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1、,教学提示： 重点掌握病毒区别于细胞生物的独特的特点、病毒的形态特征、烈性噬菌体的生活周期以及温和噬菌体的侵染特点。 了解噬菌体对发酵工业的危害及防治办法、特别是了解病毒在当代基因工程研究和实践中的应用。,非细胞生物,（真）病毒：至少含核酸和蛋白质二种组分,亚病毒,类病毒：只含具有侵染性的RNA组分卫星RNA：只含有不具侵染性的RNA组分朊病毒：只含蛋白质组分,第一节 病 毒（virus）,一般特点： 个体极其微小，又称“超显微生物”，能通过细菌滤器； 无细胞结构，专性活细胞内寄生，以感染态和非感染态两 种状态交替存在，又称“分子生物”； 没有酶或酶系统极不完全，不能独立进行代谢活动，只能 利
2、用活寄主内现成的代谢系统。以核酸和蛋白的装配实现 繁殖； 对抗生素不敏感，但对干扰素敏感； 有些病毒的核酸能整合到宿主的基因组中，可以诱发潜伏 性感染； 凡有细胞生物生存之处，皆可能有与之对应的病毒存在 病毒多样性的的原因。,病毒是超显微的、没有细胞结构的、专性活细胞内寄生的实体。它们在活细胞外具有一般化学大分子特征，一旦进入宿主细胞又具有生命特征。,Transmission Electron Micrograph of HIV-1,The nucleocapsid (arrows) can be seen within the envelope.,h,病毒与人类的关系密切人类和许多有益动物的
3、疑难疾病和传染病几乎都 是病毒病；发酵工业中噬菌体污染会造成严重损失；侵染有害生物的病毒可制成生物防治剂；许多病毒是分子生物学基础研究和基因工程研究和应用中的重要工具。,1 病毒的形态构造和化学成分,1.1 病毒的大小,个体极小，约100nm左右，必需在电镜下观察；,不同病毒颗粒（病毒粒、毒粒）的大小差别很大，一般在20-200nm；,毒粒的形状大致可分球形颗粒(或称拟球形颗粒)、杆状颗粒和复杂形状颗粒（如蝌蚪状，卵形）等几类。,1.2 病毒的形态,1.2.1 典型病毒粒的构造,基本成分,核酸位于中心，称为核心,蛋白质包围在核心周围，形成衣壳,核心和衣壳合称核衣壳，为病毒的基本结构。有些复杂的
4、病毒在衣壳的外面包裹着一层由脂类和多糖组成的包膜。有的包膜上还长有刺突。,1.2.2 病毒粒的对称体制,螺旋对称,二十面体对称,复合对称,无包膜：杆状的烟草花叶病毒， 丝状的大肠杆菌fd、M13病毒,有包膜：卷曲状的流感病毒 弹状的狂犬病毒,无包膜：小型的脊髓灰质炎病毒 大型的腺病毒,有包膜：疱疹病毒,无包膜：蝌蚪状的大肠杆菌T偶数系病毒,有包膜：砖块状的痘病毒,1.2.3 病毒的群体形态,噬菌体（即细菌病毒）感染细菌后，使细菌细胞破裂死亡，连续重复感染使大量的细菌死亡，在培养细菌的平板上，可以看到一个个透明不长细菌的小圆斑，称为噬菌斑（相当于“负菌落”）。,人工培养的单层动物细胞被病毒感染后
5、，也会形成类似噬菌斑的动物病毒群体，称为空斑。,单层动物细胞受到肿瘤病毒的感染后，会使动物细胞恶性增生，形成类似细菌菌落的病灶，称为病斑。,烟草花叶病毒感染烟草后，在叶片上出现的一个个坏死的病灶，称为枯斑。,病毒的群体形态有助于对病毒进行分离、纯化、鉴别和计数等实际工作。,1.3.1 螺旋状对称型：烟草花叶病毒（TMV） 呈直杆状，长300nm，宽15nm，中空内径4nm，由158个氨基酸组成一个皮鞋状的衣壳粒，其相对分子量为17500，衣壳上总共有2130个衣壳粒，排列成130圈螺旋。核酸核心是单链RNA（ssRNA），相对分子质量为260万，含有6390个核苷酸，每3个核苷酸与一个衣壳粒相
6、结合，盘绕于蛋白质的中空内径中。,1.3 3类典型形态的病毒及其代表,是动物病毒，呈 “球形” 、直径70-80nm。具有12个角、20个面 和30条棱。腺病毒的衣壳是典型的二十面体对称， 由252个衣壳粒组成，没有包膜。 腺病毒的核心是由线状双链DNA（dsDNA）构成的,其大小约为36500个核苷酸对。 在实验室中，腺病毒只能培养在人的组织细胞上。它在宿主的细胞核中进行增殖和装配，并在宿主细胞内形成包涵体。,1.3.2 二十面体对称型：腺病毒,T4由头部、颈部和尾部三个部分构成。 头部呈20面体对称，由8种蛋白组成的衣壳和线状dsDNA的核心组成。 颈部由颈环和颈须组成。 尾部由尾鞘、尾管
7、、基板、刺突和尾丝等组成。尾鞘是头部的核酸注入宿主细胞的必经之路。刺突和尾丝与侵染宿主时的选择和吸附有关。,1.3.3 复合对称型：偶数噬菌体如T2、T4、T6等,1.4 病毒的核酸,核酸是病毒的遗传物质，是病毒粒中最重要的成分；控制着病毒的增殖及对宿主的感染性； 一种病毒的毒粒只含有一种核酸：DNA或是RNA；,病毒核酸,单链DNA（ss DNA）双链DNA（ds DNA）如动物病毒、噬菌体单链RNA（ss RNA）如动、植物病毒双链RNA（ds RNA）,2 四类病毒及其繁殖方式,2.1 原核生物的病毒噬菌体,其他病毒一样，噬菌体除有其特异性宿主外，并无显著区别。它们都是由蛋白质和核酸组成
8、。基本形态为蝌蚪形、球形、和丝状三种。 从结构看可以分为六种不同的类型。,2.1.1 噬菌体的繁殖,病毒粒子并无个体生长过程，而只有两种基本成分的合成和装配，即： 核酸复制+蛋白质合成 核蛋白（病毒粒子）,噬菌体的繁殖一般可分五个阶段，即吸附 侵入增殖（复制与生物合成）成熟（装配）裂解（释放）,尾丝尖端与宿主细胞表面的特异性受体接触，可触发尾丝散开，附着在受体上，随之把刺突、基板固定在受体细胞表面。,1）吸附,病毒吸附蛋白与细胞受体间的结合力来源于空间结构的互补性、相互间的电荷、氢键、疏水性相互作用及范得华力等。,2）侵入,吸附,尾钉固着,尾鞘收缩,尾管穿入,DNA注入,尾部的溶菌酶水解受体细
9、胞壁的肽聚糖，使细胞壁产生小孔；尾鞘收缩，核酸通过中空的尾管压入受体细胞内，蛋白质外壳则留在受体细胞外；,3）增殖,病毒利用宿主的生物合成机构和场所，使病毒核酸复制和表达，产生大量的病毒蛋白质和核酸。,4）成熟（装配）,T4噬菌体的装配是一个极为复杂的自我装配的过程,5）裂解（释放）,当大量子代噬菌体成熟后，由于脂肪酶和溶菌酶的作用，促使受体细胞裂解，从而完成子代噬菌体的释放.,吸附,侵入,早期：病毒特异性酶的合成,病毒核酸复制,病毒结构蛋白质合成,装配,释放,病毒大分子合成,凡在短时间（如T系噬菌体，T4、T7、X174等）内能连续完以上5个阶段而实现其繁殖的噬菌体称烈性噬菌体. 而当侵入宿
10、主细胞后，由于噬菌体基因组整合到宿主的基因组上，并随之同步复制，这种噬菌体称温和性噬菌体（详后）。,2.1.2 噬菌体效价的测定,效价表示每毫升试样中所含有的具侵染性的噬菌体粒子数，又称噬菌斑形成单位（pfu）或感染中心数. 直径2mm的噬菌斑，其中噬菌体数可达十亿个！,测定的方法双层平板法 用双层平板法测出的效价比用电镜直接记数得到的效价低。 前者是计有感染力的噬菌体粒子，后者是计噬菌体的总数。,一步生长曲线可分为三个时期： 潜伏期：指菌体的核酸侵入宿主细胞后至第 一个噬菌体粒子装配前的一段时间。 裂解期：指溶液中噬菌体粒子急剧增多的一 段时间。 稳定期：溶液中噬菌体总数达到最高点后的时期.
11、,2.1.3 一步生长曲线,定量描述烈性噬菌体生长规律的实验曲线称作一步生长曲线。它可以反映噬菌体的3个最重要的特征参数潜伏期、裂解期和裂解量。,2.1.4 溶 源 性 （lysogeny）,温和噬菌体（即溶源性噬菌体 lysogenic phage）感染宿主细胞后不能完成复制循环，而是将其核酸整合（插入）到宿主的核DNA上，随宿主DNA的复制而进行同步复制。在一般情况下，不引起寄主细胞裂解。,这一现象又称为溶源现象，其宿主菌称溶源菌。,温和噬菌体存在的3种形式：游离态 成熟后被释放出宿主，同时保持侵染性的游 离噬菌体粒子(生物大分子的状态)整合态 又称前噬菌体状态营养态 前噬菌体经外界诱导后
12、，脱离宿主基因组而 处于积极复制、合成和装配的状态。,附着或融合在溶源菌染色体上的温和噬菌体的核酸称为前噬菌体或原噬菌体。,前噬菌体,温和噬菌体十分常见，如E. coli的、Mu-1、P1、P2等都是。,溶源性细菌含有温和噬菌体的DNA，却又找不到形态上可见的噬菌体粒子的宿主细菌，又称溶源菌。溶源性菌株的命名是在菌株名称后加括号，内写携带原噬菌体的名称 ,():表示一株带有前噬菌体的大肠杆菌K12溶源菌株。在自然界中，各种细菌、放线菌都有溶源菌存在。,E. coli K12,溶源菌的基本特性：,可稳定遗传：子代细菌细胞都含有前噬菌体，且都具有溶源性。溶源性是溶源菌极其稳定的遗传特性.可自发裂解
13、：温和噬菌体的核酸也可从宿主DNA上脱落下来，恢复原来的状态，进行大量的复制，变成烈性噬菌体，自发裂解几率10-210-5 。可诱导裂解：用化学、物理方法可诱导进入裂解性循环具有“免疫性”：溶源菌对其本身产生的噬菌体或外来的同源噬菌体不敏感，对同源噬菌体具免疫性，对非同源噬菌体则没有免疫性。可复愈：可自然遗失前噬菌体，但不发生自发裂解，也不是诱导裂解 溶源转变：由于溶源菌整合了温和噬菌体的核酸而使自己产生了一些新的生理特征。,裂解性循环与溶源性循环的转变,2.2 植物病毒,是感染植物的病毒。大多为ssRNA病毒，基本形态为杆状、丝状和球状。植物病毒对宿主的专一性较差。植物病毒病的一般症状是：形
14、成枯斑或坏死；植株发生矮化、丛枝或畸形；叶片发生花叶、黄化或红化；,* 植物病毒由于没有专门的吸附结构，因此在侵染植物时是被动侵入。主要通过昆虫口器、摩擦伤口和人为伤口侵入宿主细胞。 * 与噬菌体不同的是，植物病毒必须在侵入宿主细胞后，才脱去蛋白质外壳即脱去衣壳。,植物病毒的繁殖方式： 与噬菌体的增殖过程基本相似，但具体细节有异。,烟草花叶病毒TMV的装配：其衣壳粒是以双层盘的形式组装成衣壳，pH的改变、RNA的嵌入对衣壳的装配起关键作用。,2.3 人类和脊椎动物病毒,脊椎动物病毒包括DNA病毒和RNA病毒动物病毒的增殖过程与噬菌体相似，只是细节上有所不同,腺病毒的复制可代表DNA病毒的复制脊
15、髓灰质炎病毒的复制可代表RNA病毒的复制,* 无包膜的病毒，如腺病毒通过细胞裂解或局部破裂而释放。* 有包膜的DNA病毒，如疱疹病毒，以细胞质中通道释放到细胞外。有包膜的RNA病毒，如副流感病毒用出芽方式通过寄主细胞膜释放到细胞外，并获得细胞源性的包膜和产生刺突。,动物病毒的释放方式多种多样，主要有以下几种形式：,1）吸附：腺病毒吸附在宿主细胞表面的糖蛋白受体上。,2）穿入：通过吞噬作用进入胞内。,3）脱壳：寄主细胞的蛋白酶水解腺病毒衣壳。,4）在宿主细胞核内转录早期mRNA并翻译成早期蛋白。,5）在宿主细胞核内复制出病毒的 DNA和晚期mRNA。,动物病毒的复制以腺病毒为例,*人类免疫缺陷病
16、毒(HIV，human immnodeficiency virus)是引起人类爱滋病（AIDS ）的病原，感染人类的淋巴细胞。*猿免疫缺损病毒(SIV，simian immnodeficiency virus)黑猩猩携带却不发病。,爱滋病病毒,HIV病毒的结构模式图,*HIV感染人体时，先由其表面糖蛋白gp120与人辅助T细胞(即T4细胞)表面蛋白CD4特异结合，gp120留在细胞表面而病毒进入T4细胞内。*在逆转录酶作用下，以RNA为模板合成原病毒DNA并整合到宿主细胞DNA基因组中进行繁殖。*由于gp120留在T4细胞表面，使得其像HIV病毒一样可以去感染另一个T4细胞而形成大的多核合胞体
17、。*T4细胞被感染，则失去免疫功能，人则患上爱滋病。这样，人体就象变成了没有军队的国家,只能招募“雇佣军”-抗生素。一旦“雇佣军”不济时则全线崩溃，死于象肺结核、肝炎及生理上的一些常见疾病。,关于艾滋病的数字近20年来有6000万人受感染，其中约2000万人死亡1985年中国发现第一例，目前估计已有感染者84万，艾滋病病人8万。截至2005年6月底，已报告艾滋病感染126808例，艾滋病病人28789人。感染人数在亚洲位居第二位，在全球居第十四位。 新感染者中儿童和青少年居多，全球1999年儿童新感染者为560万“重灾区”为女性，女/男的感染比例由原来的9:1变为3:1个别南部非洲国家有1/4
18、的人口感染去年全球每分钟有11人感染目前非洲每天为此举行5500个葬礼我国感染者60%为吸毒者注射毒品时感染病毒，其次为性行为传播和母婴关系传播中国有望在2010年将艾滋病病毒感染人数控制在150万之内,关于艾滋病病毒起源,有三种假说，即自然说、医源说和人为说。自然说认为，HIV是自然演变而产生的，在偶然的机会感染了人类。比较流行的观点是HIV来源于非洲的黑猩猩或绿猴等。医源说认为，人类在生产小儿麻痹症疫苗时使用了被污染的黑猩猩器官组织，在疫苗接种时被感染。人为说又有几种观点，一是认为HIV是美国中央情报局制造的生物武器，二是认为它是基因工程带来的灾难，三是认为HIV是纳粹的残渣余孽或者某个疯
19、狂的科学家企图进行种族灭绝、建立世界新秩序的产物。,但是，随着研究和调查的深入，专业人员否认了后两种说法，而肯定了前一种说法。即： 在HIV是自然演化的假说中，研究人员又认为HIV-1来自于非洲黑猩猩，而HIV-2来自于非洲黑白眉猴。 今天，人类对艾滋病有了更多的认识，其中最重要的就是：艾滋病并非是一种不治之症，因为一些人携带了HIV但却从来不发病。而这也与黑猩猩携带SIV却并不发病的特点一样 。,2.4 昆虫病毒,多数昆虫病毒可在宿主细胞内形成光镜下呈多角形的包涵体，称多角体，成分为碱溶性结晶蛋白，其内包裹着数目不等的病毒粒。,核形多角体病毒（NPV）：在昆虫细胞核内增殖、具有 蛋白质包涵体
20、的杆状病毒,质形多角体病毒（CPV）：在昆虫细胞质内增殖、可形 成蛋白质包涵体的球状病毒,颗粒体病毒（GV）：具有蛋白质包涵体，每个包涵体内通常 仅含一个病毒粒的昆虫杆状病毒,主要有三种类型：,80%的昆虫病毒是农林业中常见的鳞翅目害虫的病原体，因此是害虫生物防治的巨大资源库。,第二节 亚 病 毒,1971年T.O.Diener阐明马铃薯纺锤形块茎病毒的病原是一种具有感染性和自主复制能力的低分子RNA，称类病毒（Diener,1971）。,以后又发现了称之为拟病毒(Randles,1981)的植物病毒。,1982年，Prusiner发现了朊病毒(Prusiner,1982)。,凡是在核酸和蛋白
21、两种成分中，只含有其中一种分子的病毒，称亚病毒。,1 类病毒（Viroid）,类病毒是裸露的、专性活细胞寄生的分子病原体，仅含一个单链、环状、低相对分子质量的RNA分子。,发现的第一个类病毒是马铃薯纺锤形块茎病类病毒(Potato spindletuber viroid，PSTV)，这是一种导致马铃薯严重减产的病原体。棒状，无蛋白外壳。它仅含一个由359个核苷酸组成的单链环状RNA分子。该分子内有很多碱基(70)通过氢键配对而形成双螺旋区，未配对碱基则形成内环。双螺旋区与内环交替排列形成一个伸长的棒状分子。 类病毒RNA相对分子质量虽小，但能独立侵染寄主，侵入寄主后也能自我复制，不需要辅助病毒
22、。,类病毒目前只在植物中发现，是许多植物病害的病原体。,2 拟病毒（Virusoid）,是被包裹在真病毒粒子内部的有缺陷的类病毒，被称为拟病毒。一般仅由裸露的RNA或DNA组成。 被拟病毒“寄生”的真病毒又叫辅助病毒，拟病毒则是它的“卫星”，又称卫星RNA。 拟病毒的RNA分子单独存在时不具有感染性（不表现致病性），只有与辅助病毒共同存在时，才能完成复制和具有感染性。 拟病毒正在被研究应用于生物防治。,又称蛋白侵染因子。朊病毒是一类不含核酸的传染性蛋白分子，是能侵染动物并在宿主细胞内复制的小分子疏水蛋白质。 羊瘙痒病是羊的一种中枢神经系统退化性紊乱疾病。表现为羊毛脱落，皮肤瘙痒，失去平衡和后肢
23、麻痹等症状。这种“羊瘙痒病”的病原是经过近两个世纪的研究未能解决的一个谜。直至1982年，美国加洲大学旧金山分校动物病毒学家S.B. Prusiner才发现羊瘙痒病是蛋白质侵染而引起的疾病，他称之为“Prion”即朊病毒。他因此获得1997年的诺贝尔奖。,3 朊病毒(prion),现在已经发现与朊病毒有关的疾病有羊瘙痒病、貂脑病、疯牛病、人的库鲁病（震颤病）和克-雅氏病。有人还推测人类的一些慢性退化性紊乱疾病，像早老年痴呆，帕金森氏病、糖尿病、风湿性关节炎和红斑狼疮等疾病也可能是由朊病毒引起的。,朊病毒与真病毒的区别：呈淀粉样颗粒无免疫原性无核酸成分由宿主细胞内的基因编码抗逆性强能耐杀菌剂和高
24、温,第三节 病毒与实践,噬菌体与发酵工业昆虫病毒用于生物防治病毒在基因工程中的应用,1 噬菌体的危害和对付办法 发酵工业如抗生素、味精、丙酮、丁醇等有机溶剂工业和食品工业、酿酒工业等经常会遭受噬菌体污染。1.1 噬菌体的污染现象 碳源和氮源的消耗减慢，发酵周期延长，pH值异常变化，泡沫骤增，发酵液色泽和稠度改变，出现异常臭味，菌体裂解和减少，引起光密度降低和产物锐减等。污染严重时，无法继续发酵，应将整罐发酵液报废（即倒罐）。1.2 噬菌体污染的原因1）发酵用菌种本身是溶源性的； 2）好氧发酵的空气过滤系统失效或发酵生产环境中存在大量的噬菌体等；,1.3 防制措施防重于治,1） 杜绝噬菌体的各种
25、来源,应定期监测发酵罐、管道及周围环境中噬菌体的数量变化。充分做好环境卫生。,2）控制活菌体的排放,活菌体是噬菌体生长繁殖的首要条件，控制其排放能消除环境中出现特定的噬菌体。,3）使用抗噬菌体菌株和定期轮换生产用菌,选育和使用抗噬菌体的生产菌株是一种较经济有效的手段。定期轮换生产菌种，可以防止某种噬菌体污染扩大，并能使生产不会因噬菌体污染而中断。,防制措施治,噬菌体污染后的补救措施：,发酵早期：升温杀灭噬菌体，减少培养基中营养成分被破坏，再补充一些促进细胞生长的玉米浆等，重新接入大量健壮的、正常的种子，就可以继续进行发酵.,发酵中期：在噬菌体污染早期，大量接入另一菌株（不带前噬菌体）的种子液或
26、发酵液，继续进行发酵，可以达到减少损失、避免倒罐的目的。,2 病毒在基因工程中的应用载体,在基因工程中，把外源基因导入受体细胞并使之在受体内表达的中介体。除原核生物的质粒外，经改造后的病毒是其最好的载体.,1）噬菌体作为原核生物基因工程的载体如科斯质粒噬菌体经改造后的广泛使用的载体2） 动物DNA病毒作为动物基因工程的载体如猴病毒SV40已被成功改造成动物载体3）植物RNA病毒作为植物基因工程的载体如花椰菜花叶病毒CaMV被改造后已广泛而成功地得到应用4）昆虫DNA病毒作为真核生物基因工程的载体,复习思考题,某发酵工厂的生产经常因噬菌体的“感染”而不能正常生产，有人说是外部感染，有人说是溶源菌裂解所致，请谈谈你的看法？并请设计一实验证明你的推测。P81的第1、2、8、11。,小 结,阶段教学提示：此前的教学内容主要是各种微生物的形态构造特征和规律。由于是初学，很容易混淆和分辨不清。较好的学习方法是注重比较和归类，将有相似特征的微生物加以比较，如将细菌与酵母菌、放线菌与霉菌、细菌与放线菌、霉菌与酵母菌等两相比较，再结合实验课上所看到的微生物形态特征加以区别与记忆，一定会事半功倍！欢迎拷贝课件进行复习。,
