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1、第二章 细胞破碎技术,第一节 细胞壁的结构与组成第二节 细胞壁的破碎第三节 包含体,学习目标了解细胞的结构和化学组成；了解包含体的形成过程；理解各种细胞破碎方法及蛋白质复性的基本原理，能够应用有关方法进行细胞破碎；掌握常用的包含体分离技术。,微生物生产化学物质可分为两类： 胞外型 胞内型:基因工程菌产生的多数生理活性物质属此类 细胞破碎是指选用物理、化学、酶或机械的方法来破坏微生物菌体的细胞壁或细胞膜，释放其中的目标产物。,第一节 细胞壁的结构与组成,一、细菌类组成肽聚糖（多糖、氨基酸）、脂类结构细胞壁坚韧而有弹性，多层三维网状结构,革兰氏阳性和革兰氏阴性的差别： 厚度、紧密度、是否有外膜,G
2、ram-negative procaryotes革兰氏阴性原核生物（E.coli）,以革兰氏阴性原核生物为例。其细胞结构中没有细胞核：基因物质位于单链DNA上。典型的生物是大肠杆菌，是生物技术研究的主体。通过这种细胞生产了很多细胞重组的产物。,细胞膜结构,这三层有不同功能。肽聚糖层使细胞有一定的机械强度，破坏该层是本章讨论的重点。浆膜层和细胞内膜控制细胞的渗透压，即将营养物质运送到细胞内，将代谢物排出胞外。,二、真菌和酵母 真菌细胞壁组成几丁质（N-乙酰葡聚糖胺的聚合物）、纤维素、葡聚糖、甘露聚糖、半乳聚糖、蛋白质、脂类、无机盐等结构四层三维网状结构酵母细胞壁组成甘露聚糖、葡聚糖，蛋白质、类脂
3、质结构三层三维网状结构三、藻类 藻类的细胞壁更为复杂，其主要结构成份，是纤丝状的多糖类物质。,一、珠磨破碎 破碎原理：利用在高速搅拌作用下，细胞和微球相互磨擦碰撞而受剪切力被破碎。 破碎作用遵循一级动力学定律： 特点：适用范围较广；但有效能量利用率很低，设计操作时应充分考虑冷却系统的热交换能力；影响破碎率的操作参数较多，过程优化设计较复杂。,第二节 细胞壁的破碎,常用设备，一般有立式（见图2-5）或卧式（见图2-6）两种,WSK卧式高效全能珠磨机,ZM系列卧式密闭珠(砂)磨机,在用球磨法破碎细胞的过程中，影响因素有以下几个方面：（1）搅拌器外缘速率,（2）细胞的浓度 （3）球粒大小和装填量（4
4、）温度 （5）流量 （6）微生物特性,二、高压匀浆破碎原理：破碎作用遵循一级动力学定律： 特点：适用于酵母和大多数细菌细胞的破碎，不宜用于团状或丝状菌的破碎，易堵塞；由于操作中温度会升高，需对料液作冷却处理，保护目的产物活性。,JJ-2组织捣碎匀浆机,影响因素：（1）温度 破碎率随着温度的升高而增加。但是高温破碎只适用于非热变性产物。因此，进口处用干冰来调节温度，使出口处的温度维持在20左右。（2）压力 提高压力需增加消耗，压力每升高10Mpa，温度将提高2；另外压力过高将引起高压匀浆机排出阀座剧烈磨损。（3）循环操作次数,总结A、在大规模cell破碎中，高压匀浆机和珠磨机用得最多;B、高压匀
5、浆机最适合于酵母和细菌;C、珠磨机适用范围较广，可用于酵母和细菌，但对真菌菌丝和藻类更合适., 三、超声波破碎 破碎原理：超声波作用下液体发生空化作用，产生极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎。 影响因素：细胞种类、浓度和超声波的能量等。 特点：是很强烈的破碎方法；适用范围广；但有效能量利用率极低，对冷却要求相当苛刻，不易放大，多在实验室使用。,超声波破碎仪,四、酶溶 破碎原理：利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，增大胞内产物的通透性。 特点：不同的菌体细胞由于细胞壁化学组成不同应选用不同的酶处理。如溶菌酶适用于细菌；而酵母细胞的酶溶需用-1,6-葡聚糖酶或甘露糖酶；破坏植物细胞则用纤维素酶。 自溶：
6、是一种诱使细胞产生溶解自身的酶的特殊的酶溶法。 优点：对设备的要求低，能耗小；抽提的速率和收率高；产品的完整性好；对pH值和温度等外界条件要求低；由于细胞壁被溶解，不残留碎片，有利于提纯。但是酶溶法受酶的费用限制。,五、化学破碎 又称化学渗透，是利用化学或生化试剂（酶）改变细胞壁或细胞膜结构，增大胞内物质的溶出速率；或者完全溶解细胞壁，形成原生质体后，在渗透压作用下使细胞膜破裂而释放胞内物质。 破碎原理：用酸碱、表面活性剂、螯合剂、有机溶剂或变性剂等处理细胞，增大细胞壁或细胞膜的通透性，或者降低胞内物质间相互作用，使目的产物易于释放。,六、其他方法 （1） 冻结融化法 破碎原理：利用细胞在快速
7、冷冻时，细胞内水很快结晶，形成大量晶核，体积增大，将细胞胀破 特点：此法主要适用于大肠杆菌和细胞壁较薄的细胞，特别适用于位于胞间质的酶的释放；操作方便，但耗时、耗能，大规模应用困难。 （2）干燥法 破碎原理：菌体细胞失水，细胞内盐分浓度增大，细胞渗透性发生变化，然后用丙酮，乙醇或缓冲溶液等溶剂抽提胞内物质。可分为：空气干燥（酵母菌）、真空干燥（细菌）、冷冻干燥（不稳定活性物质），和喷雾干燥。 （3）渗透压冲击法 破碎原理：细胞在高渗透压介质中平衡后，再突然将其转至低渗透压环境中，水会大量进入细胞，使细胞壁和膜胀破。 特点：最温和的细胞破碎法；适用于易于破碎的细胞，如动物细胞和革兰氏阴性菌。,（
8、4）冷热交替法 将待破碎细胞在90维持数分钟，立即放入冰水浴使之冷却，如此反复多次，绝大部分细胞可以被破碎。从细菌或病毒中提取蛋白质和核酸时可用此法。A、细胞破碎仅发生在撞击的一瞬间，破碎程度均匀，避免反复和过度破碎；B、破碎的程度可无级调节，避免细胞内部结构的破坏，特别适合于细胞器的回收；C、实验室和工业规模均可应用，细胞浓度在10-20%，实验室规模的间歇处理能力在50-500 mL/h，工业规模的连续处理在 10,000 mL/h 以上。,（5） 撞击破碎法操作：细胞喷雾高速冻结高速载气（300 m/s氮气流）将冻结的微粒子送入破碎室，高速撞击撞击板。 原理：细胞冷冻后成为刚性球体，降低
9、破碎难度。,细胞壁的破碎方法总结,机械破碎法优点：处理量大、破碎效率高、速度快，适用于工业规模的细胞破碎缺点：A操作条件剧烈（高能、高温、高噪音、高剪切力，四高)，易使产品变性失活；易造成细胞过度破碎，不利于后续处理B、非专一性，胞内产物均释放，分离纯化困难；C、细胞碎片大小不一，难分离,化学破碎法优点：选择性高，胞内产物的总释放率低，料液粘度小，有利于后处理过程。缺点：适用范围小，通用性差，费用高；破碎速度慢，处理时间长，破碎效率低，不适于大规模细胞破碎操作。引起新的污染。,机械破碎法VS化学破碎法,细胞破碎的评价,破碎率定义N0：原细胞数，N：破碎后残存的正常细胞。N0和N的可通过直接计数
10、和间接计数法得到。直接计数法方法：样本稀释 - 染色 - 上样 计数。计算：同上。优点：方法简单。缺点：A、计数时间长，B、只有活细胞才被计数，误差大，C、细胞聚集时，不利计数，D、染色误差。,间接计数法方法：样本离心 - 取上清液 - 测特蛋白质或酶 - 与理论的最大值比较。计算：Rm：理论最大值，R：实验测得值。优点：A、方法客观可靠，尤其对蛋白质和酶B、有多种选择的指标，胞内位置(如胞膜、胞壁、近胞膜蛋白等)，灵活性大。缺点：影响因素多，如温度、pH值、剪切力、溶液的稀释等。解决办法：筛选相对稳定和恒定的指标。,第三节 包涵体,概念:包涵体是指蛋白质分子本身及与其周围的杂蛋白、核酸等形成
11、不溶性的，无活性的聚集体，其中大部分是克隆表达的目标产物蛋白。 分离:要包涵体中分离出具有生物活性的产物，通常的处理步骤为：收集菌体细胞细胞破碎离心分离包涵体的洗涤目标蛋白的变性溶解目标蛋白的复性。,一、包涵体的形成、分离及洗涤 形成包涵体的因素主要有以下几个方面： 重组蛋白的表达率过高，超过了细菌的正常代谢，由于细菌的蛋白水解能力达到饱和，导致重组蛋白在细胞内沉淀下来；由于合成速度太快，以致没有足够时间进行肽链折叠，二硫键不能正确配对，导致重组蛋白溶解度变小；重组蛋白的氨基酸组成有关，一般说含硫氨基酸越高越易形成包涵体；重组蛋白是宿主菌的异源蛋白，大量生成后，缺乏后修饰所需酶类和辅助因子，如
12、折叠酶及分子伴侣等，导致中间体大量积累导致沉淀； 与重组蛋白的本身的溶解性有关；在细菌分泌的某个阶段，蛋白质间的离子键、疏水键或共价键等化学作用导致了包涵体形成。,由于重组蛋白形成包涵体，包涵体又位于细胞质中，因此需破碎细胞，再经离心分离得到包涵体。离心分离的包涵体沉淀物中，除目标蛋白质外，还有其他蛋白质、核酸等的存在，经过洗涤，可以除去吸附在包涵体表面的不溶性杂蛋白、膜碎片等，达到纯化包涵体的目的。洗涤多采用较温和的表面活性剂（如TritonX-100）或低浓度的弱变性剂（如尿素）等。洗涤剂的浓度非常重要，通常不要太高，以免包涵体也发生溶解。,二、包涵体的变性溶解,包涵体中不溶性的活性蛋白产
13、物必须溶解到液相中，才能采用各种手段使其得到进一步纯化。一般的水溶液很难将其溶解，只有采用蛋白质变性的方法才能使其形成可溶性的形式。常用的变性增溶剂有十二烷磺酸钠（SDS）、尿素、有机溶剂（乙腈、丙酮）、pH9.0的碱溶液或盐酸胍等。对于含有半胱氨酸的蛋白质，其包涵体形式通常含有链间形成错配的无活性的二硫键，因此还要加入还原剂使二硫键处于可逆断裂状态。常用的还原剂有二巯基乙醇（2-ME）、二硫基苏糖醇（DTT）、二硫赤藓糖醇、半胱胺酸等。,三、蛋白质的复性,复性是指变性的包涵体蛋白质在适当条件下使伸展的肽键形成特定三维结构，使无活性的分子成为具有特定生物学功能的蛋白质。复性的方法： 稀释复性、
14、透析复性、超滤复性、层析柱复性、膨胀床吸附复性、温度跳跃式复性、双水相法、反胶团法影响复性的因素： 变性蛋白的情况、蛋白质的复性浓度、 pH值、氧化还原电势、添加剂 、杂质的含量、变性剂移除（或稀释）速度、复性时间、温度、前体肽。,例：人-干扰素的后处理工艺发酵液 离心获菌体(发酵液冷却至10C以下，4000r/min离心10min)菌体 细胞破碎(1倍体积细胞+10倍体积PBS buffer, 冰浴超声破碎5次, 5s/次, 4000r/min离心30min)，洗涤(0.1%温和表面活性剂聚乙二醇辛基苯基醚Triton X-100，1000r/min离心20min，重复三次)包含体 提取变性
15、 (包含体+8M 尿素 pH 8.0 50mM Tris-HCl buffer 0.2 mM 乙二胺四乙酸EDTA, 10mM二硫基苏糖醇DTT，室温搅拌2h, 离心(15000r/min, 30min),变性液 稀释复性(取1份变性液+99份上述buffer，不含二硫基苏糖醇，尿素浓度小于0.1M，4C搅拌24h）复性液 浓缩(用截留10000D的超滤器浓缩100倍)，透析后离心(15000r/min离心30min)浓缩上清液Sephacryl s-200葡聚糖凝胶柱层析分离 丙烯葡聚糖凝胶层析柱2100cm，pH 8.0 50mM Tris-HCl buffer 平衡洗脱收集主峰、冻干、终产物(纯度可达100%，DNA及热源合格),
