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1、第六章 微生物的生长及其控制,个体生长 个体繁殖 群体生长群体生长 个体生长+个体繁殖 由于微生物的个体极小，所以常用群体生长来反映个体生长的状况,第一节 微生物纯培养的生长,一、获得微生物纯培养的方法纯培养的概念：微生物学中将从一个细胞得到的后 代称为纯培养获得微生物纯培养的方法： 稀释倒平板法 划线法 单细胞挑取法 利用选择培养基培养法,稀释倒平板法,平板划线分离法,用接种环以无菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线 ，如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。,单孢子或单细胞分离法,采取显微分离法从混杂群体中直接分
2、离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养 。,在显微镜下使用单孢子分离器进行机械操作，挑取单孢子或单细胞进行培养。也可以采用特制的毛细管在载玻片的琼脂涂层上选取单孢子并切割下来，然后移到合适的培养基进行培养。,选择性培养基分离法,各种微生物对不同的化学试剂、染料、抗生素等具有不同的抵抗能力，利用这些特性可配制合适某种微生物而限制其它微生物生长的选择培养基，用它来培养微生物以获得纯培养。,微生物纯培养分离方法的比较,二、 微生物的同步生长,同步生长的概念：采用一定的方法使细胞群体处于分 裂步调一致的状态，称为同步生长 通过环境条件诱导同步生长群体获得同步生长的方法 （温度、培养基成分等） 通过物
3、理方法选择同步生长群体 （离心方法、过滤分离、硝酸纤维素滤膜）,硝酸纤维素滤膜法,离心法,三、测定生长繁殖的方法,测体积 直接法 称干重测生长量 比浊法 间接法 测含碳量 生理指标法 测含氮量 其它（P 、 DNA）,（二）微生物生长量和生理指标的测定方法,1.湿重法:将微生物培养液离心，收集细胞沉淀物，然后称重。2.干重法：离心得到的细胞沉淀物置100105的烘箱中干燥过夜至除去水分，然后称重。3.含氮量测定法：一般微生物细胞的含氮量比较稳定，可以用凯氏定氮法等测其总量，再乘以系数6.25即为粗蛋白含量，蛋白含量越高，说明菌体数和细胞物质量越高。4.DNA含量测定法：微生物细胞的DNA含量比
4、较稳定，采用适当的荧光指示剂与菌体DNA作用，荧光比色或分光光度计法测DNA含量。5.其它生理指标：如测定碳、磷、RNA、ATP、DAP的含量。,比例计数法 直接法 血球计数法计繁殖数 液体稀释法 间接法 平板菌落计数法,第二节 微生物的生长规律,细胞数 延滞期 指数期 稳定期 衰亡期单细胞微生物的典型生长曲线,延滞期的特点,生长速度为零细胞体积急剧增大细胞内的RNA尤其是rRNA含量增高，细胞呈嗜碱性合成代谢活跃，易产生诱导酶对外界不良环境条件敏感,影响延滞期长短的因素,接种龄接种量培养基成分 发酵工业上需尽量缩短该期，以降低生产成本 在食品工业上，尽量在此期进行消毒或灭菌,指数期的特点生长
5、速度常数R最大细胞进行平衡生长酶系活跃，代谢旺盛影响指数期微生物增代时间的因素菌种营养成分营养物的浓度 发酵工业上尽量延长该期，以达到较高的菌体密度 食品工业上尽量使有害微生物不能进入此期,细菌研究中常用的三个参数,繁殖代数（n） 指数生长方式： 1 2 4 8 2n 设接种时细胞数为x1, 时间为t1, 到时间t2后，繁殖n代，细胞数为x2，它们之间的相互关系为： x2 = x1*2n以对数表示： x2 = x1 + n2 x2 - x1 n = = 3.322( x2 - x1 ) 2,生长速度常数（R） n x2 - x1 R = = t2 t1 t2 t1代时(G) 1 t2 t1 G
6、 = = R 3.322( x2 - x1),稳定期,特点： 1 生长速率常数R等于0 2 菌体产量达到了最高值 3 合成次生代谢产物 4 细胞内出现储藏物质，芽孢菌内开始 产生芽孢产生原因： 营养物尤其是生长限制因子的耗尽 营养物的比例失调，如碳氮比不合适 有害代谢废物的积累（酸、醇、毒素等） 物化条件（pH、氧化还原势等）不合适,衰亡期,特点： 1 R为负值 2 细胞的形态发生变化，出现不规则的衰退形 3 释放次生代谢产物，芽孢等 4 菌体开始自溶产生原因： 生长条件的进一步恶化，使细胞内的分解代谢大大超过合成代谢，继而导致菌体的死亡,第三节 影响微生物生长的主要因素,温度 氧气 辐射 物
7、理因素 干燥 渗透压 超声波与微波 酸、碱与pH 重金属及其化合物 表面消毒剂 有机化合物（酚类、醇类、醛类） 卤族元素及其化合物 表面活性剂（新洁尔灭、杜灭芬） 化学因素 染料 抗代谢药物：磺胺类等 化学治疗剂 抗生素 中草药有效成分,温度,不同的微生物生长的温度范围不同，根据生长与温度的关系，微生物的生长有三个温度基点，即最适、最高、最低生长温度，根据微生物的最适生长温度的不同，可将微生物分为：低温微生物、中温微生物和高温微生物，它们的生长温度如下表,高温对微生物生长的影响,嗜热微生物的生长特性 高温菌在高温下生长的原因： 抗热的酶，膜中的高饱和脂肪酸 高温菌的生长特性： 生长曲线的各个时
8、期均短暂，因此常会在腐败食品中检测不到，这在食品检验中要特别注意,微生物耐热性大小的几种表示方法： 热力致死时间：在特定的温度及其它条件下，杀死一定数量的微生物所需要的时间 F值：在一定的基质中，温度为121.1，加热杀死一定数量微生物所需的时间 D 值：利用一定温度进行加热，活菌数减少一个对数周期（即90%活菌被杀死）所需的时间 Z值：在加热致死曲线中，时间降低一个对数周期（即缩短90%的加热时间）所需要升高的温度,影响微生物对热抵抗力的因素： 菌种的遗传特性 菌龄 微生物的数量 基质的特性（组成、浓度、理化条件） 加热的时间与温度,灭菌与消毒的概念： 灭菌是指采用强烈的理化因素使任何物体内
9、外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施；消毒是一种采用较温和的理化因素，仅杀死物体中病原微生物的措施加热灭菌和加热消毒的方法： 干热灭菌法 火焰灭菌法 干燥加热空气灭菌法高温灭菌 巴氏消毒法(2) 常压下 煮沸消毒法 湿热灭菌法 间歇灭菌法 常规加压灭菌法 加压下 (高压蒸汽灭菌法) 连续加压灭菌法 （超高温瞬时杀菌UHT）,影响加压蒸汽灭菌效果的因素,灭菌物体的含菌量灭菌锅内空气的排除程度灭菌物体的pH值灭菌对象的体积加热与散热的速度,高温对培养基的影响及其防止措施,高温对培养基的不利影响： 形成沉淀物（有机沉淀物如多肽类，无机沉淀物如磷酸盐）；破坏营养；提高色泽（褐变如产生氨基糖等）
10、；改变培养基的pH值；降低培养基的浓度消除有害影响的措施 采用特殊的加热灭菌法 过滤除菌法 加入螯合剂,低温对微生物生长的影响,低温微生物耐低温的原因： 胞内酶耐低温；细胞膜中不饱和脂肪酸的含量高。低于冰点的温度对微生物的影响： 水分的丧失；冰晶对细胞膜的物理损伤。 速冻、缓冻与反复冻溶对微生物细胞的影响,低温的用途,菌种保藏 液氮的温度（-195）、干冰温度（-70 ）、-20 和4 （常加大分子保护剂如糊精、血清白蛋白等）食品冷藏冷藏（0-4 ）与动藏（-18 ）,氧气,根据微生物生长与氧气的关系，可将微生物分为以下几种： 专性好氧菌：在正常大气压下（0.2巴）进行好氧呼吸产能 好氧菌 兼
11、性厌氧菌： 以呼吸为主，兼营发酵或无氧呼吸产能 微好氧菌：只能在0.01-0.03巴大气压下生活 厌氧菌 耐氧菌：只能以发酵产能，但分子氧无毒害 （专性）厌氧菌：只能生长在无氧或基本无氧条件下，氧剧毒过氧化物歧化酶、过氧化氢酶、细胞色素氧化酶的分布情况,氧气影响微生物生长的机制,厌氧菌氧毒害的机制： 由于厌氧菌细胞内缺乏SOD，无法消除02.- ，后者反应力很强，性质极不稳定，在细胞内可破坏各种重要的生物大分子和膜，也可形成其他活性氧化物，对生物非常有害好氧与耐氧菌驱除02.-机制： H2O2(好氧菌) H2O+1/202 SOD2 02.-+2H + H2O2+ 02 好氧及耐氧菌 过氧化物
12、酶（耐氧菌） 2H2O,辐射,不同波长的射线对微生物的作用不同，可见光部分（400-800纳米）往往能被某些光合微生物所利用，而波长较短的紫外线（13.6-400纳米）、X-射线（0.06-13.6纳米）、r-射线（0.01-0.14纳米）均可抑制甚至杀死微生物。尤其是r-射线因作用距离较远、穿透力较强而用于食品的杀菌保藏。物理杀菌：一类新的冷杀菌技术，它在克服热杀菌不足之处的基础上，运用物理手段如电场、高压、电子、光等的单一或两种以上的共同作用，在低温或常温下达到杀菌的目的。这种方法不须向食品中加入化学物质，不会使菌体产生抗性，且条件易于控制，在保持食品自然风味的基础上，杀菌效果明显。常用的
13、物理杀菌的方法有超高压脉冲电场杀菌、脉冲强光杀菌、半导体光催化杀菌，辐射杀菌,干燥（湿度）,水分约占微生物细胞组成的70-85%，环境中缺水时（干燥的环境）引起微生物细胞内蛋白质的变性和盐类浓度的增高，抑制微生物的生长，甚至造成微生物的死亡。干燥对微生物的作用受环境温度、失水速度、菌龄、微生物所处基质等条件的影响。干燥用于食品保藏的方法可分为两类，即自然干燥（熏干、晒干、冷冻干燥）和人工干燥（常压干燥如热风、喷雾、冻结、微波等；真空干燥如真空和冷冻真空干燥）,渗透压,微生物生长与渗透压的关系（高渗透压、低渗透压对微生物生长的影响）根据微生物对高渗透压耐性的不同，将其分为以下三类： 高度嗜盐细菌
14、（20-30%食盐溶液中生长） 嗜盐细菌 中等嗜盐细菌（5-18%的食盐溶液中生长） 低等嗜盐细菌（2-5%的食盐溶液中生长） 耐盐细菌（可在10%以下的食盐溶液中生长） 耐糖细菌（可在60%以下的含糖高渗溶液中生长）* 普通微生物一般在0.85-0.90的食盐溶液中生长,H值,根据微生物生长的最适pH值，将微生物分为： 嗜碱微生物：硝化细菌、尿素分解菌、多数放线菌 耐碱微生物：许多链霉菌 中性微生物：绝大多数细菌，一部分真菌 嗜酸微生物：硫杆菌属 耐酸微生物：乳酸杆菌、醋酸杆菌不同的微生物最适生长的pH值不同，同一种微生物在不同的生理阶段对pH值的要求也不同，在发酵工业中，控制pH值尤其重要
15、，如黑曲霉在pH2-2.5主要产柠檬酸， pH2.5-6.5 以菌体生长为主，pH7时以合成草酸为主各类微生物生长的最适pH值： 细菌为6.5-7.5 ，放线菌为7.5-8.0，霉菌和酵母菌为 4-6,酸碱添加剂的抑菌机理,无机酸可增加氢离子的浓度，引起菌体表面蛋白的变性和核酸的水解，并破坏酶类的活性作为食品防腐剂的有机酸如苯甲酸和水杨酸可与微生物细胞中的成分发生氧化作用，从而抑制微生物的生长防腐：利用理化因素完全抑制霉腐微生物生长繁殖的措施碱类物质可引起细胞物质的水解或凝结，以杀死或抑制微生物，食品工业中常用石灰水、NaOH、Na2CO3等作为机器、工具以及冷藏库的消毒剂,几种常用表面消毒剂及其应用,表面消毒剂：对一切活细胞都有毒性，不能用作活细胞内化学治疗用的化学药剂,
