一糖类，其结果也不尽相同，如
5、大肠杆菌有甲酸脱氢酶，能将葡萄糖发酵生成的甲酸进一步分解为CO2和H2，故产酸并产气；而痢疾杆菌缺乏该酶，发酵葡萄糖仅产酸不产气。,吲哚（靛基质）试验(Production of indole),有些细菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸而产生靛基质，靛基质无色，不能直接查见，此时滴加数滴吲哚试剂于培养基的液面上，上层呈玫瑰红色者为阳性，仍呈黄色者为阴性。,甲基红（methyl red）试验,将细菌接种于葡萄糖蛋白胨水中，37培养48h后，再向其中加入甲基红试剂3滴。 大肠杆菌等细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，但丙酮酸不被缩合成乙酰甲基甲醇，而转化成甲酸、乙酸等酸性物质，培养基中酸多，pH值低，故
6、呈红色，为阳性。 而产气杆菌将丙酮酸缩合成乙酰甲基甲醇，培养基中酸少，pH值高，故呈黄色，为阴性。,VP（Voges-Proskauer）试验,大肠杆菌和产气大肠杆菌均能发酵葡萄糖，产酸产气，两者不能区别。但产气杆菌能使丙酮酸脱羧生成中性的乙酰甲基甲醇，后者在碱性溶液中被氧化生成二乙酰，二乙酰与含胍基化合物反应生成红色化合物，是为VP试验阳性。大肠杆菌不能生成乙酰甲基甲醇，故VP试验阴性，,枸橼酸盐利用试验(Utilization of citrate),将细菌接种于枸橼酸盐培养基上，37培养48h。产气杆菌等细菌能利用枸橼酸盐作为碳源，分解枸橼酸盐生成碳酸盐，使培养基变为碱性，培养基中的指示
7、剂（溴麝香草酚蓝）由淡绿色转为深蓝色，为枸橼酸盐利用试验阳性。大肠杆菌则不能分解枸橼酸盐，培养基颜色不变，为阴性。,硫化氢产生试验(Production of H2S),将细菌穿刺接种于醋酸铅培养基中，37培养24h后观察结果。有些细菌能分解培养基中的含硫氨基酸，生成硫化氢，穿刺部位呈黑褐色，是为反应阳性。培养基颜色无变化，则为阴性。,尿素分解试验(Splitting of urea),将细菌接种于尿素培养基中，37培养1824h。变形杆菌能迅速(24h)分解尿素产生大量的氨，使培养基变碱而呈紫红色，是为阳性反应。,实验后处理,将接种针和接种环放入原位，摆放整齐！将所有的原菌种管放入自己组的红框试管架中！将自己接种的培养物集中在试管架中统一放入培养箱中37度培养！关照明和电扇开关，请勿关实验室总电源！,
