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1、组织化学技术,序 言,现代组织化学是介于细胞生物学、组织学、生物化学及分子生物学之间的一门新兴边缘学科，它已渗透和应用于生命科学的许多领域。近几十年来，组织化学发展突飞猛进，日新月异，已产生了许多分支，各类分支虽有特点，但都源于组织化学。因此，组织化学已成为医学生物学科研过程中必备知识之一。,组织化学（histochemistry）/细胞化学(cytochemistry)是运用物理学、化学、免疫学、分子生物学等原理与技术，对组织与细胞的化学成分、化学反应及其变化规律进行定性、定位和定量研究的科学。主要研究对象是生物大分子(如核酸、蛋白质、酶、多糖和脂类等)在细胞内的结构和功能活动中的分布与变化
2、以及亚细胞组分和细胞器在整个生命活动中的作用等。,一、组织化学发展简史,组织化学是在组织学和化学的基础上发展起来的，早在十九世纪，人们把显微镜与化学技术结合起来，开始观察组织中的化学反应，解释生物界中的生理现象。,(1890一1920)随着显微镜的改进和组织细胞学染色技术的发展，组织细胞化学开始从生理组织学的概念转为显微化学。依赖细胞内的某些酶催化特异底物的化学反应形成酶细胞化学。70年代由于细胞显微分光光度法和荧光显微光度法的建立，使细胞化学的成分得以定量，形成了定量细胞化学。,80年代电镜细胞化学可以观察化学成分的亚细胞定位。80 90年代，先后流式细胞术、激光扫描共聚焦显微技术出现。,激
3、光扫描共聚焦显微技术，相似于对单个细胞进行细胞“CT”分析，并能研究活细胞和定量分析细胞内的遗传物质DNA、RNA、细胞器的酶含量，细胞内各种荧光标记物(包括分子和离子的浓度及其分布，如Ca2+和pH值等)，,流式细胞术是一种快速对单细胞化学成分定量分析的新技术，每秒可测上万细胞信息，从一个细胞中，可同时测量多种参数。,二、组织化学技术的基本要求,1尽可能地保持组织和细胞生前的形态结构、化学成分和酶的活性。必须选择适当的固定液和恰当的处理方法。2化学反应要求在细胞或组织内进行，须有定位的准确性。为此必须控制反应的时间和条件，使反应的产物不移位，不弥散。,3反应物须有显色性和定量的可能性，即必须
4、是有色的沉淀或结晶，沉淀颗粒细小连续、色深、不溶，并能保留在原位上。颜色深度要与物质含量或酶的活性具有一定的比例关系。4反应物要有稳定性和重复性，以利于观察研究和验证。5反应物有灵敏性和特异性，以利于对比观察。6反应产物有对照，否则难以判断其结果的可靠性。,三、细胞化学技术显示的化学成分：,蛋白质：显示某些特定蛋白、某些氨基酸或功能基；RNA和DNA；糖类：如糖原、粘多糖和糖脂等；脂类：如中性脂肪、磷脂和胆固醇等；酶： 包括水解酶(如磷酸酶、酯酶、肽酶)、氧化酶(琥珀酸脱氢酶、过氧化酶、细胞色素氧化酶)和激酶、转移酶等； 生物胺：5-羟色胺、肾上腺素类、组织胺等；特异抗原：其化学本质可能是多肽
5、、蛋白、糖蛋白等；无机盐和微量元素：如铁、铜、锌、钴、镁等。,四、细胞化学染色的原理：,细胞中的化学成分和其相应的底物呈一系列的化学反应，形成在显微镜下可见到的反应产物。常用组织化学方法的原理如下：,一）金属-金属盐沉淀反应原理,利用金、银、铜、铁、铝、钴等金属化合物在与细胞化学成份反应过程中生成有色沉淀，借以辨认所检查的物质。如磷酸酶分解磷酸底物后，可与铅/钴形成磷酸铅，在硫存在时形成 PbS或CoS的棕黑色沉淀，从而标出酶所在部位。,二）偶氮偶联法原理,用人工合成的酶底物，在酶的作用下产生分解产物，后者与重氮盐结合，引起偶氮偶联反应，而形成不溶性的偶氮色素。萘基磷酸钠 磷酸氢二钠萘酚萘酚F
6、AST BLUE 偶氮染料,碱性磷酸酶水,三）过碘酸Schiff氏剂反应法原理,利用细胞中多糖放出的醛基可将Schiff氏剂中的无色品红转变为紫红色化合物，可于显微镜下观察到。 这种反应多用于显示细胞中的糖类和细胞核内的DNA，前者称为PAS反应，后者称为Feulgen反应。此外，还可用于检查细跑中的粘蛋白和不饱和脂类。,四）联苯胺法原理,过氧化氢酶分解H2O2产生新生氧，后者可将无色联苯胺氧化，生成联苯胺蓝，进而变成棕黑色化合物。此法主要显示细胞中的过氧化物酶。,五）色素形成法原理,是一组显示酶定位的常用方法，其原理是在酶的作用下，使无色的化学物质在细胞局部形成色素沉着，以此确定待测酶的存在
7、部位。 色素形成法主要包括四唑盐法（NBT、MTT）、靛蓝形成法等。其中四唑盐法用于定性各种氧化还原酶、多种脱氢酶、转移酶。靛蓝反应用于酯酶、磷酸酶等,六）底物标记法原理,底物标记法是指用同位素、色素、金属标记酶的底物，在酶的作用下，底物分解后沉着于酶所在的部位。最常用的底物标记法为放射自显影术，即70年代后兴起的同位素标记技术，其原理是用同位素标记底物，在酶的作用下，带有标记的分解产物沉着于酶所在组织结构上，通过放射自显影过程对沉着于酶所在部位的底物进行捕捉。,七）荧光染色与免疫荧光法原理,荧光染色法是用特定的荧光染料对组织细胞中的化学成分直接染色，在荧光显微镜下对这些成分进行直接观察。例如
8、吖啶橙可以同时对细胞内的DNA和RNA染色，细胞核的DNA呈亮绿色-黄绿色荧光，胞质和核仁的RNA呈桔红色荧光。,组织与细胞材料的制备,一、组织取材注意事项,1.注意防止人为因素的影响 刀和剪要快，刀要足够长。2.组织块的大小 大小可根据需要而定，一般长1cm宽1cm厚0.20.3cm。 3.动物和人体组织的取材位置 要视研究目的，观察部位而定。取材时应考虑：主要病灶，病灶与正常组织交界处，远离病灶的正常组织。,4.取材时间 原则上，应尽快取材，但较大的手术标本如胃、肺、肠等器官，最好先固定后取材。组织要求离体后30min内浸入固定液，尤其是开展分子生物学工作。动物组织取材要求心脏还在跳动时取
9、材，脑组织和神经组织应采用灌注预固定后，再进行后固定。 5.注意包埋方向，包埋时要平整。6.保持材料的清洁7.切除不需要的部分，骨组织需脱钙8.明确编号，登记,培养的活细胞可分贴壁和悬浮二种。贴壁细胞处理方法有：（1）细胞大量培养后，经消化将细胞制成悬液（106）涂在包被有切片粘合剂的载玻片上，凉干后固定。（2）将细胞直接培养在盖玻片上。（3）将细胞直接培养在6孔或9孔板上，固定后备用。 胸水、腹水、尿液、脑脊液等体液多而细胞较少的标本，可用离心沉淀法收集细胞。,二、细胞材料的准备,三、组织标本的固定,1.目的(1)防止组织细胞的死后变化，防止自溶和腐败，以保持组织细胞的固有形态(2)使细胞内
10、的蛋白质、脂肪、糖和酶等各种抗原成份转变成不溶性物质，以保持它原有的结构与生活时相仿,（3）防止细胞过度收缩或膨胀而失去其原有形态结构，固定剂兼有硬化作用（4）经过固定的组织能对染料产生不同的亲和力而着色清晰，便于辨认。,2.固定液的种类,固定液分为单纯固定液和混合固定液两种。（1）甲醛固定液： 是一种还原剂，呈酸性，原液浓度为37%40%，配成固定液的浓度为4%甲醛。配制时取甲醛原液10ml，加双蒸水或缓冲液至100ml，为甲醛固定液（习惯上称为10福尔马林） 。 甲醛渗透力强，固定均匀。但脱水后有较大收缩，在某些方法中要求中性甲醛，可在原装瓶内放入碳酸镁，pH为7.6，可长期保持中性。甲醛
11、固定后，通常需用流水冲洗12 24小时,否则影响染色效果。,(2) 4多聚甲醛固定液(3) Bouins液 苦味酸饱和水溶液 75ml 甲醛 25ml 冰醋酸 5ml 渗透速度快，收缩小，组织固定均匀，保持结构完整，适合于各种胚胎连续切片，对于肝、皮、胰腺特殊染色效果好。固定为1224小时，但固定过久，对碱性染料着色不利。,（4）Carnoy氏液 纯酒精 60ml 氯仿 30ml 冰醋酸 10ml 此固定液渗透速度快，2mm以下小块组织固定时间24小时，它是细胞核极好的固定液，适合于细胞分裂、RNA、DNA及糖元等固定。固定后直接入纯酒精脱水。,(4) PLP固定液：过碘酸-赖氨酸-多聚甲醛固定液。该固定剂较适合于富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。(5) Methacarn固定液：甲醇60ml，氯仿30ml，醋酸10ml，混均后4保存备用，对核内抗原的保存效果较好。(6) 丙酮及醇类固定剂：丙酮、乙醇类固定剂其固定原理主要是使蛋白质沉淀而发生固定作用。酒精是一种还原剂，用于组织固定以95%的浓度为宜，酒精固定后的组织细胞核着色不良，一般用于糖元的固定。甲醇、丙酮常用于细胞固定。,固定时间要视组织块的厚薄、固定液的种类及浓度、温度而定。原则上，组织块大小与固定时间成正比，固定液的穿透力及浓度与固定时间成反比。组织固定后必须彻底冲洗。,
