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1、霉菌及其毒素,我国还没有制定出霉菌的具体指标，鉴于有很多霉菌能够产生毒素，引起疾病，故应该对产毒霉菌进行检验。例如：曲霉属的黄曲霉、寄生曲霉等，青霉属的桔青霉、岛青霉等，镰刀霉属的串珠镰刀霉，禾谷镰刀霉等等。,霉菌和酵母菌数的测定,真菌毒素对我国农产品的影响,我国是一个农业大国，小麦、玉米、大米及花生等是居民的主要食品原料，各类粮油食品均不同程度地被真菌及其毒素污染，几乎所有的真菌毒素在我国农产品中均可检出。我国每年约有2%的（二千五百万公斤）的粮食因受真菌毒素污染而不能食用。,真菌毒素对我国农产品的影响,真菌毒素污染粮油食品还严重影响我国的对外出口贸易。花生是我国大宗出口农产品之一，年创汇约
2、4亿美元，而欧盟是主要出口市场。但自2000年，欧盟实施国际上最严格的黄曲霉毒素限量标准和检验要求（AFB1为2g/kg，总黄曲霉毒素为4g/kg）以来，欧盟以我少量花生检出黄曲霉毒素超标时有发生为由，不断加强入境检验，并启动对我国出口花生产地的调查程序，公布调查报告，多次发布禁令，并于2002年2月对我花生采取特殊严检措施，不仅使我输欧花生严重受限，而且极大影响了欧盟消费者对我花生安全质量的信任，导致我花生出口贸易竞争力急剧下降。仅2000年一年就有四十多个批次的花生被销毁或降低等级。,一 霉菌发育和产毒的条件,水分 影响真菌繁殖和产毒的重要因素是天然基质中的水分和放置环境中的相对湿度。,水
3、分活性,食品中被微生物利用的实际含水量。Aw值反映了溶液和作用物的水分状态，每种微生物只能在一定的Aw值范围内生长, 温度 微生物生长所需的温度，大体分为嗜冷菌、嗜中温菌、嗜热菌三种。 基质 霉菌的营养来源，主要是糖和少量的氮、矿物盐。不同基质对霉菌的生长和产毒是有一定影响的。一般来说天然基质比人工培养产毒为好。 霉菌种类,食品中常见霉菌及毒素, 霉菌种类, 黄曲霉毒素(Aflatoxin) 1. 黄曲霉毒素的特性,黄曲霉毒素是黄曲霉和寄生曲霉产生的代谢产物，具有极强的毒性和致癌性。 黄曲霉毒素是在1960年英国发生的霉变花生“火鸡X病”引起10多万只火鸡死亡事件中被发现的，是导致火鸡死亡的病
4、因，并证实该物质是黄曲霉的代谢产物，命名为黄曲霉毒素（Aflatoxin ，AF）。,黄曲霉毒素,结构类似的一组化合物，均为二呋喃香豆素（difuranocoumarin）的衍生物。虽然AF的衍生物有20多种，目前已分离鉴定出的AF包括AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1、AFM2、AFP1、AFQ、AFH1、AFGM、AFB2a和毒醇等12种，但天然污染粮油食品的AF是B组和G组两大类，即AFB1、AFB2 、AFG1和AFG2。,1. 黄曲霉毒素的特性,（1）化学结构,黄曲霉毒素,AF分子中的二呋喃环是产生毒性的重要结构基础，而香豆素可能与致癌作用有关，AF的毒性、致突变及致癌
5、作用由强到弱的顺序依次为AFB1 AFG1AFM1AFB2AFG2。,黄曲霉毒素,AFB1和AFB2在紫外光下可产生蓝紫色荧光, AFG1和AFG2则产生黄绿色荧光，该特性是检测粮油食品中黄曲霉毒素的重要依据。,黄曲霉毒素,奶牛摄食被AFB1和AFB2污染的饲料后，在牛奶和尿中可检出其羟基化代谢产物AFM1和AFM2。AFM1除了随乳汁排出外，还有部分存留在肌肉中。饲料中的AFB1约有1-6%在奶牛体内转化成AFM1出现在牛奶中。,1. 黄曲霉毒素的特性,（2）特性 a. 耐高热 100、20小时也不能将其全部破坏，在280时发生裂解。 b. 难溶于水 易溶于氯仿和甲醇，而不溶于水。 c. 紫
6、外线下产生荧光 在长波紫外光下产生荧光，作为分型和鉴别依据。,黄曲霉毒素,AFB1难溶于水，易溶于甲醇、丙酮和氯仿等有机溶剂，但不溶于石油醚、己烷和乙醚中。一般在中性及酸性溶液中较稳定，但在强酸性溶液中稍有分解，在pH 9-10的强碱溶液中分解迅速，但此反应可逆，即在酸性条件下又能恢复原来结构。,黄曲霉毒素,AFB1对热非常稳定, 268-269方可破坏, 故一般烹调温度不破坏其毒性。某些化学试剂如5%次氯酸钠和丙酮可使AFB1完全分解，因此在实验室中用此方法对接触过AFB1的器皿作解毒处理。但在紫外线照射可使之分解。,2.黄曲霉毒素产生的条件,仅黄曲霉和寄生曲霉能产生黄曲霉毒素。黄曲霉产毒的
7、好发食品植物性食品：玉米、麦类、大米、花生及其制品、棉籽、树生坚果（巴西胡桃、杏仁、美国山核桃、榛子、阿月浑子果）。动物性食品：乳及乳制品。,黄曲霉的生长,自然条件下，黄曲霉生长繁殖及产生AF所需要的温度范围为1242，最适温度为2532，最低相对湿度为80%左右。该数值相当于小麦、玉米和高粱中水分含量为18.0%18.5%、稻谷为16.5%、大米为17.5%、大豆为17%18%、花生及其他树果为9%10%。,黄曲霉的生长,黄曲霉生长所需的条件决定了该菌是全世界分布最广的菌种之一，在我国各省均有分布。而寄生曲霉从美国夏威夷、阿根廷、巴西、荷兰、印度、印度尼西亚、日本、约旦、波兰、期里兰卡、土耳
8、其、乌干达等国的农作物中分离出。,黄曲霉的生长,我国广西、江苏、江西、湖北、黑龙江、山东、安徽、湖南、陕西、吉林、辽宁、河南、河北、四川、浙江和甘肃共17个省粮食中分离到的黄曲霉菌株的产毒性能进行了研究，结果表明，除甘肃省外，其他16个省均分离出产AFB1菌株，分布情况是，华中、华南和华东地区产毒菌株多，产毒量也高，产毒在10 mg/kg 以上的强毒株占10%以上。东北和西北地区产毒株较少，产毒量也低，可能与当地寒冷的气候条件有关。,黄曲霉的生长,在实验的1660株黄曲霉中，来自广西的145中有86株（59.3%）产毒，其中23（15.9%）株为强毒株,产毒量最高者达400 mg/kg，从产毒
9、菌株数和产毒量上均为全国之最。该研究结果与17省区粮油食品中AFB1的污染水平和原发性肝癌的发病率呈正相关关系。Gabal等报道，产毒的黄曲霉中有40的菌株可同时产生AFB1、AFB2、AFG1和AFG2。,黄曲霉毒素对食品的污染,黄曲霉是分布最广的霉菌之一，分布遍及全世界，我国各省都有分布。黄曲霉毒素主要污染粮油及其制品。,黄曲霉毒素对人体健康的危害,（1）急慢性毒性： 黄曲霉毒素是一种毒性极强的剧毒物，其毒性是氰化钾的10倍，其中以黄曲霉毒素B1毒性最大。（2）致癌性： 黄曲霉毒素是目前发现的最强的化学致癌物之一。是人类肝癌发生的重要原因。,5.黄曲霉毒素最高允许量标准的制定我国食品中黄曲
10、霉毒素允许量标准, 食品种类 黄曲霉毒素B1允许量标准 玉米 20ppb 花生及其制品 20ppb 大米 10ppb 食用油 10ppb 其它粮食、豆类及发酵食品 5ppb 婴儿代乳食品 不得检出 ,GB2761-2011 食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇限量指标,GB2761-2011 食品中展青霉素限量指标,GB2761-2011 食品中赭曲霉素A限量指标,GB2761-2011 食品中玉米赤霉烯酮限量指标,真菌毒素和霉变食品中毒,一、赤霉病毒食物中毒 赤霉病毒食物中毒是真菌性食物中毒的一种，主要发生在长江中下游地区。（一）病原及中毒机制 赤霉病麦的病原菌为镰刀菌，其中最主要的是禾谷镰刀菌。在谷物
11、上和适宜繁殖温度是16-24，相对湿度85%，大麦、小麦、元麦等在田间抽穗灌浆时，如条件适宜即可发生赤霉病。玉米、稻谷、甘薯、蚕豆等作物也可发生。,四.真菌毒素致病的特点,对于真菌毒素致病的特点有以下几点： 1.中毒的发生常常与某些食物有联系； 2.检查所怀疑的食物或饲料时，常可发现真菌或真菌毒素； 3. 发病有一定的季节性； 4.不具有传染性和免疫性； 5.化学药物和抗生素的疗效很差或无效； 6.常常并发维生素缺乏症，但与真正的维生素缺乏症不同，用补充维生素来治疗无效。,五. 防霉与去毒,控制霉菌产毒的最好方法是根据霉菌的生物学特点，采取防止霉菌生长的措施。用有机酸（乙酸丙酸混合物或丙酸）可
12、用于水分高的谷物阻止霉菌的生长，使其不能产毒。,1、预防黄曲霉的生长及其毒素的污染,2、物理学去毒法,(1)挑选法 (2)吸附法 (3)搓洗法 (4)高温处理法 (5)辐射处理法 (6)微波法,2、物理学去毒法,(1)挑选法 粮食作物种子中的AFT分布很不均匀，常常集中在霉烂变质、带色或发芽的粮食颗粒中，一般小于1，有时一粒种子内，AFT的含量高达110-3(1mg/g)。所以，可用挑选法去除含AFT的种子。以杜绝隐患，防止进一步污染其他粮食。常用的挑选法有手工法、机械法、电子技术等。,2、物理学去毒法,(2)吸附法 植物油中的AFT，利用活性白陶土、活性炭的物理吸附法，去毒效果十分显著，广西
13、省已用在实际生产中。此法适用于豆油、花生油等植物油的处理，处理后的油AFT含量降低到(520)10-9，另外水分、杂质和酸价都有不同程度的降低。,2、物理学去毒法,(3)搓洗法 本法适用于稻米类。稻米中污染了AFT后，米糠层内的AFT为米仁中AFT的数倍。因此，在大米食用前反复加水搓洗，到水清为止，基本上可以达到去毒目的。一起将染毒米用水搓洗4次5次后， AFT的含量可降低8590。,2、物理学去毒法,(4)高温处理法 纯粹的高温处理很难破坏AFT的毒性。在油中加入油量的217的食盐(相当于平时炒菜用盐量)，加热180200 0.5min，解毒效果可达95以上。北方人的炒菜习惯，放菜前先在油中
14、加入盐、葱、姜、大料等调味品，加热到180左右，都有一定的解毒效果。,2、物理学去毒法,(5)辐射处理法-射线具有较强的穿透力，能破坏AFT的化学结构而解毒。用(510)Mrod -射线处理花生粉，可将全部的AFT破坏，所得产品无任何毒性。近年来的研究证明辐射可以杀死霉菌和细菌，有利于粮食的保藏。,2、物理学去毒法,(6)微波法 微波产生的热能可迅速将AFT降解去毒。染毒花生粉用3.2kW微波加热（150)处理5min，AFTB降低95，而对蛋白质和脂肪酸无任何影响。另据报道：红外线、远红外线、紫外线、激光等也能破坏AFT。,3、化学去毒法,(1)碱处理法 (2)有机溶剂萃取法 (3)氧化剂降
15、解法 (4)中草药去毒法,3、化学去毒法,(1)碱处理法 根据AFT在碱性条件下不稳定性，可用碱法处理。其机理是在碱性条件下，AFT结构中的氧杂萘邻酮环发生开环，生成几乎无毒性的羧酸钠盐。常用的碱有碳酸钠、氢氧化钙、氨水等，去毒一般在55以上。家庭煮饭对加入适量的碱(NaHCO3)即可达到去毒目的。碱处理过的食品或粮食经动物验证基本无毒。,3、化学去毒法,(2)有机溶剂萃取法 AFT为脂溶性毒素，易溶于极性溶剂，所以可用有机溶剂进行提取分离。常用溶剂有：水合乙醇、异丙醇、丙酮或丙酮、正已烷和水的混合物进行去毒。提取需反复3次5次，去毒效果在90以上，其中以丙酮和水(90：100)混合液效果最好
16、，此法常用于AFT的分析测定。处理后的食品挥尽溶剂后可食用。,3、化学去毒法,(3)氧化剂降解法 氧化剂可以迅速将AFT氧化降解去毒。常用的氧化剂有漂白粉Ca(ClO)2、氯气(Cl2)、双氧水(H2O2)、臭氧(O2)等。其中以漂白粉去毒效果最强，高度污染的花生粉(含1010-11黄曲霉毒素)用5漂白粉处理几秒钟就可以全部去毒。H2O2也是一种比较强的氧化剂，在pH9.5 7080用6 H202处理含AFT的食品，20min即可以全部去毒。用氧化剂处理过的粮食经火鸡喂养实验证明无毒。,3、化学去毒法,(4)中草药去毒法 1976年我国首次发现山苍子中的挥发油可以彻底除去食品中的AFT。其机理
17、是挥发油中含有几种活泼成分，它们可以与AFT发生加成和缩合反应，从而改变了其分子结构，达到去毒目的。实验证明，AFT超过国标20倍的玉米、稻谷或超标2500倍的花生经大剂量山苍子芳香油熏蒸处理可一举去毒。此法简便、易行，特别适合于家庭应用，如发现粮食霉变，可将该芳香油(用量0.5mL50kg)置广口瓶中，用纱布扎住瓶口，将其埋于待处理的粮食中即可去毒，并且对食品的质量和营养成分等无任何影响。另外，中药甘草、葫芦巴、羽扇豆、茴香、艾属植物的花以及五香粉、大蒜等都有去除食品中AFT的作用。,六. 引起食品变质的酵母菌,1. 鲁氏酵母和 蜂蜜酵母能使果酱和蜂蜜变质。2. 粉状毕赤氏酵母能耐受高浓度的
18、酒精并使之氧化，常使酒类和酱油产生变质，并在表面形成白色干燥浮膜。3. 粘红酵母和胶红酵母这两种酵母可产生红色或黄色色素，因具荚膜形成粘质样的菌落。4. 杆状球拟酵母能在含糖55蜂蜜内生长。故又称耐糖性酵母。5. 裂殖酵母属的代表种，粟酒裂殖酵母能使蜂蜜、无核小葡萄干、干梅干和无花果腐败。,七. 霉菌和酵母计数,一、检验程序 检样处理稀释平板分离培养菌落计数报告二、操作要点,（一）、采样1、粮食(包括粮库贮粮，粮店或家庭小量存粮)样品的采集，可根据粮囤或粮垛的大小和类型，分层定点取样，一般可分三层五点，或分层随机采取不同点的样品，充分混合后，取500g左右送检。小量存粮可使用金属小勺采取上、中
19、、下各部位的混合样品。,2、海运进口粮的采样：每一船仓采取表层、上层、中层及下层四个样品，每层从五点取样混合，如船仓盛粮超过10000t，则应加采一个样品。必要时采取有疑问的样品送检。,3、谷物加工制品(包括熟饭、糕点、面包等)、发酵食品、乳及乳制品以及其他液体食品，用灭菌工具采集可疑霉变食品250g，装入灭菌容器内送检。,（二）、样品处理（稀释）,1、以无菌操作称取检样25g(或25mL)，放人含有225mL灭菌水的玻塞三角瓶中，振摇30min，即为1：10稀释液。2、用灭菌吸管吸取110稀释液10mL，注入试管中，另用带橡皮乳头的1mL灭菌吸管反复吹吸50次，使霉菌孢子充分散开。3、取1m
20、L110稀释液注入含有9mL灭菌水的试管中，另换一支1mL灭菌吸管吹吸5次，此液为1100稀释液。,（三）、培养,倒置于2528温箱中，3d后开始观察，共培养观察5d。（四）、计数 选取菌落数10150之间的平板进行计数。（稀释度选择和菌落报告方式参考菌落总数的测定）,检测中的注意事项：,1、取样的代表性。2、取样工具的无菌。 空气中霉菌的孢子含量很高，所以，取样的工具、容器等要经过严格的高压灭菌。3、检样的方法。 （1）、由于霉菌易被携带，所以，检样时操作人员应尽量避免自身携带的可能。 （2）、样品的均质及充分振摇。因为有些孢子是连成串的，故均质和振摇能使其充分散开，同时，在各梯度连续稀释时
21、，也要用灭菌吸管反复吹吸几次，使孢子充分散开。4、培养温度和时间。培养温度25-28培养，3天后观察，需培养观察一周。,检样中常见的问题：(1) 不同稀释度计数结果相同。(2) 不生长或生长很好连成片无法计数。原因：（1）稀释时未经反复振摇，吹吸，导致孢子未充分散开，影响了计数的结果。（2）由于培养基不适宜，PH值低等，致使生长较慢。（3）观察时间的掌握。真菌生长较慢，故需3d后才能观察出结果。每天都要观察结果。,培养基机理,1.高盐察氏培养基 主要机理：该培养基是一种合成培养基，适用于分离霉菌。并在高浓度的氯化钠下，可消除细菌的干扰。适用于粮食，如米、麦粒等中霉菌的检测。2.孟加拉红培养基 主要机理：孟加拉红是一种抑制细菌生长剂，并不是一种指示剂；氯霉素是一种广谱抗生素，起杀死细菌作用。该培养基适用于分离霉菌和酵母。,
