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1、第五章 微生物的遗传变异与菌种选育,Chapter 5. Microbial Genetics,遗传：,亲代与子代相似,变异：,亲代与子代、子代间不同个体不完全相同,遗传（inheritance）和变异（variation）是生命的最本质特性之一,遗传型：,表型（表现型）：,生物的全部遗传因子及基因,具有一定遗传型的个体，在特定环境条件下通过生长发育所表现出来的形态等生物学特征的总和。,表型是由遗传型所决定，但也和环境有关。,表型饰变：,表型的差异只与环境有关特点：暂时性、不可遗传性、表现为全部个体的行为,遗传型变异（基因变异、基因突变）：,遗传物质改变，导致表型改变特点：遗传性、群体中极少数
2、个体的行为 （自发突变频率通常为10-6-10-9）,微生物是遗传学研究中的明星：,微生物细胞结构简单，营养体一般为单倍体，方便建立纯系。,很多常见微生物都易于人工培养，快速、大量生长繁殖。,对环境因素的作用敏感，易于获得各类突变株，操作性强。,微生物的独特生物学特性：,（1）个体极其简单；（2）营养体一般都是单倍体；（3）易于在成分简单的组合培养基上大量生长繁 殖；（4）繁殖速度快；（5）易于积累不同的中间代谢产物或终产物；（6）菌落形态特征的可见性和多样性；（7）环境条件对微生物群体中各个个体作用的直 接性和均一性；（8）易于形成营养缺陷型；（9）各种微生物一般都有相应的病毒；（10)存在
3、多种处于进化过程中的原始有性生殖方式；,第一节 微生物遗传变异的物质基础,经典试验1. 肺炎链球菌的转化试验（a）S型和R型细胞侵染试验,一、遗传和变异的物质基础,分离后的S型细胞物质对R型细胞的转化,A. D. Hershey和M. Chase， 1952年,（1）含32P-DNA的一组：放射性85%在沉淀中,上清液中含15%放射性,沉淀中含85%放射性,沉淀中含25%放射性,以32S标记蛋白质外壳做噬菌体感染实验,（2）含35S-蛋白质的一组：放射性75%在上清液中,上清液中含75%放射性,结论,细胞生物的遗传物质是双链DNA病毒的乙醇物质可以是单链的或双链的DNA或RNA， 即：ssDN
4、A，dsDNA，ssRNA或dsRNA。,二、的结构与复制,1的结构 2DNA的复制3,1的结构,Watson 和Crick在1953年描述了DNA的结构模型： DNA分子是由两条相互平行、方向相反的多核苷酸单链以右手螺旋方向相互缠绕而形成的双螺旋。 脱氧核糖和磷酸构成的主链位于外围，通过氢键相互交联的碱基处于双螺旋的内部。 腺嘌呤与胸腺嘧啶配对，鸟嘌呤与胞嘧啶配对；两条单链互补；一条链的碱基序列限定了另一条链的序列。,2DNA的复制,细菌DNA的q-形复制 真核生物DNA的复制,10100 mm,复制叉,复制叉,复制原点,模板新生链,.,有种类型trm反义,三.遗传物质的存在形式,真核生物细
5、胞中的DNA中只有不到5的DNA用于所需蛋白质的基因表达，其余的DNA起“结构”作用或“调节”作用。DNA被紧密地包装在多条染色体中，每条染色体中含有一个线状DNA分子，它以左手螺旋方向围着一个个组蛋白八聚体绕圈1.8周，形成串珠状的染色质，被串在一起的小颗粒称为核小体，染色质进一步卷曲形成每圈6个核小体、直径30 nm的染色质丝，它折叠成许多超螺旋环附着在中央骨架上。,真核生物的染色体结构,From BIOLOGY by Jack C Carey et al., eds,细菌染色体DNA的大小和结构,(a)大肠杆菌细胞大小和染色体DNA长度的比较；(b)细菌细胞中的拟核；(c)大肠杆菌染色体
6、结构电镜图。宽1.11.5 mm、长26 mm的细胞里包装着的一个DNA分子的长度达1 mm；这个环状的DNA分子在细胞中形成含有一个染色体的拟核；在染色体的中心有一个由DNA结合蛋白和膜组成的骨架，DNA分子附着在骨架上形成50100个超螺旋的环，每个环中含碱基对约50100 kb，这种多层次折叠使DNA处于高度压缩状态.,From figures in referenced book 5.,染色体以外的遗传因子,线粒体和叶绿体中含有的DNA能够自体复制，并编码执行线粒体和叶绿体功能的蛋白，属于染色体以外的遗传因子。 质粒一般指存在于细菌、真菌等微生物细胞中，独立于染色体以外，能进行自我复制
7、的遗传因子。质粒的大小为11000 kb，常为环状的双链DNA分子，也有线状DNA或RNA质粒。 有些质粒既能够整合到染色体上，又能以游离状态存在，并能携带部分染色体基因进行转移，它们被称为附加体。,第二节微生物的基因突变,一、 突变的类型,一个基因内部遗传结构或DNA序列的任何改变,基因突变：,（一）按突变涉及的范围来分,（二）按突变所带来的表型改变来分,.形态突变型：指细胞形态结构发生变化或引起菌落形态改变的那些突变类型.致死突变型：由于基因突变而造成个体死亡的突变类型.条件致死突变型：限定条件下表达突变性状或致死效应，而在许可条件下的表型是正常的.营养缺陷突变型：指某种微生物经基因突变而
8、引起微生物代谢过程中某些酶合成能力丧失的突变型，它们必须在原有培养基中添加相应的营养成分才能正常生长繁殖。 .抗性突变型：是指一类能抵抗有害理化因素的突变型，细胞或个体能在某种抑制生长的因素存在时继续生长与繁殖。 .抗原突变型：是指细胞成分，特别是细胞表面成分如细胞壁、荚膜、鞭毛的细致变异而引起抗原性变化的突变型。,突变,自发突变,诱变,环境因素的影响，DNA复制过程的偶然错误等而导致，一般频率较低，通常为10-6-10-9 。,某些物理、化学因素对生物体的DNA进行直接作用，突变以较高的频率产生。,（三）按突变的条件和原因划分,二、基因突变的特点,1）自发性2）稀有性3）诱变性4）独立性5）
9、稳定性6）可逆性,三 、基因突变的机制（一）自发突变的机制 1 背景辐射和环境中多因素低剂量的诱变效应 2 微生物自身代谢产物的诱变效应 3 互变异构效应 4 环状突出效应（二）诱发突变的机制 1 碱基对的置换 直接引起置换的诱变剂 （亚硝酸类、烷化剂类） 间接引起置换的诱变剂 （碱基类似物） 2 移码突变 3 染色体畸变,碱基对的置换,碱基对的置换可分成两个亚类：一类是DNA 链上的一个嘌呤被另一个嘌呤或是一个嘧啶被另一个嘧啶所置换，称为转换；另一类是DNA 链上的一个嘌呤被另一个嘧啶或是一个嘧啶被另一个嘌呤所置换，称为颠换 A：T T：A A T C：G G：C C G 双链DNA 单链D
10、NA （实线代表转换，虚线代表颠换）,直接引起置换的诱变剂,亚硝酸是一种对含有氨基的碱基对直接作用而诱发碱基对转换的诱变剂。它能使碱基中的氨基氧化脱氨，从而使腺嘌呤（A）变成次黄膘呤（H），胞嘧啶（C）变成尿嘧啶（U）， 而后由于H 和C 配对，U 与A 配对，因此当DNA 再次复制时，A:T 就转换为 G:C，而G:C 就转换为 A:T。,H:C H:C-G:C H:CG:C A:T H:T-A:T亚硝酸类引起的碱基对置换,烷化剂是诱变育种极其重要的一类诱变剂，它们的化学结构都带有一个或多个活性烷基。所有这些物质通过烷化磷酸基形成烷化嘌呤和烷化嘧啶与DNA 作用，特别是经常形成烷化鸟嘌呤。烷
11、化作用导致基因突变的机制尚未定论。 碱基类似物作用，引起碱基配对的错误。 烷基在鸟嘌呤 引起脱嘌呤作用，使鸟嘌呤从DNA 链上脱落下来，进而引起DNA 复制时碱基对的缺失和置换。,间接引起置换的诱变剂,A:BU /G:BrU G:BrU -G:C 5-BU A:T- A:BU- A:T (a) G:BrU /A:BU A:BU-A:T 5-BrU G:C-G:BrU -G:C (b)5-溴尿嘧啶的诱变效应 a.5-BU以酮式掺入； b.5-BrU以烯醇式掺入,5-氨基尿嘧啶（5-AU）、8-氮鸟嘌呤（8-NG）、-氨基嘌呤（-AP）及 6-氮嘌呤（6-NP）等。它们的作用是通过活细胞的代谢活动
12、掺入到DNA 分子中后，引起碱基对的置换，因此是间接的。在这些碱基类似物中，最常被应用的是 5-溴尿嘧啶（5-BrU）和-氨基嘌呤（-AP）。 5-BrU是T 的代谢类似物。 5-BrU 以酮式状态时可以替代 T，与A配对； 5-BrU 以烯醇式状态时替代C与G配对；5BrU 可以通过烯醇式和酮式结构的变化； 引起碱基对置换。,移码突变,移码突变 这是指由一种诱变剂而引起DNA 分子中的一个或少数几个碱基插入或缺失，从而使该部位后面全部遗传密码发生转录错误的一类突变。吖啶类染料及其化合物是移码突变的有效诱变剂，例如三氨基吖啶，吖啶黄，吖啶橙，5-氨基吖啶。 吖啶类化合物的诱变机制目前还不很清楚
13、。现普遍认为，由于吖啶类化合物是一种平面型三环分子结构，与一个嘌呤:嘧啶碱基对相似，因此能够嵌入两个相邻的DNA碱基对之间，造成双螺旋的部分解开，从而在DNA 复制过程中，会使链上插入或缺失一个碱基，结果引起移码突变。,染色体畸变,染色体畸变是指由诱变剂引起DNA 分子的大损伤，它包括染色体结构上的缺失、重复、易位及倒位等。紫外线、X 射线、射线等射线及亚硝酸、烷化剂等均能引起染色体畸变，尤其是紫外线能引起DNA 分子多处较大的损伤。紫外线主要通过在同链DNA 相邻的嘧啶间或在互补双链间形成以共价键结合的胸腺嘧啶二聚体，微生物能以多种方式去修复被紫外线损作后的 DNA，主要方式有两种： （1）
14、光复活作用。 由于微生物中一般都存在着光复合作用，因此，用紫外线照射菌液时都须在红光下进行操作处理微生物，而后在暗室或用黑布包起来培养。 （2） 暗修复作用。也称切除修复作用。 X 射线和 射线为电离辐射，含有很高的能量，能产生电离作用，因而能直接或间接地改变DNA 结构。直接的效应是碱基的化学键，脱氧核糖的化学键和糖酸相连接的化学键断裂；,第三节 微生物的基因重组,基因重组又称为遗传重组，它是指把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传分子的重新组合后，形成新遗传型个体的过程。 重组是分子水平上的概念，可以理解成是遗传物质分子水平上的杂交，而一般所说的杂交是细胞水平上的概念。 杂交中
15、必然包含着重组，而重组则不限于杂交一种形式。真核微生物中的有性杂交，准性生殖以及原核微生物中的转化、转导、接合和溶原转变等都是基因重组在细胞水平上的反映。,一、原核微生物的基因重组（一）转化（transtormation）,受体菌直接吸收来自供体菌的DNA 片段，通过交换组合把它整合到自己的基因组中，从而获得了供体菌的部分遗传性状的现象，称为转化。转化后的受体菌，称为转化子。供体菌的DNA 片段称为转化因子。 只有处于感受态的细菌才能接受转化因子，进行转化作用。,转化过程大致是这样的： 从供体菌提取出转化因子双链DNA片段； 双链DNA 片段与感受态受体菌的细胞表面特定位点结合； 在结合位点上
16、，双链DNA 中的一条单链逐步降解，同时另一条链逐步进入受体细胞。 进入受体细胞的DNA 单链与受体菌染色体组上同源区段配对，而受体菌染色体组的相应单链片段被切除，并被进入受体细胞的DNA 单链所取代，于是形成了杂种DNA 区段； 受体菌染色体进行复制，其中杂种区段被分离成两个，一个恢复，一个形成一个转化子。,一、原核微生物的基因重组（二）转导（transduction ）,通过缺陷型噬菌体或温和型噬菌体为媒介，将供体细菌细胞中DNA 片段携带到受体细菌细胞中，从而使受体细菌获得供体细菌的某些遗传性状的现象，称为转导。 根据媒介噬菌体的不同，转导分普遍性转导和局限性转导两类。,1普遍性转导 由
17、缺陷型噬菌体误包（而非整合）供体细菌DNA 中的任何一部分片段（包括核外遗传物质在内）后，当它再次感染受体细菌时，使后者获得了这部分遗传性状的现象，称为普遍性转导。它的转导频率为 105108。 2局限性转导（特异性转导） 由温和噬菌体侵染而形成的某一溶源细菌群被诱导裂解时，其中极少数个体的DNA 可能与噬菌体DNA 发生若干特定基因的交换，从而被整合到噬菌体的基因组上，当该噬菌体再次感染受体细菌时，就使受体细菌获得了这一特定遗传性状的现象，称为局限性转导，它的转导频率为 10-6。,一、原核微生物的基因重组（三）接合（conjugation ）,通过供体细菌和受体细菌完整细胞间的直接接触而传
18、递大段DNA 的过程，称为接合（有时也称杂交）。 在细菌中，接合现象研究最清楚的是大肠杆菌。发现能够进行接合现象的大肠杆菌有雄性与雌性之分，而决定它们性别的是由是否存在 F 因子所决定。 F 因子又称致育因子，是一种质粒，分子量为 5107 道尔顿； 雌性细菌不含F 因子，称为F - 菌株， 雄性细菌含有游离存在的F 因子，称为F + 菌株， 当雄性细菌细胞中所含的F 因子被整合在细胞核的DNA 上，不呈游离状态存在称为Hfr 菌株（高频重组菌株）； 有时被整合在细胞核DNA 上的F 因子，从DNA上面脱落下来，呈游离存在，但在脱落时，F 因子有时能带一小段细胞核 DNA。我们将这种含有游离存
19、在的但又带有一小段细胞核DNA 的F 因子的细菌称为 F菌株。,一、原核微生物的基因重组（四）溶源性转变,宿主菌在感染温和噬菌体后，由于噬菌体DNA整合到核DNA后，导致宿主菌某些新的遗传性状表达，即所谓溶源性转变。这是一种与转导相似但又有本质不同的现象。溶源转变与转导在本质上的不同，首先是它的温和噬菌体不携带有任何供体菌的基因，其次这种噬菌体是正常的完整的，而不是异常情况下产生的缺陷型噬菌体。 溶源转变的典型例子是不产毒素的白喉棒状杆菌（Lorynebatcerium diphthariac）菌株被噬菌体侵染而发生溶源化时，会变成产毒素的致病菌株。其他如沙门氏菌、红霉菌、链霉菌等也具有溶源转
20、变的能力。,二、真核微生物的基因重组（一）有性杂交,在微生物的有性繁殖过程中，不同的性细胞间的接合，并随之发生染色体的重组，从而产生新遗传型后代的现象，称有性杂交。 凡是能产生有性孢子的酵母菌和霉菌，都能进行有性杂交。 有性杂交在生产实践中被广泛用于优良品种的培育。例如用于酒精发酵的酵母菌和用于面包发酵的酵母菌同属一种啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的两个不同菌株，面包酵母的特点是对麦芽糖及葡萄糖的发酵力强，产生 CO2 多，生长快；而酒精酵母的特点是产酒率高而对麦芽糖、葡萄糖的发酵力弱，所以酿酒厂生产酒精后的酵母，不能供面包厂作引子用。通过两者的杂交，就得到了既能
21、生产酒精，又能将其残余菌体用作面包厂和家用发面酵母的优良菌种。,二、真核微生物的基因重组（二）准性生殖,准性生殖是一种类似于有性生殖但比它更为原始的一种生殖方式。是由两个非异配型核的细胞接合后，形成异核体细胞，两核能发生低频率的接合与交换，产生具有新性状的个体。其主要过程包括以下基本过程： 1菌丝联结 发生在一些形态上没有区别的，但在遗传性状上可以有差别的两个同种亲本的体细胞（单倍体）间。 2形成异核体 两个单倍体细胞经联结后，使原有的两个单倍体核集中到同一个细胞中，形成双相的异核体。异核体能够独立生活。 3核融合 在异核体中的双核融合，产生双倍体杂合子核。核融合后产生杂合子核的频率也是极低的
22、，如构巢曲霉和米曲霉为 10-510 -7 。 4体细胞重组和单倍体化 双倍体的杂合子极不稳定，在进行有丝分裂过程中，极少数核中的染色体会发生染色体交换和单倍体化，从而形成了极个别的具有新遗传性状的单倍体杂合子。,第四节 微生物的菌种选育,在微生物工业应用中， 微生物菌种工作主要包括以下四方面： 菌种的分离筛选：挑选符合生产要求的菌种，这是选种工作的任务。 菌种培育： 改良已有菌种的生产性能，使产品的质和量不断提高，或使它更适应于工艺的要求，这是育种工作的任务。 菌种的保藏： 一切生产菌种都要使它避免死亡和生产性能的下降，这是菌种保藏工作的任务。 退化菌种的复壮： 如果发现菌种的生产性能下降，
23、就要设法使它恢复，这便是菌种复壮工作的任务。,一、从自然界中分离筛选菌种的方法步骤,（一）诱变育种的一般步骤和方法出发菌株同步培养 使菌细胞处于相同或接近的生理状态单细胞（或单孢子）菌悬液的制备 单细胞或单孢子的意义 酵母或霉菌孢子106 /ml 、细菌108 /ml 诱变剂的选择及其剂量的确定 以致死率为9099 为宜诱变处理 物理诱变剂 化学诱变剂,确定出发菌株 菌种的纯化选优 出发菌株的性能鉴定同步培养 制备单细胞（或单孢子）悬液 活菌浓度测定诱变剂的选择与确定诱变剂量的预试验 诱变处理 平板分离 计形态变异的菌落数，计算突变率挑取疑似突变菌落纯培养 突变体的初步筛选 用简单快捷的方法重
24、复筛选 摇瓶发酵试验选出突变体（根据情况进行生产试验或重复诱变处理）,二、微生物的诱变育种,二、微生物的诱变育种,（二）变异菌株的初步筛选,纸片培养显色法,透明圈法,琼脂块培养法,1 筛选用培养基 基本培养基：凡是能满足某种野生型菌株营养要求的最低成分的合成培养基，称为基本培养基；常以-表示； 在基本培养基中加入一些富含氨基酸、维生素及含氮碱基之类的天然有机物质如蛋白胨、酵母膏等，以满足该微生物的各种营养缺陷型菌株都能生长繁殖的培养基，称为完全培养基，常用+表示； 在基本培养基中只是有针对性地加入某一种或某几种营养缺陷成分，以满足相应的营养缺陷型生长的培养基，称为补充培养基，补充培养基可按所加
25、入营养成分相应地用A、B等来表示。,（三）营养缺陷型突变体的筛选及其应用,二、微生物的诱变育种,2营养缺陷型菌株筛选的一般方法 （1）诱变剂处理 （2）淘汰野生型菌株 抗生素法 菌丝过滤法（3）检出营养缺陷型 （4）鉴定营养缺陷型,检出营养缺陷型,鉴定营养缺陷型, 含营养缺陷型菌株的基本培养基平板的制备。 营养缺陷型营养类别的鉴定。 缺陷型菌株单一营养因素的鉴定。,原生质体融合育种,细胞（A+B） 细胞（AB+） 脱壁处理 脱壁处理 原生质体（A+B） 原生质体（AB+） 混合 加融合剂 原生质体融合 涂平板（原生质体再生） 形成菌落 检出重组子菌落（A+B+）,转基因工程菌株的构建,1提取目
26、的基因 用密度梯度离心方法分别从供体细胞中提取所需要的DNA即目的基因和作为载体的细菌质粒或噬菌体核酸，目的基因也可通过化学方法人工合成。 2处理目的基因 根据基因工程的“设计蓝图”的要求，在从供体细胞中提取出的目的基因中加入专一性很强的限制性核酸内切酶进行处理，从而获得带有特定基因并暴露出粘性末端的DNA单链部分。必要时这种粘性末端也可用人工方法合成。 对作为载体的细菌质粒或噬菌体DNA可采用与处理目的基因同一种类的限制性核酸内切酶进行处理，使其形成并暴露出与目的基因相应的粘性末端。 3体外重组 将上述分别处理过的目的基因和细菌质粒DNA片段（或噬菌体核酸）放在试管中，在较低温度（56）下混
27、合“退火”。由于这两种DNA是用同一种限制性核酸内切酶进行处理，具有相同的粘性末端，因此相互之间能够形成氢键，这就是所谓“退火”。而相邻的核苷酸，在DNA连接酶的作用下也能形成磷酸二酯键，这样就完成了目的基因与质粒DNA（或噬菌体DNA）的重组，得到的是一个完整的具有复制能力的环状DNA重组体，即“杂种质粒”（或杂种噬菌体）。 4载体传递 即通过载体将供体生物中的遗传基因导入到受体细胞内。载体必须具有自我复制的能力，一般可利用质粒的转化作用或噬菌体的转导作用，将供体基因带入受体细胞内。 5复制、表达 在理想情况下，进入受体细胞内的杂种质粒（或杂种噬菌体），可通过自我复制到扩增，并使受体细胞表达
28、出作为供体细胞所固有的部分遗传性状，成为“工程菌”。 6筛选、繁殖 当前，由于分离纯净的基因功能单位还很困难，所以通过重组后的“杂种质粒”的性状是否都符合原定的“设计蓝图”，以及它能否在受体细胞内正常增殖和表达等，都还需要经过仔细检查，以便能在大量个体中设法筛选出所需要性状的个体，然后才可加以繁殖和利用。,第五节 微生物菌种的保藏和复壮一、菌种的保藏,1低温保藏法 斜面菌种直接放入04冰箱中保藏，保存时间不宜过长，一般为 36个月； 用-20以下的超低温冰箱或干冰、液氮（-195）冻结保藏，长达数年。 2干燥保藏法 主要是指把菌种接种到适当载体上，在干燥条件下进行保藏。这种保藏方法主要适合于细菌的芽胞和霉菌的孢子。细菌芽胞用沙土管保藏；霉菌的孢子多用麸皮管保藏。 3隔绝空气保藏法 用固体石蜡密封试管口以隔绝空气， 4真空冷冻干燥保藏法 其基本过程是：培养菌种加菌种保护剂（一般食品工业用菌种多用牛乳作保护剂）分装、预冻真空冻干真空封口。 5寄主保藏法 用常规方法保藏的动植物病原菌和病毒。,第五节 微生物菌种的保藏和复壮二、菌种的退化与复壮,（一）常见的菌种退化现象（二）菌种退化的原因 菌种退化的主要原因是有关基因的负突变。 （三）防止菌种退化的措施 1控制传代次数 2创造良好的培养条件 3利用不同类型的细胞进行移种传代 4采用有效的菌种保藏方法 （四）退化菌种的复壮,
