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1、1,一、基因诊断的概念和特点,二、基因诊断的主要技术方法,三、常见的基因异常及其检测,四、疾病的基因诊断(自习),五、基因诊断在法医学上的应用,第一节 基因诊断 (gene diagnosis),03:40:08,2,基因诊断通常是指利用分子生物学的方法技术，直接检测体内DNA的结构变异或RNA的水平变化，从而对疾病作出诊断的方法。,一 、基因诊断的概念和特点,（一）概念,适用于遗传性疾病、感染性疾病、肿瘤等多种疾病的诊断，以及个体识别和亲子鉴定等法病学领域。,03:40:08,3,（二）特点-以已知基因作为检测对象,（l）特异性强：直接检测导致疾病发生的基因变化；,（2）灵敏度高：所采用的分
2、子杂交和聚合酶链反应 等技术都具有信号放大作用；,（3）取样便利：一般不受组织或时相的限制；,（4）早期诊断：易在疾病尚无临床表现时作出诊断；,（5）应用广泛：可检测自体基因和外源基因。,03:40:08,一 、基因诊断的概念和特点,(一)核酸分子杂交（NA hybridization）,(二)聚合酶链式反应（PCR）技术,(三)单链构象多态性分析（SSCP）,(四)DNA分子多态性（DNA polymorphism）分析,(五)限制性片段长度多态性（RFLP）分析,(六)显微切割（microdissection）技术,4,(七)DNA序列测定（DNA sequencing）,二、基因诊断的主
3、要技术方法,4,03:40:08,5,(一)核酸分子杂交,4.DNA 芯片(DNA chip)技术,Southern/DNA印迹、Northern/RNA印迹 (第七/六章)和Western/蛋白质印迹(第九/二章),其他杂交方法:,1.斑点印迹(dot blotting)与狭缝杂交,2. 组织原位杂交(tissure in situ hybridization ),3. 等位基因特异性寡核苷酸杂交 (allele-specific oligonucleotide hybridization, ASOH),03:40:08,二、基因诊断的主要技术方法,6,1.斑点印迹(dot blotting
4、)杂交,将核酸(DNA或RNA)样品点在NC膜上，变性后与标记探针结合，显影或显色，密度测量，与对照品比较确定所测核酸量的高低。,方法：,应用：,主要用于检测细胞基因拷贝数的变化或者mRNA含量的变化。,便于大规模检测和筛选；容易出现假阳性。,特点：,6,03:40:08,Slot-blot结果,GS-670型光密度扫描仪(Bio-Rad),8,2.组织原位杂交(tissure in situ hybridization ),组织或细胞 (新鲜组织切片、细胞涂片或石蜡切片)样品做适当处理(如固定剂固定、蛋白酶消化)，使其通透性增大，标记探针进入细胞内与核酸杂交。,方法：,应用：,被检测基因或m
5、RNA在细胞内的检测及定位。,特点：,不需提取被检核酸，可确定被检核酸细胞内定位。,1986创建的荧光原位杂交(FISH) 用于特定基因的定位及其缺失、扩增或重排的检测。,8,03:40:08,9,03:40:08,10,原癌基因ERBB-2(Her-2)，基因扩增荧光原位杂交检测,03:40:08,荧光原位杂交,2022年12月20日3时40分,11,12,3.等位基因特异性寡核苷酸杂交(ASOH),根据已知基因突变位点的碱基序列，设计和制备与野生型或突变型基因序列片段互补的两种探针，分别与被检DNA进行杂交，确定基因突变存在与否，分辨纯/杂合子。,方法：,应用：,基因结构变异所致疾病的诊断
6、。,特点：,杂交条件要求严格，以避免出现假阳性或假阴性。,03:40:08,13,N：正常基因；H：杂合子基因；M：突变基因,ASO1,ASO2,N,H,M,ASOH示意图,03:40:08,14,4. DNA 芯片(DNA chip)技术,DNA点阵 (DNA array)把多种已知序列的DNA片段排列在固体支持物上，同时对样品中的多种核酸进行检测和分析。,方法：,应用：,单核苷酸多态性(SNP)、基因表达谱和遗传性疾病的分析；病原微生物的大规模检测。,DNA微阵列 (DNA microarray)通过计算机控制点样和图像扫描的高密度集成探针的杂交技术。,03:40:08,15,(二)PCR
7、 技术 (第七/七章),1. PCR技术的原理,以DNA分子为模板，加入与拟扩增DNA片段两端分别互补的一对寡核苷酸链作为引物，在 DNA聚合酶的催化下，按照半保留复制的形式分别合成两股新的DNA互补链，可使两引物间的DNA片段拷贝数增加一倍。,多次重复这一过程，可使这段 DNA拷贝数随复制次数以指数形式扩增。,03:40:08,二、基因诊断的主要技术方法,16,2. 基因诊断中常用的PCR及其衍生技术,(1) DNA的微量分析,总RNA(或mRNA) ss-cDNA ds-cDNA PCR扩增,PCR法灵敏度高，对模板DNA纯度要求不高，且样品用量极微(如一滴血、一根头发等)。,(2) RT
8、-PCR(reverse transcriptional-PCR),03:40:08,17,(3)巢式-PCR(nested PCR),用2对引物(外引物、内引物)扩增，大大提高了扩增的特异性,(4) 不对称PCR(asymmetric PCR ),2个引物浓度不等，一般采用50:1或100:1 的摩尔比，主要获取单链DNA作构象分析或用作探针。,17,03:40:08,18,(5)多重PCR(multiplex PCR),在同反应体系中加入多对引物，同时扩增同一 DNA样品中的多个不同序列区域，且每对引物所扩增的产物长度都不同，可根据电泳结果判断是否存在某些基因片段的缺失或长度改变。,(6)
9、等位基因特异性PCR(AS-PCR),针对等位基因的序列差异区域设计引物，使引物的 3端与等位基因序列的差异碱基对应，仅能与突变型或野生型互补。,18,03:40:08,19,(7)原位PCR (in situ PCR,IS-PCR) 技术,1)细胞和组织经固定剂固定、蛋白酶消化，使细胞获得适度的通透性，既利于 PCR反应试剂到达靶位，又可防止扩增产物从细胞内漏出；,2)把载玻片的靶DNA进行常规PCR(病毒RNA的扩增用RT-PCR);,3)最后通过间接法(原位杂交)或直接法(PRC过程中加入标记)检测扩增产物。,03:40:08,20,（8）实时荧光定量PCR,PCR扩增时，Taq酶的5-
10、 3外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而使荧光监测系统可接收到荧光信号； 每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。,03:40:08,21,(三) 单链构象多态性分析,利用单个或多个碱基不同、但序列长度相等的双链核酸分子，经变性成单链后可具有不同的构象而在中性PAGE电泳中的迁移率不同；,(single strand comformation polymorphism, SSCP),21,03:40:08,与正常的电泳图型对照，出现新条带即可判定存在碱基变异。,二、基因诊断的主要技术方法,22,与PCR联用称为PCR-
11、SSCP；广泛用于大批样品基因突变的检测(初筛)。,03:40:08,23,1.限制性片段长度多态性的检测,3.单核苷酸多态性,2.数目可变的串联重复序列多态性的检测,(四)DNA分子多态性 (DNA polymorphism )分析,(single nucleotide polymorphism, SNP ),(variable number of tandem repeats, VNTR),(restriction fragment length polymorphism, RFLP ),23,03:40:08,二、基因诊断的主要技术方法,24,VNTR的重复序列出现次数在6次100次之间
12、；,小卫星DNA(minisatellite DNA):重复单元长度为670bp；,微卫星DNA(microsatellite DNA ):重复单元长度为16bp。,短串联重复DNA(short tandem repeat DNA,STR DNA):重复单元长度为26bp。,根据重复单元长度可分为：,24,03:40:08,25,不同个体间重复单元 如(CA)n/(TG)n的拷贝数 (即出现的频率) 不同，因而产生多态性，称为VNTR多态性。,VNTR多态性：,限制酶识别位点 限制酶识别位点,25,03:40:08,26,(五) 限制酶谱分析,当某种限制酶的切点改变时(由点突变、单个碱基的插入
13、或缺失引起)，用该种限制酶切割后得到的DNA片段的大小和数目都随之发生变化，通过电泳分析即可作出判断。,PCR-RFLP,设计适当的扩增引物，使扩增片段包括某一个或数个限制性内切酶识别序列，在 PCR扩增后用该限制酶切割 PCR产物，根据电泳后酶切片段长度变化，即可作出诊断。,26,03:40:08,二、基因诊断的主要技术方法,27,-GAATTC-CTTAAG-,EcoR 限制性内切酶位点的变化,03:40:08,28,(六)显微切割(microdissection)技术,是应用激光捕获显微镜，在高倍镜下选择几个甚至一个细胞进行分析；可用于石蜡包埋组织进行回顾性诊断。,2.染色体的显微切割。
14、,1.组织细胞的显微切割,是切割分裂中期的染色体的目的区域，如某些断裂或易位、倒位位点的染色体片段，再进行后续分析。,28,03:40:08,二、基因诊断的主要技术方法,29,瑞士 MII CellCut 全自动激光显微切割（荧光）系统 可通过紫外激光切割需要分离的组织，然后通过有黏性的Eppendorff管盖进行收集，这样就可以将特定类型的细胞从组织切片上分离下来。,03:40:08,30,可以准确、快速、无损伤地分离出纯净的特定细胞或组织，保持细胞内生物分子的完整性，以便用于后续的DNA、RNA和蛋白质分析。 配有近红外激光(波长810nm)；紫外激光(波长349nm)；红色、绿色、蓝色三
15、种荧光滤光片。,美国Arcturus公司的Veritas激光捕获显微分离仪,03:40:08,PICSAltraII流式细胞仪(分析分选),31,03:40:08,32,(七)DNA序列测定,该法是基因诊断所有的技术方法中最准确最可靠的种。缺点：费时、费力、费用高。,32,03:40:08,二、基因诊断的主要技术方法,33,(一)点突变的检测,三、常见的基因异常及其检测,(二)大片段核苷酸丢失或插入的检测,(三)基因重排的检测,(四)基因扩增的检测,(五)DNA多态性的检测,(六)基因表达异常的检测,(七)病原体基因的检测,33,03:40:08,34,(一)点突变的检测,狭义的点突变指碱基替
16、代，分为单点突变和多点突变；广义的点突变还包括少数核苷酸的缺失或插入。,1.已知点突变的检测,突变位点已被阐明的遗传病，可采用PCR等位基因特异性寡核苷酸杂交(PCR/AS0H)检测。,34,03:40:08,三、常见的基因异常及其检测,35,PCR/AS0H 检测:,(1)根据突变点上下游的序列设计合成引物，PCR 扩增出突变区的DNA片段。,(2) 将PCR产物用斑点或狭缝点样器点在尼龙膜上，以紫外线照射固定。,(3) 针对上述每种突变位点，分别合成 2个寡核苷酸探针；其中一个具有正常的碱基序列，另一个则具有突变的碱基序列。,(4)分别预杂交、杂交、洗膜、放射自显影或显色。,(5) 分析正
17、常探针及突变探针分别杂交得到的显影或显色图谱，即可作出基因诊断,03:40:08,36,N：正常基因；H：杂合子基因；M：突变基因,ASO1,ASO2,N,H,M,(PCR/AS0H 检测示意图),03:40:08,37,2.未知点突变的检测,初筛：PCR-SSCP分析法,确认：DNA sequencing。,03:40:08,38,PCR-SSCP: 广泛用于大批样品基因突变的检测(初筛)。,03:40:08,39,3. 少数核苷酸缺失或插入的检测,可供选择的方法：PCR-RFLP分析、AS-PCR、PCR-SSCP及DNA测序等,03:40:08,镰形细胞贫血,原因：-珠蛋白链第 6位密码
18、子GAGGTG，造 成GluVal所致。方法：设计一对引物PCR扩增可得294bp，Oxa NI 消化，电泳。,bp,结果：,40,03:40:08,41,(二) 大片段核苷酸丢失或插入的检测,1. 中等长度 (0.5-1.5kb) 的DNA片段缺失或插入，可用一对引物的普通PCR检测。,03:40:08,2. 若基因较大度 (大于1.5kb) ，且多个位点 存在插入或缺失、位点间距离较远，宜采用多重PCR法检测。,（多重PCR的引物设计示意图）,三、常见的基因异常及其检测,42,DMD基因定位于人类 X染色体短臂 Xp21.2上。位于该区的dystrophin(肌营养不良蛋白)基因的突变或部
19、分缺失，是导致DMD的原发病因。,dystrophin基因中有9个易发生缺失的热点区片段,它们分别位于外显子4、8、12、17、19、44、45、48和51。,杜氏肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy, DMD),03:40:08,43,多重PCR法检测中的基因突变,同时用2对引物双重扩增dystrophin基因外显子17和48区域内的2个片段，可检测出75左右的基因缺失型患者；,若同时用9对引物多重扩增，则可以检测到90左右的基因缺失型患者。,03:40:08,44,(三) 基因重排的检测,基因从一条染色体的正常位置转移到其他染色体的某个位置称基因易位或重排。
20、,1.荧光原位杂交技术(FISH) 。,2.PCR扩增,可用不同颜色的荧光标记DNA探针，可在染色体上定位基因或DNA片段及它们彼此间的排序。,前提条件是已知重排基因和位点的序列。,03:40:08,三、常见的基因异常及其检测,荧光原位杂交（双色FISH）,45,03:40:08,46,(四) 基因扩增的检测,基因扩增指基因拷贝数增加的现象,可增加几十到上千倍。,可用待测基因的 DNA片段或cDNA片段为探针，基因组DNA 采用适当的限制酶酶切后作Southern印迹杂交分析。,03:40:08,三、常见的基因异常及其检测,47,(五)DNA多态性的检测,1.限制性片段长度多态性(RFLP),
21、2.数目可变串联重复序列(VNTR)多性,多态性位点周围DNA序列已知时，可用PCR/ RFLP分析。,针对串联重复序列两侧的DNA序列设计引物，PCR 扩增后电泳。,03:40:08,三、常见的基因异常及其检测,48,1 .mRNA 的相对定量分析,(1) 斑点杂交或狭线杂交,放射或非放射标记的cDNA探针与待测RNA杂交，经显影或显色，与正常对照比较即可定量待测RNA。,(2) RT-PCR 法,对电泳凝胶中的扩增产物cDNA行光密度扫描，计算模板mRNA的量；若dNTPs 带放射性标记，作放射活性测定，并由此推算mRNA的含量。,(六)基因表达异常的检测,03:40:08,三、常见的基因
22、异常及其检测,49,2.mRNA的绝对定量分析,(1)采用一系列已知不同浓度的与待测mRNA序列相同但长度不同的内对照mRNA，在同一体系中一同进行RT-PCR(加32p-dCTP)，扩增产物经电泳分离，分别测定两者放射性强度，绘制标准曲线即可查出特异mRNA的量。,(2)用荧光定量PCR法对扩增产物定量。,3.mRNA的长度分析,(2)先分析RT-PCR产物电泳条带长度，后测序确认。,(1)采用Northern印迹杂交法检测某种特异的mRNA的长度有否改变；,03:40:08,2022/12/20,50,(一)遗传病的基因诊断,1.血红蛋白病（hemoglobinopathy）,四、疾病的基
23、因诊断(自习),2.苯丙酮尿症(phenylketonuria,PKU),(二) 感染性疾病的基因诊断,1.乙型肝炎的基因诊断,2.痢疾杆菌和侵袭性大肠杆菌的检测,(三) 肿瘤的基因诊断,1.肺癌(lung cancer),2.乳腺癌(breast cancer),51,(一)重复序列多态性与DNA指纹,人类基因组DNA序列中存在众多的多态遗传标记，除非同卵双生，几乎没有任何两个人的DNA分析图谱会完全相同，称为DNA指纹。,五、基因诊断在法医学上的应用,人类基因组中存在有大量的数目可变的串联重复序列(VNTR)；可分为小卫星 DNA、微卫星DNA/短串联重复(STR) 。,VNTR位点的平均
24、杂合度在70% 左右，存在极为广泛，分布十分理想，且检测方法简便，以取代RFLP而成为构建连锁图谱的新标记。,03:40:08,52,1985年，英国遗传学家Jeffreys等用串联重复序列(TR)的核心序列为探针进行RFLP分析，检测到许多高度可变区(HVR)，所得图谱具有高度的个体特异性，达到了如同人类指纹那样的高度专一性，称为DNA指纹图谱(DNA fingerprinting)。,Alec John JeffreysOxford, United Kingdom,03:40:08,53,(二) DNA指纹与法医案检工作,法医学中基因诊断的目的主要是个体识别和亲子鉴定。,以往法医学鉴定中应用的是血型、血清蛋白型、红细胞酶型和HLA分型、单位点特异性探针RFLP分析；个体分辨力不够，只能排除，不能做到统一认证。,03:40:08,五、基因诊断在法医学上的应用,54,法医案检中的基因诊断技术,VNTR（可变数目串联重复序列/小卫星）的核酸分子杂交分析STR（短串联重复序列/微卫星）的PCR分析SNP的基因芯片检测,03:40:08,55,亲权鉴定与DNA指纹图由此图可推断出：A和C是亲生女儿；B为妻子和其前夫所生；D为养女。,03:40:08,血迹中的DNA,56,03:40:08,
