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1、分 类 号：S512.1 单位代码：10183研究生学号： 2008861008 密 级：公开 吉 林 大 学博士学位论文 小-大麦2H染色体重组材料创制及外源基因在小麦背景中表达研究Development of wheat-barley chromosome 2H recombination lines and research on expression of alien genes in wheat background 作者姓名： 邹宏达专 业： 植物学研究方向： 植物种质资源与利用指导教师： 原亚萍 教授培养单位： 植物科学学院2012年12月III小-大麦2H染色体重组材料创制及外
2、源基因在小麦背景中表达研究 Development of wheat-barley chromosome 2H recombination lines and research on expression of alien genes in wheat background 作者姓名：邹宏达专业名称：植物学指导教师：原亚萍 教授学位类别：理学博士论文答辩日期： 年 月 日授予学位日期： 年 月 日答辩委员会主席：论 文 评 阅 人：本研究由国家自然科学基金项目(30571152)资助This research was supported by the National Basic Resear
3、ch of China (NO.30571152).未经本论文作者的书面授权，依法收存和保管本论文书面版本、电子版本的任何单位和个人，均不得对本论文的全部或部分内容进行任何形式的复制、修改、发行、出租、改编等有碍作者著作权的商业性使用（但纯学术性使用不在此限）。否则，应承担侵权的法律责任。吉林大学博士学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交学位论文，是本人在指导教师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。
4、学位论文作者签名：日期： 年 月 日中国优秀博硕士学位论文全文数据库投稿声明研究生院：本人同意中国优秀博硕士学位论文全文数据库出版章程的内容，愿意将本人的学位论文委托研究生院向中国学术期刊（光盘版）电子杂志社的中国优秀博硕士学位论文全文数据库投稿，希望中国优秀博硕士学位论文全文数据库给予出版，并同意在中国博硕士学位论文评价数据库和CNKI系列数据库中使用，同意按章程规定享受相关权益。 论文级别：硕士 博士 学科专业：植物学论文题目：小-大麦2H染色体重组材料创制及外源基因在小麦背景中表达研究作者签名： 指导教师签名： 年 月 日 作者联系地址（邮编）： 作者联系电话：摘 要小-大麦2H染色体重
5、组材料创制及外源基因在小麦背景中表达研究小麦（Triticum aestivum L.，2n = 6 = 42）和大麦（Hordeum vulgare L.，2n = 2 = 14)是世界上两大重要的麦类作物，通过小麦和大麦的远缘杂交，可以将大麦的优良基因及其相应性状导入小麦，如早熟、耐生物和非生物胁迫及各种品质性状。小麦成熟期穗发芽是一种世界性自然灾害，穗发芽时小麦-淀粉酶活性提高，对胚乳中淀粉分解能力增强，不仅影响小麦产量，而且还会影响小麦的营养品质和加工品质。位于大麦2H染色体长臂上的Isa基因所编码的大麦-淀粉酶抑制蛋白BASI（bifunctional -amylase/subtil
6、isin inhibitor），可以通过与小麦-淀粉酶相结合而抑制其活性，从而降低小麦穗发芽的危害，提升小麦品质。本研究通过郑麦9023，CB037，中麦16等小麦品种与小-大麦2H染色体异代换系2H(2A)及2H(2B)的杂种幼胚组织培养，经愈伤组织诱导、继代、分化的途径最终获得522株结实的SC1代再生植株。以大麦Betzes、小麦CS、小-大麦2H染色体异附加系、一整套小-大麦2H染色体异代换系2H(2A)、2H(2B)和2H(2D)为材料共筛选出10对分别位大麦2H染色体短臂和长臂的大麦2H染色体特异SSR分子标记。通过大麦第二部分同源群特异SSR分子标记，对组培SC1代再生植株及其自
7、交后代SC2-5代植株进行逐代筛选，以追踪和鉴定大麦2H染色体。通过以大麦Betzes基因组DNA为探针、小麦CS基因组DNA为封阻的基因组原位杂交对部分SC4及SC5植株进行进一步验证，最终获得了携带有大麦2HL染色体的杂合易位、纯合易位、单端体、双端体及单等臂体遗传材料。经大麦Isa基因特异引物进行PCR验证，以上这些材料均携带Isa基因。对小-大麦2HL染色体杂合易位系32-4-9，32-4-18及纯合易位系32-4-11花粉母细胞减数分裂I中期的染色体构型进行检测，表明杂合易位系和纯合易位系染色体配对正常，细胞学上遗传稳定。在将外源种质转移至小麦遗传背景的过程中，会引起小麦基因组结构及
8、基因表达的广泛遗传变异。为了了解由大麦2H染色体导入而引起的小麦基因组结构的变异，采用荧光AFLP对大麦Betzes，小麦CS, 小-大麦2H异附加系，小-大麦2H异代换系2H(2A)、2H(2B)、2H(2D)这一整套材料进行分析。64对引物组合在大麦中获得了3157个条带，在其它材料中获得了4736个条带。AFLP扩增类型表明，附加系中检测到了消减和激活位点，而代换系基因组结构几乎无变化。同时还检测到了多条大麦2H染色体及小麦2A、2B、2D染色体特异的AFLP片段，经回收测序后，将AFLP分子标记转换成STS分子标记并进行验证，共获得2条大麦2H染色体特异的AFLP-STS分子标记，小麦
9、2A、2B、2D染色体特异的AFLP-STS分子标记各1条。为了了解由大麦2H染色体导入而引起的小麦基因组的表观遗传学变异，在荧光AFLP检测的基础上构建了荧光MSAP检测体系，对大麦Betzes，小麦CS, 小-大麦2H异附加系，小-大麦2H异代换系2H(2A)、2H(2B)、2H(2D)这一整套材料的基因组甲基化模式进行分析。MSAP结果表明，大麦2H染色体导入引起了小麦基因组的甲基化变异，同时大麦2H染色体本身也检测到了甲基化的升高。为了了解由大麦2H染色体导入所引起的基因表达差异，通过荧光cDNA-AFLP对大麦Betzes，小麦CS, 小-大麦2H异附加系，小-大麦2H异代换系2H(
10、2A)、2H(2B)、2H(2D)这一整套材料进行了基因表达差异分析，分离和克隆了大量差异表达基因，并初步确定了大麦2H染色体在小麦基因背景中的表达模式。通过iTRAQ技术来了解由大麦2H染色体导入所引起的蛋白表达差异，尝试对以上材料进行差异蛋白质组学分析，目前为止，共鉴定出589个蛋白。关键词：小麦，大麦，2H染色体，易位系，分子标记，基因表达AbstractDevelopment of wheat-barley chromosome 2H recombination lines and research on expression patterns of alien genes in wh
11、eat genetic backgroundWheat (Triticum aestivum L., 2n = 6 = 42) and barley (Hordeum vulgare L., 2n = 2 = 14) are two of the most important cereal crops worldwide. The hybridization of wheat and barley makes it possible to transfer desirable genes and traits, such as earliness, tolerance to biotic an
12、d abiotic stresses, and various nutritional parameters, from barley to wheat.The wheat pre-harvest sprouting is a worldwide natural disaster. In the course of high activity of -amylase, pre-harvest sprouting can not only result in a great decrease in wheat yield, but also dramatically degrade the nu
13、tritional and processing quality of the seeds. The bifunctional -amylase/subtilisin inhibitor (BASI) encoded by the Isa gene on barley chromosome 2HL could inhibit wheat -amylase activity by reducing pre-harvest sprouting and improving the quality of wheat. Regenerated plants were derived from immat
14、ure embryo culture of hybrids of common wheat varieties Zhengmai 9023, CB037 and Zhongmai 16 with the wheat-barley 2H alien substituion lines 2H(2A) and 2H(2B) after callus induction, subculture and differentiation. 10 SSR molecular markers specific to barley chromosome 2H located on short arm and l
15、ong arm were selected from barley Betzes, wheat CS, wheat-barley 2H addition line, wheat-barley 2H substitution line 2H(A), 2H(2B) and 2H(2D). The presence of barley 2H chromatin was detected in regenerated plants (SC1) and their selfed progenies (SC2-5) using homoeologous group 2 SSR markers from b
16、arley, and further identified in selected SC4 and SC5 lines using genomic in situ hybridization with barley genomic DNA as probe and CS genomic DNA for blocking. The Isa gene from the identified SC4 and SC5 lines was also amplified using Isa specific primers. We identified wheat-barley 2HL chromosom
17、e heterozygous translocation lines, a homozygous translocation lines, monotelosomic lines, ditelosomic lines, and an isochromosome line carring the Isa gene. Metaphase I pairing of line 32-4-9, line 32-4-18, line 32-4-11 indicated that both the wheat-barley 2HL chromosome heterozygous translocation
18、line and homozygous translocation line should regularly disjoin and be stable in cytology.During the process of alien germplasm introduced into wheat genetic backgroud, extensive genetic variations of genome structure and gene expression could be induced in wheat. To understand genetic changes assoc
19、iated with introduction of barely chromosome 2H into wheat genome, a set of barley Betzes, wheat CS, wheat-barley 2H addition line, wheat-barley 2H substitution line 2H(A), 2H(2B) and 2H(2D) were analyzed by fluorescence AFLP. Using 64 primer combinations, 3157 bands were obtained in barley and 4736
20、 bands in other materials. AFLP amplification patterns indicated that elimination bands and novel bands were detected in addition line, but on genome variation were dectected in substitution lines. Several AFLP bands specific to chromosome 2H, 2A, 2B, 2D were recoveried and sequenced respectively, f
21、or STS primers design. Finally, 2 AFLP-STS molecular markers specific to barley chromosome 2H and 1 AFLP-STS molecular markers specific to each one of wheat chromosome 2A, 2B, 2D were established.To understand epigenetic variations associated with introduction of barely chromosome 2H into wheat geno
22、me, fluorescence MSAP detection system was constructed based on fluorescence AFLP, for the methylation patterns detection of a set of barley Betzes, wheat CS, wheat-barley 2H addition line, wheat-barley 2H substitution line 2H(A), 2H(2B) and 2H(2D) . The results that methylation variations were dete
23、cted in wheat and the methylation extent increased in barley chromosome 2H.To understand gene expression characteristics associated with introduction of barely chromosome 2H, we used the fluorescence cDNA-AFLP to analyse the different expression of a set of barley Betzes, wheat CS, wheat-barley 2H a
24、ddition line, wheat-barley 2H substitution line 2H(A), 2H(2B) and 2H(2D) . A large number of differentially expressed genes were isolated and express patterns of barley 2H chromosome were confirmed In order to understand the protein expression differences associated with introduction of barely chrom
25、osome 2H, iTRAQ technology was used for differential proteomics analysis for above materials, and a total of 589 proteins were identified.Key words: Wheat, Barley, chromosome 2H, translocation line, molecular markers, gene expression目 录英文缩写词I第1章 文献综述11.1 小麦穗发芽11.1.1 小麦穗发芽的危害11.1.2 影响小麦穗发芽的因素21.2 大麦-
26、淀粉酶抑制蛋白51.2.1 大麦-淀粉酶抑制蛋白结构特点和功能51.2.2 大麦-淀粉酶抑制蛋白的时空表达及影响因素51.2.3 大麦-淀粉酶抑制蛋白的作用机制61.2.4 大麦-淀粉酶抑制蛋白的应用前景71.3 大麦有益基因向普通小麦的导入71.4 小麦背景中大麦染色体的鉴定121.4.1 基因组水平121.4.2 表观遗传学水平151.4.3 转录水平171.4.4 蛋白质水平191.5 研究目的和意义22第2章 小-大麦2H染色体重组材料创制与鉴定232.1 实验材料232.2 实验方法232.2.1 杂交组合配制232.2.2 幼胚组织培养232.2.3 基因组DNA提取、纯化与浓度测
27、定（小量提取）242.2.4 SSR分子标记252.2.5 基因组原位杂交292.2.6 Isa基因特异分子标记332.2.7 花粉母细胞染色体构型332.3 结果与分析342.3.1 小-大麦重组材料创制342.3.2 大麦2H染色体特异SSR分子标记342.3.3 SSR分子标记鉴定筛选筛选重组材料352.3.4 基因组原位杂交382.3.5 Isa基因特异分子标记分析402.3.6 花粉母细胞减数分裂I中期染色体构型分析402.3.7 易位系农艺性状412.4 讨论422.4.1 组织培养与易位系选育422.4.2 SSR分子标记和基因组原位杂交相结合鉴定筛选易位系432.4.3 小-大
28、麦易位系的利用价值44第3章 小麦遗传背景中大麦2H染色体基因组结构分析453.1 实验材料453.2 实验方法453.2.1 基因组DNA提取、纯化与浓度测定（大量提取）453.2.2 AFLP分析（荧光标记检测）463.2.3 AFLP分析（银染检测）503.2.4 差异片段回收、克隆523.2.5 差异片段序列分析及同源性比较573.2.6 AFLP-STS分子标记的设计与验证573.3 结果与分析583.3.1 AFLP荧光检测583.3.2 AFLP银染检测603.3.3 AFLP扩增类型613.3.4 AFLP-STS分子标记的设计和验证633.4 讨论653.4.1 AFLP荧光
29、检测同AFLP银染检测比较653.4.2 大麦2H染色体导入小麦背景中后的基因组结构变异663.4.3 AFLP分子标记转化STS分子标记68第4章 小麦遗传背景中大麦2H染色体基因组甲基化分析754.1 实验材料754.2 实验方法754.2.1 基因组DNA提取、纯化与浓度测定（大量提取）754.2.2 MSAP分析（荧光标记检测）754.2.3 MSAP分析（非荧光标记检测）784.2.4 差异片段回收、克隆804.2.5 差异片段序列分析及同源性比较804.3 结果与分析804.3.1 MSAP荧光检测804.3.2 MSAP扩增类型824.3.3 MSAP差异片段回收、测序与同源性分
30、析844.4 讨论86第5章 小麦遗传背景中大麦2H染色体基因组表达分析915.1 实验材料915.2 实验方法915.2.1 实验材料处理915.2.2 总RNA提取915.2.3 cDNA第一链合成925.2.4 cDNA第二条链的合成935.2.5 cDNA第二条链的纯化935.2.6 cDNA-AFLP荧光检测945.2.7 差异片段序列分析及同源性比较945.3 结果与分析955.3.1 cDNA-AFLP荧光检测955.3.2 cDNA-AFLP差异片段回收与测序985.4 讨论100第6章 小麦遗传背景中大麦2H染色体蛋白质组分析1156.1 实验材料1156.2 实验方法115
31、6.2.1 品质测定1156.2.2 籽粒胚乳超微结构观察1156.2.3 2D-PAGE分析1156.2.4 iTRAQ分析1206.3 结果与讨论1236.3.1 品质测定1236.3.2 籽粒胚乳超微结构观察1236.3.3 籽粒种子总蛋白双向电泳分析1246.3.4 籽粒总蛋白iTRAQ分析126第7章 结论131参考文献133攻读学位期间发表的学术论文151致 谢153英文缩写词英文缩写英文全称中文全称及注释ABAAFLPAmpAbscisic acidAmplified fragment length polymorphismAminobenzyl penicillin脱落酸扩增片
32、段长度多态性氨苄青霉素BASIBLASTBarley -amylase/subtilisin inhibitorBasic Local Alignment Search Tool大麦-淀粉酶抑制蛋白基本局部比对搜索工具DDTEBDithiothreitoEthidium bromide二硫苏糖醇溴化乙锭EDTAEthylenediamine tetraacetic acid乙二胺四乙酸ELISAGAEnzyme linked immunoserbent assyGibberellin酶联免疫吸附赤霉素IPTGIsopropyl -D-thiogalactoside异丙基硫代半乳糖苷LMLate
33、r mature -amylase迟熟-淀粉酶MSAPMethylation sensitive amplification甲基化敏感扩增多态性PAGEPolyacrylamide Gel Electrophoresis聚丙烯酰胺凝胶电泳PHSPre-harvest Sprouting穗发芽PMSFPhenylmethanesulfonyl fluoride苯甲基磺酰氟PVPPCrossl inking polyvinylpyrrolidone交联聚乙烯吡咯烷酮PCRPolymerase chain reaction聚合酶链式反应SDSSodium dodecyl sulfate十二烷基磺酸钠
34、SNPsSingle nucleotide polymorphisms单核苷酸多态性SSRSimple Sequence Repeat简单重复序列STSSequence tagged site序列标签位点TCATDFTEABTrichloroacetic acidTranscripit derived fragmentTriethylammonium bicarbonate三氯乙酸转录衍生片段三乙基碳酸氢铵I第1章 文献综述第1章 文献综述穗发芽是一种世界范围的自然灾害，包括小麦、大麦、黑麦、小黑麦、玉米、水稻和高粱等在内的诸多谷物均会受其影响。穗发芽（Pre-harvest Sproutin
35、g，简称PHS），通常是指谷物临近收获期时，由于持续降雨而处在高湿度环境下所导致的谷物籽粒在穗上萌动乃至发芽的现象 原亚萍，陈孝，肖世和. 小麦穗发芽的研究进展J. 麦类作物学报，2003, 23(3):136-139.。谷物穗发芽的明显表征与谷物籽粒正常萌发类似，表现为籽粒肿胀，胚变色，种皮开裂，根、芽露出等。穗发芽不仅会降低谷物的产量，还会严重影响到谷物品质、加工品质、储存质量及播种质量等 Buonocore V, Petrucci T, Silano V. Wheat protein inhibitors of a-amylaseJ. Phytochemistry, 1977, 16:8
36、11-820., Orton T J. Chromosomal variability in tissue cultures and regenerated plants of HordeumJ. Theoretical and Applied Genetics, 56:101-112.，给农民、种子经营者、谷物加工等相关从业人员和相关行业带来严重的经济损失和不便。随着穗发芽危害程度的增加，逐渐引起了国内外众多研究学者的重视与关注，自1975年举办了第一届国际谷物穗发芽研讨会（International Symposium on Pre-Harvest Sprouting in Cereals
37、）以来，截止至2011年8月，已经举办了12次国际会议来交流穗发芽研究进展并商议、探讨如何解决并降低穗发芽所带来的损失。1.1 小麦穗发芽1.1.1 小麦穗发芽的危害小麦穗发芽危害在世界范围内于小麦收获季节易降雨地区十分的普遍。据报道，几个主要的小麦生产区域，如南北美洲地区的美国、加拿大、巴西，澳洲的澳大利亚、新西兰，亚洲的印度、日本等国的部分地区及欧洲全境，尤其是英国、瑞典、波兰等国均有发生 肖世和，闫长生，张海萍，孙果忠. 小麦穗发芽研究M. 北京：中国农业科学技术出版社，2004.。据美国农业部网站发表的软质冬小麦品质的遗传和生化 (Genetic and biochemical bas
38、is of soft winter wheat quality) 基础项目的会议摘要显示，全世界范围内，每10年中有3-4年均会发生不同程度的小麦穗发芽危害，并且仍会持续发生 Meera K. Management of Pre-harvest Sprout Damage in Wheat and Improvement of Soft Wheat Quality in US EB/OL. http:/www.ars.usda.gov/research/publications/publications.htm?seq_no_115=261927.。在穗发芽比较严重的小麦出口大国加拿大，包括部
39、分地区穗发芽率高达80% 的1989年在内 Derera NF. Preharvest field sprouting in cerealsM. 1989, CRC Press, Boca Raton.，平均每年由小麦穗发芽所造成的各项经济损失高达1亿美元 Depauw R M, Knox R E, Singh A K, Fox S L, Humphreys D G, Hucl P. Developing standardized methods for breeding preharvest sprouting resistant wheat, challenges and successe
40、s in Canadian wheatJ. Euphytica, 2012, DOI: 10.1007/s10681-011-0611-y.。在我国，东北春麦区、西北春麦区、黄淮冬麦区、北部冬麦区、长江中下游地区以及西南冬麦区这几个小麦主要产区，在不同地区、不同年份，均有不同程度的小麦穗发芽危害发生，其中东北春麦区、西南冬麦区和长江中下游地区为穗发芽常发地区，但由于穗发芽的出现并无规律且难以预测，所以过去我国对穗发芽的危害鲜有报道4。据报道1987年收麦季节的连续阴雨，导致黄淮麦区的陕西关中发生严重的穗发芽 张海峰，卢荣禾. 小麦穗发芽抗性机理与遗传研究J. 作物学报, 1993, 19(6)
41、:523-530.。1998年总后嫩江农场达30万亩小麦全部发生穗发芽，造成了严重损失 原亚萍. 大麦2H染色体上的-淀粉酶抑制蛋白基因Isa-H1向普通小麦的导入、鉴定及表达D. 北京：中国农业科学院研究生院，2001.。2009年上旬，由于江苏淮北及苏中地区麦收季节遭遇连续阴雨，当地的白皮小麦均发生了不同程度的穗发芽10 周凤明，解晓林，陈春，张晓慧，吕玉亮，王子明. 穗上发芽对小麦种子发芽率的影响J. 江苏农业科学，2010, 4:69-70.。2008-2009年，我国北部麦区以及湖北、河南、江苏、安徽、山东等多个省份种植的小麦均发生了不同程度的穗发芽 麦S. 想给小麦种子管理部门一点
42、建议-关于小麦穗发芽EB/OL. , 唐建明. 穗上发芽严重影响小麦生产EB/OL. 。本文作者自2007年于小麦实验田（吉林省长春市吉林大学农学部植物科学学院网室）种植和筛选抗穗发芽的小-大麦2H染色体重组材料以来，连续几年的小麦收获季（大约在每年的7月中旬）均有大量降水，小-大麦2H染色体重组材料的农艺亲本郑麦9023、CB037及其它穗发芽敏感的遗传材料均发生了不同程度的穗发芽，两个农艺亲本，均为白皮，穗发芽敏感的品种，其穗发芽情况见图1。图1.1 小麦穗发芽Figure 1.1 Wheat pre-harvest sprouting小麦品种郑麦9023；小麦品种CB037；摄于2010
43、年7月18日小麦穗发芽可以引起小麦籽粒的一系列生理变化，由于水解酶的活性增强和植物激素的含量的变化，籽粒的总蛋白、贮存物质和氨基酸的组成都会发生剧烈变化，从而会急剧降低小麦产量，而且还会显著影响小麦的营养品质和加工品质 Jiang G L, Xiao S. Factorial cross analysis of pre-harvest sprouting resistance in white wheatJ. Field Crop Research, 2005, 91:63-69.。穗发芽的小麦容重降低（淀粉水解），面筋含量和沉降值急剧下降（蛋白质结构发生变化），制粉率低，面团粘度高（蛋白质、
44、淀粉水解），对面包烘焙和面条制作品质有着很大的影响，通常只能作为动物饲料而大大降低了小麦的经济价值 Morad M M, Rubenthaler G L. Germination of soft white wheat and its effect on flour fractions, breadbaking, and crumb firmnessJ. Cereal Chemistry, 60:413-417., Groos C, Gay G, Perretant MR, Gervais L, Bernard M, Dedryver F, Charmet. Study of the rela
45、tionship between preharvest sprouting and grain color by quantitative trait loci analysis in a white red grain bread-wheat cross. Theoretical and Applied Genetics, 2002, 104:39-47.。1.1.2 影响小麦穗发芽的因素小麦穗发芽是一个由多基因控制的复杂性状，并且很大程度上受外部环境影响 何震天，陈秀兰，韩月澎. 白皮小麦抗穗发芽研究概况J.种子, 2000, 2:36-38.。影响小麦穗发芽的因素主要通过影响小麦籽粒对水份的吸收，籽粒的干燥程度，籽粒的休眠程度，以及籽粒萌发时物质的转换来实现小麦穗发芽这个特殊的生理过程。现在普遍认为小麦成熟籽粒的休眠水平是小麦穗发芽的最大决定因素 Mares D J. Preservation of dormancy in freshly harvested wheat grainJ. Austrialian Jouranl of Agricultural research, 1983, 34:33-38.。1) 环境外部环境条件在小麦籽粒成熟前、后均对小麦
