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1、选择性雌激素受体调节剂对MC3T3-E1细胞生长分化的调节何陨),唐婉容I吴恙2,王璐2,游涛2(6i0106成都，成都大学医护学院：II腔医学教研室I400016重庆，重庆医科大学：附属口腔医院修复科2)摘要目的探讨选择性雌激素受体调节剂(selectiveestrogenreceptormodulator,SERM)雷洛普芬对小鼠颅顶成骨细胞MC3T3-E1分化的调节及其机制。方法体外培养MC3T3-E1细胞，10mol1.的雷洛昔芬和雌激素受体拮抗剂ICl-182780刺激细胞，另设空白对照组，24、48、72h后检测各指标。MTT法检测细胞增殖；微量酶标法检测细胞碱性磷酸酶(alkal
2、iphosphatase,A1.P)活性；实时荧光定量聚合酶链式反应(realtimequantitativepolymerasechainreaction,qRT-PC)检测细胞内B-Catenin、雌激素受体a、(estrogenreceptora,ERa、ER)mRN的表达。结果MC3T3-E1细胞分别加入107mol1.的雷洛昔芬和ICIT82780后，相对于对照组，雷洛昔芬处理组的MTT、A1.P结果增加，B-Catenin、ERa和ERBInRNA的表达增高，有统计学意义(P0.05)；ICI-182780组的MTT、A1.P结果降低，B-Catenin、ERa和ERBmRNA的表
3、达均降低，有统计学意义(P0.05)。结论雷洛昔芬可能通过上调B-Catenin、ERa和ERBmRNA的表达促进MC3T3-E1细胞的增殖分化，而ICI-182780则下调B-Catenin、ERa和ERBmRNA的表达抑制MC3T3-E1细胞的增殖和分化。【关键词选择性雌激素受体调节剂：-catenin：雌激素受体：MC3T3-E1细胞；细胞分化中图法分类号1R329.28;R336;R681.4文献标志码1ASelectiveEstrogenReceptorModulatorsstimulatesthegrowthanddifferentiationofMC3T3-E1cells：inv
4、olvementofERandwnt-cateninsignalsHeYun1,TangWanrong2,WuYang2,Wan1.u2,YouTao2(lDepartmentofDentistry,SchoolofMedicineandNursing,ChengduUniversity,Chengdu610106；2Departmentofprosthodon(ics,AffiliatedHospitalofStomatology,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing.400016China)AbstractObjectiveTbinvestigateth
5、eregulationandmechanismofselectiveestrogenreceptormodulatorraloxifeneonthegrowthanddifferentiationinMC3T3-E1cellsinvitro.MethodsMC3T3-E1cellswereculturedinvitro.Raloxifene(10-7mol1.)andestrogenreceptorantagonistICI-182780(107mol1.)wereaddedintoculturedmediumrespectively.Andtheblankcontrastgroupwasse
6、tted.ProliferationwasassayedbyMTT：TheactivityofA1.Pwasmeasured；Theexpressionsof-cateniestrogenreceptorandestrogenreceptorweredetectedwithqRT-PCR.ResultsMTT,A1.P,andtheexpressionofP-Catenin、ERaandERmRNAweresignificantlyhigherinraloxifene(107mol1.)gloupthanthoseincontrolgroup(V5thecontrol,P0.05);MTT,A
7、1.P,andtheexpressionofP-Catenin、ERaandERmRNAinICI-182780gloupwerelowerthanthoseincontrolgroup(VSthecontrol,PERaandERmRNA.Keywordsselectiveestrogenreceptormodulator;-catenin;estrogenreceptor；MC3T3-E1cells;celldifferentiationSupportedbytheChongQingYubciScienceandTechnologyCommissionIssue(Yubeifinancia
8、leducation.201132).CorrespondingauthorWuYang.E-mail:【基金项目】重庆市渝北区科委课题（渝北财教201132号）【通信作者吴恙，E-mail:骨质疏松症是绝经后妇女的常见病，与体内雌激素水平降低有关I1.雷洛昔芬（raloxifene,R1.X）作为一种第二代选择性雌激素受体调节剂，对某些组织（如骨骼）具有雌激素样作用，对另一些组织（如乳腺、子宫内膜）具有抗雌激素样作用。与雌激素替代疗法相比，雷洛昔芬既能治疗骨旗疏松症，乂可显著降低患乳腺癌、子宫内膜癌的风险性，因而成为防治绝经后骨质疏松的较为理想的药物。Wnt信号在骨质疏松方面的研究已受到广泛
9、的关注，目前被认为在成骨分化与骨量调节方面具有重要的作用。对于庞大的Wnl信号系统来说，B-catenin是介导WnI信号通路从细胞膜至胞浆再进核传递路径的枢纽分子口用。雷洛昔芬是否可以通过此途径刺激成骨细胞的增值和分化，具体的作用机制仍不十分清楚。本实验将雷洛昔芬和雌激素受体拮抗剂ICl-182780分别作用于MC3T3-E1细胞，观察它们对细胞增殖和A1.P活性的影响，同时采用qRT-PCR的方法观察细胞株中-catenin.ERa和ERB的表达情况，探讨wnt/B-catenin通路是否参与选择性雌激素受体调节剂对成骨细胞增殖的作用过程。1材料与方法1. 1细胞株及试剂MC3T3-E1细
10、胞株购至中国科学院细胞库，雷洛昔芬和IeI-182780均购至美国Santa公司，DMSO（美国Sigma公司），MTT（美国Sigma公司），碱性磷酸酶检测试剂盒（南京建成），RNA抽提试剂盒（北京百泰克），cDNA链合成试剂盒（MBI）,2PCRmastermix（康为世纪），2XSYBRreal-timePCRpremixture（北京百泰克）,引物合成由北京三博远志生物技术有限公司完成，MEM培养基（美国HyQOne公司），胎牛血清（美国HyClone公司）。1.2 仪器超净工作台（苏净集团安泰公司），CXh细胞培养箱（上海易亮医疗公司），倒置显微镜（尼康），冷冻离心机（HEMN1.E
11、生产），蛋白核酸分析仪（瑞典安玛西亚公司），DYY-6C型电泳仪（北京六一仪器厂），凝胶成像仪（美国Bio-Rad公司），荧光定量PCR仪（美国Bio-Rad公司），的标仪（奥地利TECAN）1.3 方法1.3.1 1细胞培养小鼠颅顶前成骨细胞MC3T3-E1细胞接种于含10%胎牛血清的a-MEM培养基中，置于37C、5%CO2、饱和湿度的Ca培养箱中常规培养，每2天换液1次，每45天传代1次。1.3.2 MTT法测细胞增殖取对数生长期的MC3T3-E1细胞，0.25%胰酶消化后离心，PBS清洗、离心、重悬后细胞计数，接种于96孔板中，细胞数为4XIO3个/孔，37、5%CO2细胞培养箱内孵育
12、8h使细胞贴壁后，用不同的培养液（对照组仅加培养液，其他组加入含药培养液）分组培养：对照组：雷洛昔芬（10-7mol1.）组：ICI-182780（10-7mol1.）组。每组设5个复孔，另设调零孔。分别于继续培养的24、48、72h检测吸光度值，终止反应。每孔加入MTT（5g1.）20Ul,继续孵育4h后，弃上清。每孔加DMSO150心,振荡IOmin,使结晶物充分溶解显色后，选择49Onm波长，在酶标仪上测定各孔的吸光度值（490）。细胞增殖率=（处理组。（490）值一对照组。（490）值）/对照组。（490）值100%,细胞抑制率=（对照组D（490）值一处理组D（490）值对照组D（4
13、90）值X100%。1.3.3 微量酶标法测细胞的A1.p活性分组同1.3.2,以细胞数4X103/孔的接种于96孔板，二组给药，一组空白对照，37*C,5%Co2条件下培养72h,每24小时取细胞培养上清液采用微量酶标法操作，每组设3个复孔，另设酚标准孔和调零孔。具体步骤如下：5Ul细胞培养上清液，与50缓冲液和50W基质液混匀，37水浴15min,再加显色剂150立即混匀，于酶标仪520nm波长下测定各孔的吸光度值（520）,记录结果。A1.P活性增加率和抑制率的计算公式与MTT增殖率的和抑制率的计算公式相同。1.3.4 qRT-PCR检测B-Catenin、ERa和ERB的表达MC3T3
14、-E1细胞以3X10%nl接种于75ml的培养瓶，继续培养8h后加入药物，分组同1.3.2,分别于24、48、72h后收集各组细胞，按照试剂盒说明抽提细胞内总RNA,并用蛋白核酸分析仪测定RNA溶液的浓度和纯度，1%琼脂糖凝胶电泳可见清晰的18S、28S两条带。取IHg总RNA逆转录合成cDNA0然后，采用SYBRGreenreal-timePCR试剂盒对目的基因进行定量检测，分别取1HICDNA,上游和下游Primer各11,2XPremix12.5U1.灭菌蒸储水9.5Ul,反应体系25口1。反应条件：95,C2min,95C15s,退火15S（具体温度见表1）,72延伸40s,40个循环
15、。PCR扩增B-Catenin、ERa、ER,以-actin为内参，通过计算阈值Ct值评估mRNA水平，Ct值用B-actin标化，采用双DE1.T法相对定量进行计算。表1基因序列及其引物基因引物序列（5-3）退火温度产物长度上游Ccatcacgacactgcataatct-catenin下游AGeCAAGAATnCACGTTTGTT59122上游CGOCnCTACAGGTCTAATERa下游GGnCnGTCAATGGTGC55257上游CTTGGTCACGTACCeCTTRCERB下游GTATCGCGTCACTCCT5S250上游TGGAATCCrGTGGCATCCATGAAAC-actin
16、下游Taaaacgcagctcagtaacagtccg593731.4 统计学分析采用SPSS16.0软件进行统计处理，数据以士s表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，均数间的两两比较采用SNK-q检验，MTT增值率或抑制率的不同时间的比较采用KrUSka1.WaHiS秩和检验，ERa和ER同一药物、同一时间点的qRT-PCR结果采用t检验，P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1 MC33T3-E1细胞增殖各组的细胞增殖结果见表2。雷洛昔芬组MTT测试结果高于其余两组，而ICl-182780的增殖结果在3组中最低，表明雷诺昔芬可促进细胞增殖，IC1.I82780则抑制细胞增殖，差异有统计
17、学意义（P0,05),72hB-Catenin表达较24、48h降低(KO.05)。雷诺昔芬组和ICIT82780组ER和ERBmRNA的表达，均在48h表达增高/降低，72h与48h相比，无统计学差异(处0.05)。在同药物相同时间组里，ERa和ERBmRXA的表达差异量，除ICI-18278072h组外，均无明显差异(KO.01)、表4细胞B-Catenin、ERa和ERBmRNA的相对表达水平5=3,Xs,2AS)组别时间B-cateninHRaER雷洛昔芬24h1.231+0.0662.552+0.1302.19910.072组48h1.542+0.0533.025+0.1412.99
18、3*0,07572h1.483H).0472.87640.0702.935*0.060ICI-18278024h0.793+0.0430.158p.0420.646i0.092组48h0.7190.0210.29600200.354+0.03372h0.60吐0.0560.300+0.0170.398+0.006各组不同时间的A1.P活性结果见表3。相对于对照组，雷洛昔芬组A1.P活性增高，而ICIT82780组的A1.P活性降低，差异有统计学意义(3.05)、雷诺昔芬增加了A1.P活性，并在48h活性增加率最高，为(30.8815.614)%,随后增加率下降，72h与24h无统计学差异(P0
19、.05),ICI-82780抑制了A1.P的活性，但在时间上活性抑制率变化不大，3个时间段比较无统计学差异(P0.05)表3不同组别、不同时间细胞A1.P值(=3,Xs,金氏单位/100ml)24h48h72h空白对照组10.395+0.94821.954+0.85329.566+1.129雷洛普芬组12.015+1.11328.416+1.219*34.121+0.956ICl-I82780组9.049+0.966,18.449+0.66425.398+0.638ba.b：PERa和ERBmRA的表达水平见表4。雷洛昔芬组B-Catenin、ERQ和ERBmRNA的表达水平均较时照组增高，而
20、1CIT82780由于其对ER通路的抑制作用，-catenin.ERa和ERBmRNA的表达水平较对照组降低，差异均有统计学意义(K0.05)c雷诺昔芬组6-CateninmRNA表达48h表达增高，72h与48h相比，无统计学差异(/0.05),ICIT82780组24h与48h-cateninmRNA表达变化不大3讨论选择性雌激素受体调节剂药是一类人工合成的非脩体化合物，其作用具有组织特异性，在某些部位(如肿瘤)起到阻断雌激素受体的作用，而在其他部位(如骨骼)则起到刺激雌激素受体的作用。R1.X是非类固醇类，苯噪酚化合物，属第2代SERMS,是第一个被批准用于预防和治疗绝经后骨质疏松的SE
21、RMsoICI-182780(FaSIodeX)属于留体类纯抗雌激素剂，为17p-雌二醇的7-取代衍生物，能下调雌激素受体水平，无雌激素激动活性。国外在临床上开展了R1.X治疗绝经后骨质疏松症疗效的随访观察研究，与对照组相比，长期服用R1.X,可降低骨转换率、增加骨密度、抑制骨吸收6叫Olivier等冏研究结果显示R1.X可以抑制MC3T3-E1的凋亡。以往研究表明，R1.X具有直接刺激成骨细胞的功能，可促进成骨细胞的增殖、分化，调节骨形成、骨吸收和骨再建明。同样有实验证实，加入ICI-182780后，成骨细胞的增殖作用被抑制。国内外的许多学者研究均表明，R1.X的作用在10-9-10-7mo
22、l/1.浓度范围内与浓度成剂量相关，并且高浓度组(10-7mol/1.)对成骨细胞的刺激更为明显，因而我们的实验选择了R1.X和ICI-182780的l(Pmol1.浓度，结果显示，R1.X组的MTT和A1.P测定结果最高，对照组居中，ICl-182780组最低(P0.05),表明R1.X可促进体外培养的MC3T3-E1细胞的增殖和分化，A1.P活性增加，并且我们分别测了24、48、72h的MTT和A1.P的值，结果还显示，R1.X的这种促MC3T3-E1的增殖作用在24h达到峰值，随后下降，对MC3T3-E1分化的影响则是在48h改变率最高。而ICI-182780则抑制了细胞的增殖和分化。雌
23、激素受体是核受体超家族成员之一，包括ERa、ERP两种类型，SERMS通过与ER两种亚型结合而发挥生物学作用U1.近年研究表明，除了与雌激素反应元件(eslrogenresponseelement,ERE)直接结合的经典途径外，ER还可激活其他通路，如AP-I效应元件【，或与其他细胞内信号通路相互影响。本实验设计分别给予MC3T3-E1细胞以10-7mol1.的R1.X和ICl-182780,在不同的时间点测定B-Calenin、ERa和ERBmRNA的表达水平。从qRT-PCR的结果可以看出,通过与ER的特异性结合,上调了ERa和ER的基因表达，发挥雌激素样作用，而ICI-182780则下调
24、了ERa和ER的基因表达,从而发挥抗雌激素作用。两种药物对ER基因表达的效应随着时间的增加而增加，但48h与72h无明显的差异。另外，关于两受体亚型中哪一型在骨组织中优势表达，目前尚无一致报道。近年来一系列针对ERa和ER基因敲除的动物实验研究表明，ERa和ERB两者共同参与雌激素的骨保护效应，其中ERa为主要介导者，ERB与之存在着竞争互补的辅助关系1131.结合本实验，R1.X组和ICI-182780组在同一时间段ERa和ERBmRNA的表达量差异不明显，说明R1.X和ICI-182780同ERcx和ERB结合的亲和力都高，在基因水平上无明显的优势表达亚型，至于两亚型在蛋白水平上是否有差异
25、，则需进一步研究。Wnt/-catenin信号通路在调节成骨活性及骨细胞功能方面的发挥了重要作用，该通路的相关基因被认为与骨质疏松密切相关。-catenin在成骨细胞中有广泛的表达，是经典Wnt信号通路的关键中介。在体外实验的研究中发现，敲除鼠成骨细胞B-catenin,导致骨钙素表达的推迟与减少，同时也降低了成骨细胞的矿化。Y.E.Chung等通过使用雷诺昔芬治疗绝经后骨质疏松,发现血液中Sderostin的浓度明显降低，而Sclerostin可抑制WntZ-catenin信号通路的传导1。根据B-Catenin基因的定量结果可以看出，R1.X促进了B-catenin基因的表达，但是同ERa
26、和ER的mRNA表达增加相比，B-catenin的mRNA表达只是略有增加，在时间效应上同ER的表达规律一样，仍是随着时间的增加而增加，48h与72h无明显的差异。认为R1.X在启动ER通路的同时可以促进Wnt通路的信号传递，但仍以经典的ERE途径为主。由此可见，Wnt信号通路和ER通路之间存在复杂的信号传递和相互作用，具体的机制尚需进一步研究。综上所述，骨质疏松症已成为人们广泛关注的公众健康问题，患骨质疏松症的妇女骨折的发生率增加，极大的影响了她们的生活质量U纥SERMs的出现为绝经后骨质疏松的治疗提供了一个新的选择，随着雷诺昔芬在临床上应用越来越广泛，对其细胞及分子作用机制的研究也逐步深入
27、。我们的实验观察了SERMS对BYaIenin基因表达的影响，说明雷诺昔芬可以通过WntZB-catenin信号通路来引起骨的改建，为探讨SERMs治疗骨质疏松的机制，也为我们下一步关于成骨细胞响应机械力学刺激和SERMs共同作用的分子机制研究提供了一定的依据。参考文献：1 NotelovitzM.Estrogentherapyandosteoporosis:principles&practiceJ.AmJMedSci,1997,313(1):2-12.2 HansdottirH.Raloxifeneforolderwomen:areviewoftheliteraturej.ClinInter
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