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1、,HPV分型检测在宫颈疾病检查中的应用及亚能HPV基因分型检测,HPV发展进程,70年代德国人哈拉尔德楚尔豪森提出人乳头瘤病毒与宫颈癌有关系2019年国际癌症学会确定：人乳头瘤病毒是宫颈癌的主要病因。2019年10月6号哈拉尔德楚尔豪森获得诺贝尔奖。,宫颈癌生物学病因研究的进程,子宫颈癌,唯一病因明确唯一可以早期发现和治疗唯一可望消灭HPV感染，特别是高危性、持续性感染引起子宫颈癌前病变，子宫颈上皮内瘤变，CIN和宫颈癌 预防HPV感染就可以预防宫颈癌 没有HPV感染就可以不罹患宫颈癌,我国宫颈癌流行现状,我国妇女患宫颈癌的比例15/10万，是仅次于智利的宫颈癌高发国家目前患者约40万，每年新
2、增15万，据女性生殖道肿瘤首位我国的宫颈癌死亡率为11.34%，据女性癌症死亡率第二位，特别在西部地区，宫颈癌居女性癌症死亡率之首我国已婚女性HPV感染率在10%左右。我国需惊醒宫颈癌相关筛查的适龄女性，不少于1亿,HPV 病毒学基础知识,小环状双链 DNA 病毒 2. 直径 50-55nm 3. 癌基因E6E7,14,66,低危型HPV,高危型HPV,HPV16,L1: 主要衣壳蛋白，是疫苗的主要成分,L2: 次要衣壳蛋白，是市售抗体的主要识别位点,E4：结合并破坏细胞角蛋白网，形成挖空细胞的外观,E2：负性调节E6和E7，维持凋亡和细胞周期的调控。通常在病毒发生整合（病毒整合时会破坏E2基
3、因的结构）时失活,HPV 的主要致癌基因 E6 通过抑制 p53而阻断凋亡 E7 通过抑制pRB使细胞周期失控,X,生殖道HPV 感染,高危型HPV感染通常没有症状，为一过性并可自愈。90%以上的病人两年内可痊愈。 常见其他亚型继发或并发感染 多重HPV亚型感染极为常见 自然免疫力差 感染后只有50%-60%的女性产 生抗HPV抗体，因此对同种基因型的HPV可再度 感染！,E6&E7,E2,良性湿疣,在上皮分化的终末阶段L1&L2 开始表达，并组装形成病毒衣壳 最后完整的病毒颗粒从细胞内释放出来大量E4 聚集溶解细胞骨架蛋白 呈现挖空细胞的外观,低水平表达，以维持病毒基因组和细胞的生长,负性调
4、节 E6&E7 保持细胞的分 化和成熟 确保能够产生 完整的病毒颗 粒,一过性 HPV 感染,E6&E7,在细胞发生恶变时丧失分化的能力 不同程度的 细胞不成熟性DNA多倍体的出现 核的非典型性持续的增生能力 分裂相增多,高级别 CIN,蛋白表达水平增高 凋亡被阻断、细胞周期失控 细胞开始发生恶变,在病毒整合时被破坏,持 续 性 HPV 感 染,E2,宫颈癌防治现状,宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤，也是严重影响妇女身心健康，威胁妇女生命的重要原因之一。流行病学的调查显示，从50年代以来，由于子宫颈细胞学的广泛应用，全球子宫颈癌的发病率明显下降，但在发展中国家仍居妇科恶性肿瘤首位调查数字显示： 我
5、国25岁以上的妇女中，有超过70的人 数从未做过宫颈防癌检查！,筛 查 的 重 要 性,宫颈癌筛查不只是医师行为，更是政府的职责，是艰难的系统工程我国目前不可能做到像美国、澳大利亚那样建立规范化的筛查制度可以根据各地情况做区域性筛查，定点筛查，机会性筛查 所有到妇产科门诊就诊者和各种体检者，都应做子 宫颈细胞学检查/HPV检查，这需要妇产科医生的工 作之一 高危人群者更应行定期的检查和随诊,筛查的目的是识别和检出子宫颈癌前病变， 而不是子宫颈癌；子宫颈癌多半有症状，是及时诊断问题子宫颈癌在癌前病变未被诊断，是没有进行检查和筛查： 1/4 患者从未进行细胞学检查 1/4患者子宫颈癌前5年未进行细
6、胞学检查筛查的准确性取决于： 筛查方法的敏感性、特异性 细胞学和HPV检查质量,子宫颈癌合并妊娠，是非常棘手的妊娠合并症。准备怀孕时仍要按照规范进行定期的细胞学检查。如孕前有高危因素，建议孕期及产后定期做宫颈细胞学检查。怀孕过程中若出现异常症状至医院 就诊，由医生根据情况决定是 否进行细胞学检查以及如 何处理。,妊 娠 期 也 应 进 行 宫 颈 癌 筛 查,筛 查 应 从 何 时 开 始？,性生活开始后3年左右不晚于21岁,Practice Guidelines in Oncology, 2019, NCCN,何 时 终 止 筛 查？,年龄 70岁，在10年内已有3次以上之满意的细胞学检查正
7、常者，可停止筛查。 但若无上述筛查历史，或有不正常者，则建议继续筛 查。有宫颈癌历史、雌激素暴露、免疫功能障碍 （HIV），应继续长期筛查。,Practice Guidelines in Oncology, 2019, NCCN,筛 查 的 时 间 间 隔,传统细胞涂片检查 每年一次 TCT每2年一次 30岁以后，连续3次正常者，每2-3年一次 FDA批准HPV DNA检测用于30岁以上的妇女联合细胞学检查 同时使用 细胞学和HPV DNA检测同时为阴性，筛查间隔可以 3年一次注意对HPV感染的评估,Practice Guidelines in Oncology, 2019, NCCN,HPV
8、 检 测 应 用 于 宫 颈 癌 筛 查,HPV病毒的发现明确高危型HPV病毒持续感染为宫颈癌治病因高危型HPV感染通常为一过性感染并可自行清除但如自身免疫力较差，则会造成持续感染不同地区人群的宫颈癌患者中感染的HPV型别不同不同HPV型别致病类型及强弱不同,HPV 检 测 的 临 床 应 用,细胞学结果为ASC的病例管理宫颈病变手术的术后随访与细胞学联合，应用于30岁以上女性的宫颈癌筛查指导HPV疫苗的使用（两种疫苗：4价、2价疫苗针对16/18） 现有的HPV疫苗只能对HPV16、18、6、11型这四种型别的 感染进行预防，且都以国外的研究数据进行研发 对于中国女性的HPV感染型别的研究，
9、有助于研发适合于 中国女性的 HPV疫苗,美国ASCCP 2019年版,美国ASCCP： 30岁妇女的宫颈筛查中联合筛查更为重要,HPV(-),TCT(-),HPV(+),1年重复TCT和HPV检查,都为(-),TCT(-) HPV(+),TCT(+)不管HPV是否正常,3年常规筛查,阴道镜,3年常规筛查,TCT结果为ASCUS及其以上病变,按ASCCP指南处理,TCT与HPV 检测的联合应用于宫颈癌筛查,TCT与HPV检测联合使用几乎可以100%防止漏诊，同时也可监测HPV感染的转归,现有HPV疫苗仅针对四种型别HPV病毒的感染，更多的HPV型别感染仍需通过定期的联合筛查来防治,临床处理仍需
10、遵循TBS诊断结果和三阶梯诊治流程,TCT联合HPV检测有助于宫颈病变的个体化处理,美国ACOG 2009年版,2009年11月20日,美国妇产科大学（ACOG）发表关于宫颈癌筛查的最新指南意见,对于30岁以上的妇女，最佳的筛查方式是同时进行细胞学筛查（TCT）和宫颈HPV DNA检测,如果两项结果都正常，属于宫颈癌的低危人群，筛查的间隔最好在三年以上,HPV 分 型 检 测,分型才能区分持续或反复感染分型才能区分单一和多重感染 后者危险更大不同型别不同的患病风险 致病性差异不同型别不同的处理方案相同细胞及组织学类型HPV阳性与阴性要区别对待不同HPV感染型别要区别对待根据ASCCP指南，细胞
11、学阳性，HPV16、18阳性可选择阴道镜检不同型别不同的致病类不同型别转归和愈后不同,*美国ASCCP2019版,HPV 分型检测应用（1）- 筛查,WHO建议HPV-DNA检测不能用于30岁以下的女性。 HPV DNA 检测虽然对HPV很敏感，但是并不能预测它的病程和发展，要预测高危HPV是否 可致癌，需要作基因分型测试 虽然复查显示同型HPV阳性，但不能预 料这个女性的宫颈疾病病程。 仅增 加了危险性,23 890(筛查人数),细胞学(-)HPV(-)21 409,细胞学(+)HPV(-)488,细胞学(-)HPV(+)370,细胞学(+)HPV(+)523,阴道镜检查533,无病例发现,
12、发现3例,发现59例,发现114例,HPV 分型检测应用（1）- 筛查,北美和欧洲的筛查研究显示，在35岁的女性人群中，HPV试验检测CIN2病变的敏感性和特异性分别为95%和93%。 细胞学检查发现ASCUS的敏感性和特异性分别为60%和97% 联合使用HPV检测和细胞学检查的敏感性比单独使用任何一种都显著提高，阴性预 测值达99%-100%,HPV分型检测应用（1）- 筛查,HPV分型检测应用（2）- 阴道镜适应征,30妇女，细胞学未见上皮内病变和恶性细胞，HPV16，18建议阴道镜。 2019 consensus guidelines for management of women wi
13、th abnormal cervical cancer screening tests AJOG.ORG,Pap阴性,HPV 阳性,HPV 阴性,三年内复检双相检查,16/18 基因分型,阳性,阴性,阴道镜检查,一年内复检双相检查,波特兰的一项研究表明，30岁细胞学阴性的女性中，HPV16或18阳性的女性在10年随访中出 现CIN3的比率分别为21%和18%。与此相比， 其他高危型HPV阳性的女性中，CIN3的风 险性仅1.5%。,HPV分型检测应用（2） 阴道镜适应征,Plummer et al10058例宫颈癌，8550宫颈鳞癌，1508宫颈腺癌和宫颈腺鳞癌HPV16 感染与宫颈癌的相关具
14、有普遍意义 宫颈鳞癌：HPV16占46-63%； HPV18占10-14% 宫颈腺癌和宫颈腺鳞癌：HPV18占37- 41%； HPV16占26-36%。,HPV分型检测应用（2） 阴道镜适应征,CIN23 HR-HPV: 94.0%常见亚型：HPV16、 33、58、31和52型Logistic Regression分析：HPV16、33和31与CIN23相关，是主要致病型 国家十五科研攻关项目,HPV分型检测应用（2） 阴道镜适应征,四种HPV亚型在 30岁妇女宫颈癌筛查中的作用,HPV16亚型在 30岁妇女宫颈癌筛查中的作用,2009年（ASCCP）最新HPV检测指南,HPV 阳性及细胞
15、学正常,HPV 16/18 (+),其他高危型阳性,阴道镜,重复细胞学和HPV 检测（间隔12个月）,两者均阴性,细胞学阴性HPV （+）,阴道镜,细胞学异常HPV （）,参照ASCCP指南,常规筛查（3年后）,HPV分型检测应用（3）-ASCUS分层,ASC病例的管理(2019ASCCP),大于20岁人群 6个月后重复细胞学检查 高危型HPV检测（可以用残留的液基做） 阴道镜检查（40-60%） 2019 consensus guidelines for management of women with abnormal cervical cancer screening tests AJO
16、G.ORG,HPV分型检测应用（3）-ASCUS分层,316例ASCUS患者中, CIN级以上的阳性检出率为18.99%（60316）,宫颈细胞学诊断为ASCUS中,HR-HPV阳性率为 68.99%（218316）， ASCUS 组中HR-HPV阳性患者CIN级以上 宫颈病变的检出率高于HPV阴性者，差 异有统计学意义（P0.001）,HPV分型检测应用（4）-绝经期妇女LSIL,2019 consensus guidelines for management of women with abnormal cervical cancer screening tests AJOG.ORG,“r
17、eflex” HPV 检测,6和12个月时细胞学,阴道镜,HPV 阴性或阴道镜未发现CIN,12个月时细胞学是推荐的,HPV 阳性或细胞学ASC-US,阴道镜是推荐的,HPV 阴性或连续2次细胞学“阴性”,常规细胞学筛查是推荐的,消融或切除治疗CIN失败的比率在1%25%之间。系统性的综述表明，不同方法的整体失败率为5%15%，不同方法间无显著差异。大多数失败发生在治疗2年后。 一个系统性综述报道，在治疗后20年内女性浸润癌的罹患率约10万分之56，高于美国普通人群（5.6每10万人年）。,HPV分型检测应用（5）-宫颈病变的随访,治疗后随访中应用HPV DNA检测的系统性综述表明，其性能优于
18、细胞学随访方法 。治疗后6个月HPV检测鉴别复发/持续性CIN的敏感 性达90%，而且保持这种水平到24个月。与 此相比，细胞学的敏感性大约为70%。 一些研究（不是所有研究）中，联合使 用HPV检测和细胞学可以增加敏感性。,HPV分型检测应用（5）-宫颈病变的随访,对细胞学ASC-US、ASC-H或LSIL的CIN1推荐的管理方案是，12个月时HPV DNA检测或6个月、12个月时重复细胞学检测 对CIN2、3女性治疗后的管理方法包括6-12个月时进 行HPV DNA检测、单独6个月采用细胞学或联合使用 细胞学和阴道镜,HPV分型检测应用（5）-宫颈病变的随访,AIS的管理方案 6个月时联合
19、使用 细胞学 HPV检测 宫颈管采样 阴道镜,HPV分型检测应用（5）-宫颈病变的随访,HPV分型检测应用（6）-指导疫苗的使用,疫苗是模拟HPV16/18的L1蛋白衣壳 （一种病毒样颗粒-病毒脂蛋白）给HPV阴性的女性接种这两种疫苗后，有90%以上的人不会产生由HPV16/18型引起的癌前病变 到目前为止，这种高浓度，长效抗HPV持续感染的预 防疫苗才开展了六年 如果接受预防者在接种时已经HPV16/18阳性， 是否有治疗作用尚未明了,下生殖道HPV感染的干预治疗,HPV的感染是非系统性感染，只局限于最初的感染的部位，感染部位的局部细胞因子和非特异性的效应细胞，如单核细胞、巨噬细胞和NK细胞
20、是阻止感染的第一道防线。 宣讲相关知识，调动患者免疫功能 增强生殖道局部免疫力，可加速对HPV的清除 用避孕套控制HPV在性伴间传播是有效和必要的,HPV是人类癌瘤发病中唯一可以完全确认的致癌病毒。现今的研究甚至可以证实： 预防HPV感染就可以预防宫颈癌， 没有HPV感染就可以不罹患宫颈癌。,HPV DNA 检测常用技术,HPV DNA 检 测 技 术,常用方法： 其他方法：普通PCR，原位杂交，SPR， DNA测序等,基因芯片技术 二代杂交捕获 荧光定量PCR,(一) 基因芯片技术,玻璃芯片膜芯片流式荧光杂交法（液态芯片）,固相芯片,玻璃芯片与膜芯片（固相芯片）,玻璃芯片 应用领域： 主要用
21、于科研领域，如基因表达谱分析、基因多态性分析、大 规模序列分析、药物筛选、基因诊断的研究等 目前仅极少数用于临床检验等领域 局限：制作工艺相对复杂 信号检测需专门的仪器设备（激光扫描仪） 阅读设备的成本局限（费用高昂）,应用领域： 高密度芯片目前仍主要用于科研领域 低密度芯片已经用于临床检验领域低密度芯片的特点： 工艺相对简便 信号检测简便 投入费用较低 现状：目前临床检测中，往往还不需要使用到大规模探针阵列， 从实用性、使用成本、方便性等角度考虑，低密度芯片 （十几个至几十个探针）更易于被接受,膜芯片,亚能HPV基因芯片检测系统,PCR扩增结合DNA反向点杂交技术灵敏度更高实验室设置及操作流
22、程应当符和规范PCR的检测结果是可靠的 检测通量大，可同时检测15种HPV亚型，包括13种高危型 探针设计，特异性强 膜条显示检测结果，读取更方便 采用dUTP-UNG防污染体系，有效避免假阳性结果 检测数量随需而变，单人份、多人份检测任选 有力的临床试验数据证明 WHO国际癌症研究所在中国的研究项目显示，亚能对于高度病变 的检测灵敏度达100%、阴性预测值达99.7%，特异性、准确性和阳性预测值和都很高。 对约3000人份的临床数据显示，普通人群的HPV高危型感染率 为11%左右，医院高危人群的HPV高危型感染率为20%左右，这 与文献报道相当。,亚能HPV 基因分型技术原理（PCR-反向点
23、杂交法）,一次杂交反应可以检测多种靶序列,PCR技术,Kary B. Mullis（穆利斯）,聚合酶链式反应（PCR）： 利用DNA碱基互补配对原则及半保留复制的特性， 将目的DNA在体外进行大量复制 美国PE Cetus公司的Kary Mullis于1983年创建 1989年美国Science杂志将PCR 列为 十余项重大科学发明之首,1993年度诺贝尔化学奖,Polymerase Chain Reaction,PCR技术原理,高温变性 低温退火 中温延伸,PCR三步曲：,PCR 产物的生成量 以指数方式增加,PCR技术特点-高度的灵敏性,PCR 产物的生成量是以指数方式增加的,35轮循环，
24、扩增量理论上达235个拷贝（680亿！）,核酸分子杂交,核酸分子杂交是指具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下可按碱基互补原则退火形成双链的过程。分子杂交具有高度的特异性。,探针,杂交体,亚能HPV 基因分型检测流程,结果判读,HPV16,HPV6,52,阴性样本,单一感染,多重感染,亚能HPV产品卖点,详见F:英硕力（三）亚能HPV产品卖点.ppt,HPV检测耗材列表及示意图,详见F:英硕力HPV 基因分型检测常用耗材图示.doc,实验室仪器设备清单,详见F:英硕力实验室仪器设备清单-20191227.xls,HPV主要竞争产品介绍,PCR-反向点杂交法特点,高灵敏度 - PCR 高特异
25、性 - 核酸分子杂交 高通量 - 膜上固定多种探针 安全无毒 - 生物素标记,流式荧光杂交法-液态芯片,首先PCR扩增待测样品，得到的PCR产物和微球上交联的探针杂交，加入荧光标记反应，最后在流式荧光检测仪上检测荧光信号。,如果PCR产物和探针配对，则微球上相应探针捕获到标有Biotin的PCR产物，加入荧光标记StrepAvidin-PE后，形成微球-探针-PCR产物-Biotin-StrepAvidin-PE复合物。在检测仪上即可检测到对应微球的荧光信号。 如果PCR产物与探针不配对， 则对应微球的荧光信号为背景 信号。,流式荧光杂交法操作流程,PCR 扩增,DNA提取,编码微球与探针混合
26、,向检测板中加入微球-探针杂交液，加入PCR产物,PCR产物变性,杂交，48，30min,加入链霉亲和素标记的藻红蛋白，15 min,Luminex 100 多功能流式分析仪检测,代表厂家：上海透景人乳头瘤病毒核酸分型检测试剂盒检测的基因型：19种高危型： 16,18,31,33,35,39,45,51,52, 56,58, 59, 68,73,83，26, 55, 61,66种低危型： 6,11,40,42,44,53,54 认证：国食药监械(准)字2009第3400020号进口专用仪器(美国Luminex多功能流式点阵分析仪）,流式荧光杂交法,HPV 61 型为低危型！参照：N Engl
27、J Med 2019;348:518-27,Luminex 100TM多功能流式点阵仪,流式荧光杂交法 - 不定量,流式荧光杂交法总结,结合普通PCR技术，核酸分子杂交技术和荧光标记 技术尚不成熟，灵敏度和特异性有待提高 无洗涤步骤，无法去除非特异性杂交，且有背景荧 光信号干扰 技术难点为探针与微球的交联，产品性能上存在不 稳定性 只分型，不定量 需价格昂贵的流式荧光检测仪,（二）二代杂交捕获 Hybrid Capture 2, HC2,基本原理：利用对抗体捕获信号的放大 和化学发光信号的检测 检测通量：13种高危HPV基因型, 不能提示具体的基因型,计算机判读15 min,杂交60 min,
28、抗体捕获60 min,第二抗体结合，化学发光30 min,DNA变性45 min,HC2 实验步骤图示,吸取变性剂于对照和样本管中,旋涡振荡10秒,65孵育45分钟，采用Microplate heater I,HC2操作步骤-DNA 变性,将已变性的样本混匀，吸取75 ul 于“杂交微孔板”中,20-25孵育10分钟,加入25 ul 高危HPV探针于微孔板中,65孵育60分钟,置于Rotary Shaker I中，1100 rpm，32分钟,准备HPV 探针混合物,HC2操作步骤-杂交,将杂交产物转移至“捕获微孔板”相应的小孔中,20-25孵育30-45分钟,20-25孵育60分钟， 1100
29、 rpm,加入75 ul Detection Reagent 1（碱性磷酸酶偶联的抗体）于“捕获”微孔板相应的小孔中,HC2操作步骤-抗体捕获及酶标,洗涤微孔板：采用Automated Plate Washer I或进行手动洗板，重复洗6次,加入75 ul Detection Reagent 2 （化学显色底物）于“捕获”微孔板相应的小孔中,20-25孵育15-30分钟,采用Digene microplate luminometer (DML2000)读数,HC2操作步骤-洗板及化学显色,HC2如何进行结果判读?,1 、阴性对照 每次实验必须同时做3份阴性对照。阴性对照的结果必须为10-250
30、 RLU（相对光单位）。变异系数（%CV）应该25%，如果25%，那么去掉偏离平均值最远的一个阴性对照，用剩下的两个阴性对照计算平均值以及变异系数。 %CV必须25%，否则，本次实验结果无效，必须重做，无法给病人出报告,2. 标准品 每次实验必须同时做3份高危HPV标准品。 %CV应该15%，如果15%，那么去掉偏离平均值最远的一个标准品，用剩下的两个标准品计算平均值以及变异系数。 %CV必须15%，否则，本次实验结果无效，必须重做，无法给病人出报告3. 用标准品平均值（MHRC）以及阴性对照平均值MNC计算MHRC/ MNC比值.2.0MHRC/ MNC 15。如果2.0 或15，本次实验结
31、果无效，必须重做。4. 如果符合以上的标准，检测结果是可靠的。此时的Cutoff值（阳性标本评判的标准）就是MHRC,Cutoff 值=318，所有标本的相对光单位（RLU）应该转换为与Cutoff值的比值，比值大于1为阳性，比值小于1则为阴性,阳性结果的判定,质 控,HC2技术总结,技术上，采用核酸分子杂交，抗体捕获（吸附杂交体），化学显色不分型不能检测HPV多重感染不定量有交叉杂交反应每次需要消耗8个参考品，试剂成本高手动操作很多，步骤繁琐需价格昂贵的基因杂交信号放大系统,(三) 荧光定量PCR技术,原理： 在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号的积累,实时监控整个PCR过程,最后通
32、过标准曲线对起始模板量进行定量分析. 定量，不分型,荧光基团的分类,化 学 原 理,荧光定量PCR-基于Taqman探针,化 学 原 理,荧光定量PCR技术总结,能定量检测HPV拷贝数灵敏度高不分型不能检测HPV多重感染检测通量有限，目前最多检测13种高危型需价格昂贵的荧光定量PCR仪,（四）原位杂交,采用荧光、生物素、地高辛等标记的探针，依据碱基互补配对原理，与组织切片、细胞涂片等标本中的靶序列特异杂交，经信号放大及显色后，显微镜下观察结果,原位杂交试剂盒,代表厂家：北京中杉金桥生物技术有限公司,原位杂交实验步骤,以地高辛标记HPV DNA探针为例 4-6mm切片，用处理过的玻片捞片。 56
33、-60烤片，2-16小时。 新鲜二甲苯脱蜡，10分钟2次。 100%乙醇5分钟2次，空气干燥。 加入50ml胃酶工作液，37消化30分钟。 弃去胃酶工作液，逐级酒精脱水1分钟3次，空气干燥。 加10-20ml探针，加盖玻片。用橡胶水泥将盖片周围密封（目录编号ZLI-9601）。 变性95 5-7分钟。 杂交37 2-16小时。 揭去橡胶水泥，将切片插入PBS/TBS缓冲液中以便去掉盖玻片，约5-10分钟。 每张切片加入2-3滴杂交后洗液，37孵育15分钟。 PBS/TBS缓冲液洗，1分钟3次。 每张切片加入适量辣根酶标记抗地高辛抗体，37孵育30分钟。 PBS/TBS缓冲液洗，1分钟3次。 滴
34、加适量DAB工作液，镜下观察显色结果，约3-10分钟。 弃去显色液，蒸馏水或自来水冲洗。 选择：每张切片加入1滴复染剂，5-10秒钟。 蒸馏水或自来水冲洗。脱水、透明、封片。,原位杂交技术总结,灵敏度低（无PCR扩增） 特异性高 检测通量低 不能分型 不能定量 操作步骤繁琐 非常费时，需要两天 HPV 检测产品无注册证，仅仅用于科研,（五）表面等离子体谐振 （SPR） 技术,93,表面等离子谐振现象,Surface Plasmon Resonance，SPR入射光(单波长偏振光)在玻片-金膜界面全反射，激发金膜中的自由电子产生表面等离子体。当光波激发频率与表面等离子体的振动频率相等时，二者发生
35、谐振，光能被吸收,反射光几乎完全消失,此时入射光的角度被称作SPR角（谐振角）。,SPR检测核酸原理示意图,反应曲线,Time(s),SPR角(m),1）核酸提取试剂2）PCR反应试剂3）SPR检测试剂和芯片,北京金菩嘉-HPV分型检测试剂盒组成,HPV基因检测芯片，共26个通道，一个阴性，一个IC，24个hpv探针,通道 217： 高危HPV;通道 1825：低危HPV,SPR检测芯片探针点阵,SPR HPV 检测芯片,SPR技术检测 H P V流程图,样品制备,DNA,PCR,扩增产物,线上检测,输出报告,成品芯片,SPR 设 备 简 介,W2600型生物传感芯片阅读仪,W2600工作流程
36、,开始检测后系统自动进行以下动作：,SPR技术检测HPV 总结,同样需要DNA 提取采用普通PCR扩增，核酸分子杂交采用SPR技术（物理手段）检测杂交信号无临床应用文献无注册证,（六）HPV DNA 序列测定,经典方法:Sanger双脱氧链终止法(Sanger,1977)Maxam-Gilbert DNA化学降解法(Maxam &Gilbert,1977),与 PCR反应类似反应体系中包含：模板 DNA, Taq酶, dNTPs, ddNTPs和测序引物反应过程： 变性复性延伸终止,Sanger双脱氧链终止法,Dideoxynucleotides（双脱氧核苷酸）,ddNTPs 是反应 终止剂
37、可以当作正常碱 基参与复制，一 旦掺入DNA中， 其后延伸反应就 不能继续。,*,少一个OH,脱氧核甘酸与双脱氧核甘酸结构比较,双脱氧链终止法测序原理,反应体系中含有ddNTPs, 因此，在复制的延伸过程中，在DNA任何碱基位置都可能出现终止反应，从而形成不同长度的寡核苷酸混合物。所以，每条寡核苷酸都有固定的起点，但有不同的终点，长度由ddNTPs掺入的位置决定。,在高分辨率的电泳条件下（如毛细管电泳）， 能够将长度相差一个碱基的寡核苷酸分离开。 ddNTPs包含4中双脱氧核苷酸，分别带有不同的荧光标记，当带有不同荧光标记的寡核苷酸依据长度大小先后通过荧光检测仪时，检测仪可以自动读取DNA上的
38、核苷酸顺序,凝 胶 电 泳,DNA在电泳中的迁移率与其片段长度有关，片段小的跑得快，片段大的跑得慢，因而彼此分离开。,双脱氧链终止法测序原理示意图,DNA全自动分析仪,ABI 3100遗传分析仪,3700型全自动遗传分析仪,安玛西亚DNA序列分析系统,377型遗传分析仪,DNA提取,PCR扩增,PCR产物纯化（电泳或专用试剂盒）,读取序列及分析,测序仪检测,产物纯化,测序反应,HPV DNA 测序流程,测序法检测HPV的局限性,首先必须对待测样本进行PCR扩增，由于事先不知道是哪一种HPV 基因型的感染，所以必须采用通用引物进行PCR扩增,单一感染（如HPV 16）,多重感染（如HPV 16，
39、18，52，58）,鉴定,无法鉴定基因型！,DNA 测序技术总结,测序之前必须做对待测样本进行PCR扩增或DNA克隆 测序技术的准确性依赖于引物的特异性难以对HPV 多重感染进行测序鉴定操作复杂，耗时测序仪价格昂贵国内开展基因测序的机构或企业非常少无注册证，仅仅用于科研,各种HPV DNA 检测技术总结,基因芯片技术特点,高灵敏度- PCR 高特异性- 核酸分子杂交 高通量- 膜上固定多种探针 安全无毒- 生物素标记,二、HPV 主要竞争产品,基因芯片技术 代表厂家：亚能、凯普、达安 二代杂交捕获 代表厂家： Qiagen（凯杰） 荧光定量PCR 代表厂家：港龙，达安，凯普，复星， 匹基 流式
40、荧光杂交法 代表厂家：上海透景,三、亚能HPV与竞争产品的对比,1、亚能和凯普HPV基因分型产品对比2、亚能基因芯片技术与二代杂交捕获对比3、亚能基因芯片技术与荧光定量PCR对比4、亚能基因芯片技术与流式荧光杂交法对比,（一）亚能和凯普HPV基因分型产品对比,凯普导流杂交仪,导流杂交法杂交效率和灵敏度,膜条,基因型特异性探针固定在膜条的特定位置探针只占据膜条面积的极小部分目的DNA在膜条上均匀分布，定向流动，一过性接触！杂交上的DNA只占目的DNA的极小部分杂交效率低，灵敏度低！,亚能和凯普膜条显色对比,亚能,凯普,膜条尺寸：12mm78mm,膜条尺寸：22mm22mm,亚能产品与凯普的比较优
41、势,使用普通杂交仪可检测更多来源的标本样本越多，时间优势越明显检测23型灵敏度、特异性、准确度高；重复性好交叉污染风险极低，假阳性率低提取试剂，芯片阅读仪均有证PCR扩增体系预分装仪器运转中操作者可休息显色斑点大，易于判读,（二）亚能与杂交捕获二代对比,2019年，美国FDA公布了HC2的四个批次的产品召回通告召回原因：可能产生假阳性结果,accessdata.fda.gov/scripts/cdrh/cfdocs/cfres/res.cfm?start_search=1&event_id=25678,亚能HPV产品与HC2的比较优势,检测23种HPV 基因型能分型能检测HPV多重感染可检测更
42、多来源的标本对实验室仪器设备要求很低无交叉杂交现象可分批使用，单人份、多人份任选,(三)亚能与荧光定量PCR对比,亚能产品与荧光定量PCR的比较优势,检测23种HPV 基因型能分型能检测HPV多重感染可检测更多来源的标本使用普通PCR仪特异性更高可分批使用，单人份、多人份任选,代表厂家：上海透景人乳头瘤病毒核酸分型检测试剂盒检测的基因型：19种高危型（ 16,18,31,33,35,39,45, 51,52, 56,58, 59, 68,73,83，26, 55, 61,66 ）， 种低危型（ 6,11,40,42,44,53,54 ）认证：国食药监械(准)字2009第3400020号进口专用仪器(美国Luminex多功能流式点阵分析仪）,流式荧光杂交法,HPV 61 型为低危型！参照：N Engl J Med 2019;348:518-27,(四)亚能与流式荧光杂交法对比,亚能产品与流式荧光杂交法的比较优势,对实验室仪器设备要求低可检测更多来源的标本、标本保存时间更长有dUTP-UNG酶防污染体系宫颈脱落细胞采集器有注册证DNA 提取试剂通过国家认证,谢谢！,供娄浪颓蓝辣袄驹靴锯澜互慌仲写绎衰斡染圾明将呆则孰盆瘸砒腥悉漠堑脊髓灰质炎(讲课2019)脊髓灰质炎(讲课2019),
