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1、炎症细胞因子在嵌合抗原受体-T细胞治疗中的监测价值嵌合抗原受体(ChimeriCantigenreceptor,CAR)-T细胞免疫治疗通过修饰T细胞技术将识别肿瘤相关抗原的抗体与T细胞的激活结构域结合，从而达到特异性识别和杀伤肿瘤细胞的能力1。近年来，CAR-T细胞免疫治疗技术在国内外广泛应用于多种类型的恶性肿瘤，尤其在淋巴瘤、多发性骨髓瘤以及急性白血病等恶性血液病中表现出很高的缓解率和疗效2,但治疗过程中多伴随严重毒性反应，包括细胞因子释放综合征(cytokinereIeasesyndrome,CRS)、神经系统毒性、感染等，其中CRS是最常见也是最严重的不良反应之一3。CRS临床表现为全
2、身症状，如发热、低血压、低氧血症，严重的患者可出现凝血功能障碍以及噬血细胞性淋巴组织细胞增生症/巨噬细胞活化综合征等并发症4o为阐明不同炎症因子在CAR-T细胞免疫治疗中的表达特点，本研究在患者接受CART细胞回输后的不同时间点，通过流式微球技术(cytometricbeadarray,CBA)5检测12种炎症因子表达水平，探索这些因子与CRS分级之间的相关性，以期在临床诊疗过程中对CRS的早期诊断和治疗中提供重要依据。对象与方法一、对象2017年11月至2020年12月南京医科大学第一附属医院(江苏省人民医院)采用CAR-T细胞免疫治疗的住院患者12例，包括男性6例，女性6例，年龄53.0(
3、49.8,62.5)岁。多发性骨髓瘤8例，成熟淋巴细胞增殖性疾病3例，急性B淋巴细胞白血病1例。多发性骨髓瘤采用靶向B细胞成熟抗原的CAR-T细胞免疫治疗，B细胞慢性淋巴增殖性疾病和急性B淋巴细胞白血病采用CD19-CAR-T细胞免疫治疗。所有患者在CAR-T细胞回输后30d内采用CBA监测12种炎症细胞因子以及经典炎症相关指标C反应蛋白(C-reactionprotein,CRP)、D二聚体(D-Dimer,D-D)、血清铁蛋白(SerUmferritsn,SF)和乳酸脱氢酶(IaCtiCdehydrogenase,1.DH)水平。根据修订的CRS分级系统3,共分成4个级别：0(未出现CRS
4、)、1、2和3级。二、炎症细胞因子检测仪器及试剂流式细胞仪器机型为BeckmanDxF1.EX(美国Beckman公司),12种炎症细胞因子包括白细胞介素(interleukin,I1.)-2、I1.-4、I1.-5、I1.-6、I1.-8、I1.70、I1.72P70、I1.77A、干扰素(interferon-,IFN)-a、IFN-和肿瘤坏死因子一a(tumornecrosisfactor-a,TNF-a),试剂来源于江西赛基生物技术有限公司提供。参考区间(pgml)为I1.-2：05.71,I1.-4：03.00,I1.-6：05.30,I1.-10：04.91,TNF-:04.60,
5、IFN-:07.42,I1.-17A:020.60,I1.-1:012.40,I1.-5：03.10,I1.T2P70：03.40,IFN-a：08.50,I1.-8：053.09,由试剂公司提供。三、流式细胞术检测乙二胺四乙酸抗凝静脉血2ml,1610Xg离心20min后，取血浆0.5ml。标准品管中加入25I梯度稀释好的标准品，样本管每管加入25I的待测样本。将捕获微球混合液用低速离心机200Xg离心5min,去上清，加入与上清等体积的微球缓冲液，涡旋混匀，避光孵育15min后，加入25I的荧光检测试剂，室温避光2.5h后洗涤，每管加入100I磷酸缓冲盐溶液上机检测。以前向散射光为横坐标、
6、侧向散射光为纵坐标设门找出与捕获微球结合的炎症细胞因子，见图1A,每管获取目的细胞3600个，通过APC-A750和APC检测不同细胞因子的表达（图1）,用FCAPArrayv3软件分析表达水平。201VlossIO3IO4IO5IO6APC-HHlogZVIodv图112种炎症细胞因子检测流式细胞术分析示意图图IA为前向散射光/侧向散射光双参数图设门（PI）圈出微球，图IB为APC/APCA750双参数分析12种炎症细胞因子表达平均荧光强度四、统计学分析实验数据用SPSS25.0和WPSOFFlCE软件进行统计学分析。计数资料以例数/CRS各分级例数表示，组间比较采用X2检验。非正态分布计量
7、资料多组间比较采用KruskalWallis秩和检验。采用Spearman相关系数对炎症细胞因子表达水平和CRS分级（有序变量、不符合正态分布的连续变量）进行相关性分析。绘制受试者工作特征（receiveroperatingcharacterist,ROC）曲线，确定炎症细胞因子预测CRS的敏感度、特异度。以P0.05为差异有统计学意义。结果一、12种炎症细胞因子表达特点与CRS不同分级的相关性12例患者分别在回输CAR-T细胞后第1、4、7、11天进行临床分级，总计48例次，其中CRSo级25例次（52.1%）,CRSl级6例次（12.5%）,CRS2级9例次（18.8%）,CRS3级8例次
8、（16.7%）o所有患者I1.-4、I1.77A、I1.7B、I1.-5J1.-12P70水平均正常，4组患者I1.-6、I1.T0、IFN-、IFN-a、I1.-8差异有统计学意义（P0.05),见表1。表112种炎症细胞因子表达情况阳性例数/CRS各分级例数18标CRSOIS(/=25)CRS1&(/=6)CRS2fSg9)CRS3IS(/=8)X2fflPtsH-22/253/62/91/86.1260.106IIY0000H-69/256/66/98/831.8780,001I1.-IO6/256/65/9日825.1380.001TNF-O01/61/91/84.8500.183IF
9、N-V1/25461/95/821.8770.001I1.-17A0000,-l0000I1.-S0000一I1.-12P700000一IFNO01/63/9011.1930.011I1.-85/2506/96/820.7880,001注：16自如旗介素.TNF为肿色坏死因子.IFN为干扰素一为无货二、炎症细胞因子在CRS不同分级患者中的表达水平比较48例次CRS不同分级患者中，I1.-4J1.-6J1.7O、TNF-、IFN-.I1.-1BJ1.-8表达水平差异有统计学意义(P0.05)o三、炎症细胞因子水平变化与CRS不同分级之间的相关性48例次CRS不同分级患者中，炎症细胞因子包括I1.
10、-4、I1.-6、I1.-10,TNF-a、IFN-.I1.7B、I1.-8水平均随着CRS分级提高而增高，不同级别之间比较，差异有统计学意义(P0.05)(表2)o表248例次炎症细胞因子与CRS分级之间的相关性指标而PiSI1.-20.0730.622IIY0.3840.007I1.-60.7300.lI1.-IO0.6320,001TNF-O03410.018IFN-Y0.6810,001I1.-17A-0.0350.812I1.-IB03190.027I1.-50.1600.279I1.-12P700.1140.442IFN-O0.1100.455I1.T0.6220.001注:I1.
11、S8af.TNF为脖小死因子.IFN为干扰票四、炎症细胞因子与经典炎症监测指标在CRS发生过程中结果进行比较将12种炎症细胞因子与临床监测急性感染的经典指标CRP、D-D、SF和1.DH进行匕匕较。I1.-2、I1.-6、I1.-10、TNF-q、IFN-.IFN-.I1.-8出现升高，其中I1.-6和I1.-10在12例患者中均升高。12例患者中，所有患者I1.-6升高明显早于CRP、D-D、SF和1.DH4个指标，11例I1.7O升高早于CRP、D-D、SF和1.DH。9例11_一8和IFN-升高，8例I1.-8和IFN-升高早于CRP、D-D、SF和1.DH。4例I1.-2和IFN-a升
12、高，2例TNF-Q升高。3例I1.-2、2例IFN-a和1例TNF-a升高早于CRP、D-D、SF和1.DH。出现升高的7种炎症细胞因子（I1.-6、I1.70、IFN-Y、I1.-8、I1.-2、TNF-a和IFN-a）,开始升高的时间平均值分别为3.4、5.3、6.1、2.9、4.3、6.0和5.8d,CRP.D-D,SF和1.DH开始升高的时间平均值为6.6、7.6、8.3和7.6do出现升高的7种炎症细胞因子开始升高的时间平均值均小于4项经典炎症监测指标（图2）。经临床治疗后，12例患者I1.-8恢复正常水平均早于CRP、D-D.SF和1.DH,8例IFN-丫、7例11_一10、5例I
13、1.-6、3例IFN-和1例TNF-恢复正常水平早于CRP、D-D、SF和1.DHo4例I1.-2恢复正常水平早于部分经典炎症指标SF和1.DHo除I1.-6外，其余6种炎症细胞因子（I1.70、IFN-Y、I1.-8、I1.-2、TNF-Ct和IFN-）转归时间平均值分别为7.8、3.9、5.1、8.0、6.0、2.5d,均小于CRP、D-D、SF和1.DH的转归时间平均值9.7、9.2、13.7和13.8d（图3）。在炎症细胞因子均恢复正常水平时，12例患者状态均出现明显临床转归，无发热、低血压、低氧血症等CRS典型症状。注：CRPCaS.IX）为O二像.1.DHJ1.KSm.I1.6为曰
14、一介素6.I1.-10BSOS-10.IFN-干扰爵Y.1.8为白协抱介录8J1.2为臼就8介赛2.TNF-。为肿癌坏死国子0TFNg为千扰素9图2各指标开始上升时间16注：CRPCg,DQ为D二聚士1.DH为乳Ig我氢第I1.C为白姐簿公蠢6.I1.TO力白如之介索0.正冲出干扰素7I1.8方白的为介素-8.I1.2力3俎的介素-2,TNF-OJW死因Fo,IFN0为千抗亲图3各指标转归时间五、炎症细胞因子对CRS的预测效果以炎症细胞因子为自变量，CRS为目标变量，CRSO级为对照组，绘制出ROC曲线。12种炎症细胞因子对于CRS发生的预测效果见表3。其中I1.-6、I1.70、IFN-和I
15、1.-8预测CRS发生的ROC曲线下面积（AUC）分别为0.917、0.899、0.901和0.807,P均0.001。当I1.-611.30pg/ml时，预测CRS的敏感度为83%,特异度为88%;当I1.-103.03pg/ml时，预测CRS的敏感度为96%,特异度为72%o当IFN-2.41pg/ml,预测CRS的敏感度为91%,特异度为80%;当I1.-827.96pg/ml时，预测CRS的敏感度为83%,特异度为72%o表3I1.-6,I1.T0、IFN-Y和I1.-8对CRS发生的预测效能哂度线下或职就新伯(pg/ml)SS(%)WRS(%)I1.-20.5370.373592I1
16、.Y0.6370.4054484I1.-60.91711.308388I1.-IO0.8993.03为72TNF-O0.6640.624492IFN-Y0.9012.4191OH.-17A0.4140.3056536I1.-IB0.6050.485448011-50.5330.6555764I1.-12P700.5100.093968IFN-O0.6030.277844I1.-80.80727.968372注：159物8介索.TNF力肿金坏死国子.IFN力T抗索讨论本研究采用CBA技术同时检测患者血清中Th1、Th2、ThI7这3种细胞以及单核吞噬细胞分泌的12种炎症细胞因子的水平。活化的Th
17、l细胞释放的细胞因子包括I1.-2、IFN-.TNF-；Th2主要释放I1.4、I1.5、I1.-6和I1.T0;Th17细胞能特异性地产生I1.-17A6,7,8,9。单核吞噬细胞也能通过IFN-a、I1.-8、I1.7B、I1.72P70等细胞因子参与炎症反应10,11o结果发现，不同级别CRS患者I1.-6、I1.70、IFN-.IFN-a.I1.-8均出现明显增高，提示这5种细胞因子对CRS的诊断有重要价值。11_-6可导致血管内皮细胞损伤、补体活化和凝血系统级联反应，导致严重的细胞因子风暴和弥漫性血管内凝血，因此是CRS的重要靶点12。值得一提的是，I1.-17A是近年来的研究热点，
18、大量研究证明这2个细胞因子在各种传染病、炎症和自身免疫性疾病以及癌症中起着关键作用13,但我们在CRS发生发展过程中均未检测到I1.-17A增高。而I1.-4、TNF-a.I1.7B、I1.-5、I1.-12P70表达增高主要与慢性炎症性疾病如类风湿性关节炎，牛皮癣和多发性硬化症相关6,14o我们认为，CRS为急性炎症反应，可能是这些细胞因子在早期CRS阶段不能快速分泌导致临床指导价值受限的原因。文献报道I1.-6、I1.70和IFN-是CRS患者血清中持续升高的核心细胞因子8;也有研究对CAR-T细胞免疫治疗后的患者进行了生物标志物的筛查，发现高水平的I1.-6、可溶性白介素受体、IFN-Y
19、、sgp130与发生严重CRS的风险密切相关15o本研究结果与文献报道基本一致，I1.-6、I1.70、IFN-Y是CRS患者最常升高的炎症因子，所有发生CRS的患者均伴有I1.-6、I1.-10的升高。有意义的是，我们发现I1.-8在CRS患者中普遍增高，认为可以作为CAR-T细胞免疫治疗监测的新指标。CRP.D-D.SF和1.DH这4项是经典的用于监测临床急性感染的指标16,17,18,19o我们综合这4个炎症反应的经典指标分析后发现，在CRS最早发生时，几乎所有患者都可以在CRP、D-D.SF和1.DH这4项指标升高之前监测到I1.-6、I1.70、IFN-Y和I1.-8的升高,特别是I
20、1.-6升高最早出现，这也证实了I1.-6在CRS发生过程中发挥最关键的作用，目前临床已常规利用I1.-6受体拮抗药物托珠单抗来处理CRS20o当患者经有效治疗后，IFN-.I1.-W等炎症因子恢复到正常水平往往早于CRP、D-D、SF和1.DH。据此，我们认为，炎症细胞因子的水平变化对CRS的早期发现和临床转归具有重要价值。在表达水平方面，I1.-4、I1.-6、I1.T0、TNF-Q、IFN-、I1.70、I1.-8表达水平有明显统计学差异，且表达水平与CRS分级具有明显相关性，本研究结果与文献报道较为一致21,22o虽然国外有文献报道I1.-2释放水平与CRS分级正相关23,但在本研究中
21、，I1.-2、I1.77A、I1.-5、I1.-12P70、IFN-a表达水平与CRS发生差异无统计学意义。当前I1.-2、I1.77A、I1.-5、I1.72P70、IFN-与CAR-T细胞免疫治疗后CRS发生的相关性研究以及I1.-6、I1.70、IFN-Y和I1.-8对CRS诊断价值的研究较少，在后续研究中，我们将通过更大样本量的检测结合更长的随访结果建立更为完善的细胞因子谱，以观察不同疾病种类患者在CAR-T细胞免疫治疗后细胞因子水平是否拥有独特的变化特征。综上所述，我们通过CBA技术同时检测了12种炎症细胞因子，发现这些因子在CRS早期发现、CRS分级评估和疾病转归判断中具有重要的临床指导价值，因此，可以作为临床CRS精准诊疗的有效监测指标。
