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1、血管性血友病实验诊断中国专家共识血管性血友病(vonWiIIebranddiscase,VWD)是最常见的遗传性出血性疾病，在人群中的发病率为0.1%1%1,2o该病的诊断和分型流程复杂，目前临床和检验领域对其认识有限，故近十年我国VWD的诊断与治疗水平没有实质性进展。与此相反，近年由于凝血因子检测的规范化普及，使国内以血友病为代表的出血性疾病的诊断与治疗水平有了质的飞跃。虽然国内已有相关指南和共识发表3,4,但并未侧重于对VWD临床实验室精准诊断和分型。最近VWD诊断和分型技术有了很大进展，瑞金医院在近5年逐步建立了与国际接轨的VWD的表型和基因诊断体系，并在近100个VWD家系中进行了验证
2、5,为共识的编写提供了依据。为了提高国内VWD的诊断水平，帮助国内同行科学、合理地应用VWD诊断相关实验室检测项目，中华医学会检验医学分会、国家卫生健康委临床检验中心和中国血友病协作组共同决定制定VWD实验室诊断专家共识。一、概述VWD是由于血浆中血管性血友病因子(VonWi1.1.ebrandfactor,VWF)数量减少或质量异常导致的出血性疾病。VWF由血管内皮细胞和巨核细胞合成，主要生理功能为介导血小板黏附于受损内皮下暴露的胶原并保护血循环中凝血因子V1.1.1.(FVIII)不被过快降解，在一期止血和二期止血过程均承担着不可或缺的角色6,7oVWD患者出血程度个体差异较大，主要表现为
3、皮肤、黏膜出血，如皮肤瘀斑、鼻出血、牙龈出血、女性月经增多等，关节、肌肉出血少见。重型患者也可发生消化道出血、泌尿系统出血、女性卵巢囊肿或反复黄体破裂等。根据发病机制不同，VWD可分为3种类型：1型为VWF量的减少；2型为VWF质的缺陷；3型为VWF量的显著减少或完全缺失3o其中VWF清除加快的1型为IC型；2型VWD又可分为2A型、2B型、2M型和2N型8。各VWD亚型的特征详见表1。表1各VvVD亚里特征WE发桥矶制造传方武构成比【91出值快向ISvMb常触体兄宛全显性975%.sICSiVWF清除加俣常染色体思性罕见中、SS2SVWF差的异常2A灼于VFJRO（电.VWHSW3血，腌力T
4、ie常染色依纪性Sa性10%20%中.s2BSi5VWFRtS3fci.VWF血，JMSfeW力智SSt随体显性约5%中.重寰2MfiVWF泰Rfm本正常.Vw介导的0小板5a能力榜大各九常尖色体显性i35%中.：ESE2遮VWF多聚体菱本正常.VF号FVB系管力下炸砌色15恒性罕见中、重度SVF的散乏常臭色Qa性1%S.S二、VWD诊断1 .出血评分工具：目前可供使用的出血评分工具主要是国际止血与血栓协会(internationaIsocietyonthrombosisandhaemostasis,ISTH)推荐的出血评分工具(ISTH-BAT)10,11。该评分系统将不同程度的出血症状予以
5、赋值，异常出血评分标准为：成年男性24分，成年女性26分，儿童23分。建议1:对于临床上低度怀疑是VWD的患者，应采用标准化的出血评分工具对其进行预判。出血评分异常，再进行后续VWD诊断和分型实验。建议2：对于临床上中度或高度怀疑是VWD的患者（如家族史阳性），直接进行VWD诊断和分型实验。2 .筛查实验：（1）血常规：重度出血患者可有贫血表现,部分2B型VWD患者在基础状态下和/或应激后（如感染、外伤等）血小板数量下降；（2）常规凝血实验：VWD患者多表现为活化的部分凝血活酶时间轻度至中度延长，凝血酶原时间和凝血酶时间正常，血浆纤维蛋白原水平正常。3 .诊断实验：（1）血浆VWF活性测定（V
6、WF:Act）:根据ISTH最新颁布的VWD诊断指南12,推荐使用基于VWF与血小板结合原理的VWF活性测定方法，包括瑞斯托霉素诱导的VWF与重组野生型GPIba片段的结合能力检测（VWF：GPIbR）和不依赖瑞斯托霉素的VWF与功能获得性GPIba突变体片段的结合能力检测（VWF:GPIbM）等13o而VWF瑞斯托霉素辅因子活性（VWF:RCo）检测14敏感性低、变异系数大，不推荐首先使用。（2）血浆VWF抗原测定（VWF:Ag）:可使用全自动化学发光仪（化学发光法）或全自动血凝仪（免疫比浊法）检测。（3）血浆凝血因子V1.II活性测定（FVIII：C）:大多VWD患者合并FVIII:C的下
7、降，2N型和3型VWD患者血浆FVIII：C下降程度尤其明显。4 .分型实验：（1）血浆VWF多聚体分析：SDS-琼脂糖凝胶电泳法。(2)瑞斯托霉素诱导的血小板聚集(RIPA):比浊法。2B型VWD可表现为低浓度瑞斯托霉素(O.5mg/mI)诱导的血小板聚集增强，但该实验敏感度较低。(3)血浆VWF与胶原结合能力(VWF:CB):化学发光法或E1.ISA法。通常使用I型和/或I1.1.型胶原，极少部分VWF基因突变影响与V1.型胶原的结合。(4)血浆VWF与凝血因子V1.I1.结合能力(VWF：FVIIIB):E1.1.SA法结合发色底物法。2N型VWD患者VWF：FVIIIB下降。(5)去氨
8、加压素(1-deamino-8-D-argininevasopressin,DDAVP)试验：DDAVP可促进内源性储存的VWF的释放,0.3gkg静脉滴注后1h左右血浆VWF可达峰值。通过检测DDAVP输注后1h和4h的血浆VWF水平，可评估VWF在体内的半衰期。若DDAVP输注后4h的VWF水平比1h(峰值)降低超过30%,提示体内VWF清除速率增加15oISTH推荐将DDAVP试验作为IC型VWD的诊断依据。2B型VWD患者禁用。(6)血浆VWF前肽水平(VWFpp):VWFPP和成熟VWF以1：1的比例分泌至血浆，VWFPP与VWF：Ag比值升高可代表血浆VWF清除加快，主要用于诊断I
9、C型VWD。各VWD亚型患者的实验室检测特征总结见表2。表2VW咯型及亚型表型特征检制*ISICffi2AB2BS2M型2NS3型VWFzAg30%30%N/1N/1K/1WI3%VWF:Act30%30%30%30%30%W1.3%FVizCN/11IIn0.7070.70.70.7/VWF:CBMYF：Ag0.70,70.70,70,7/VWFPwVWF:AgNZt2N八W1.WN/R1.PAW1.I1t1W1.I1.VWF?RtSNNHMWM1.HMWM1.NN无VWF:R1.BNNNNN1/注：VWF:M为Vvo屈.WVF：Art为W元性.AU：C为凝血因子懂活性,VVF:Ce为VW与
10、皎蒯合磴力,VWFpp为Vwf就水平,RIPA为Iwi托年索谈导任:皿）姻K.VW:RBB力VWFfg血因子能力,N为正常.1.tfS,11力昱善*5.1为fHS.HMMI力底期分子唐量VWF多聚（S,/力不适用建议3:对于VWF:ACt测定，推荐使用基于VWF与血小板结合原理的VWF活性测定方法（如VWF:GP1.bR、VWF：GP1.bM）诊断VWD。建议4：标本严重溶血、脂血、黄疸或类风湿因子阳性可干扰化学发光法和免疫比浊法测定VWF：Ag,使用E1.1.SA法（双抗体夹心法）可基本排除以上因素的干扰。建议5:0型血人群VWF水平可能偏低，但无需针对ABO血型设定相应的VWF水平（VWF
11、:Ag和/或VWF:Act）参考区间。建议6:VWF属急性时相反应蛋白，诊断实验应在患者处于无应激的状态下进行。建议7:对于疑似1型VWD的患者，若VWF水平30%,无论有无出血症状，均诊断为1型VWD。若VWF水平为30%50%,有异常出血表现，可诊断为1型VWD。建议8:部分1型VWD患者的血浆VWF水平可随着年龄增长而升高至正常范围，须重新评估后才能修改诊断。建议9:诊断2型VWD（2N型除外），应满足VWF:Act与VWF:Ag的比值(VWF:Act/VWF：Ag)0.7o建议10:临床实验室应该同时开展VWF:Ag.VWF：Act以及FVIII:C检测，以助于VWF疾病筛查和初步分型
12、。建议11:对于怀疑为2A型、2B型或2M型VWD的患者，可采用VWF多聚体分析或VWF：CB与VWF：Ag的比值（VWF:CB/VWF：Ag）进行诊断分型。建议12：对于怀疑为2A型或2B型VWD的患者，可采用低浓度的RIPA来诊断2B型VWDo建议13：对于怀疑为2N型VWD的患者，可采用VWF:FVIIIB诊断。建议14：对于疑似IC型VWD的患者，优先推荐DDAVP输注后1和4h的血浆VWF水平检验结果以评估VWF在体内的清除速率。建议15:对于疑似2型或3型且需进一步诊断分型的VWD患者，推荐结合二代基因测序结果和相关分型实验以明确诊断。对于疑似1型且家族史阳性的VWD患者，可酌情进
13、行二代基因测序。5 .基因检测：VWF基因突变是各亚型VWD发生的分子基础。基于VWF基因突变的位置、性质与类型等，可进一步协助VWD患者的诊断和分型（特别是2型VWD）o1型和3型VWD的基因突变可位于VWF基因任意区域；2A型突变多位于VWF前肽、D3区、A2区及CK区；2B型突变多位于A1.区；2M型突变多位于A1.和A3区，2N型突变多位于D，区。2型和3型VWD基因突变检出率均可达90%以上，推荐进行基因检测；1型VWD基因突变检出率较低，仅为65%左右16,可能与患者血型、VWF转运蛋白、VWF清除受体等突变有关。此外，基因检测还是鉴别2N型VWD和血友病A以及2B型VWD和血小板
14、型VWD的有效手段。三、VWD诊断分型流程1 .符合VWD临床表现特征，出血评分阳性，家族史阳性或阴性。2 .血浆VWF:Ag和/或VWF:Act30%（2N型除外）。3 .排除血友病A、获得性VWD、血小板型VWD以及遗传性血小板功能障碍等。4 .结合血浆表型检测及基因检测结果，完成VWD分型。建议16:VWF:Ag.VWF：ACt以及FVIII:C检测是VWD诊断的首选项目，其余分型实验以及基因检测相关项目建议送专业实验室进行。VWD的诊断流程详见图1o注:WQ力ID筲性血友5.Vw:为血哲性血友病因子.C8C为E1.颐.ApTT为活化B港分薇匚;舌丽当PT力软匚的与盯考.Tr为装匚时司.Fg力正雄堡三原今平.NF：AQ为VWF抗原,VWF:ActVWFiStE.VwF水平：VWF统独如GWF活性.R1.:C却6而因.VWF:C防VwF与反原以合Ig力.VWFt)P为VWF的纸.RIPA力靖斯ft9.eSj-JRe.VW:FVBB为VWF与妁Q因子VISS台殡力.DDAPf*Cf.HMWM为酶分子MVV,F会展幺图1VWD诊断及分型流程图综上所述，本共识针对VWD的诊断和分型流程以及诊断过程可能遇到关键问题达成一致意见，目的是通过进一步规范相关检测项目的应用，提高国内VWD的诊断水平，为临床医师和检验医学工作者提供帮助。
