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1、本次实验课流程,课件讲述 40min 实验演示 20min流式细胞仪硬件及软件介绍 30min上机检测 40min解惑答疑 15min,医学结构生物学研究中心 柳卫凰,细胞表面分子的检测与分析,流式在细胞表面分子检测中的应用,免疫细胞及其亚群的检测与功能分析例如：T细胞、B细胞、NK细胞、DC细胞等血液系统细胞表面标志的研究例如：急性白血病的初步诊断与检测、CD34+造血干细胞研究、血小板分析辅助诊断相关疾病等细胞群体及细胞表面标志变化的监测例如：测定因试验或临床治疗引起的某些细胞表面标志的变化细胞表面标志构成性质的分析例如：蛋白、糖蛋白、类脂结构、性质、比例的分析,标本来源,外周血 全血溶血
2、、PBMC骨髓穿刺液 体液、灌洗液实体组织 新鲜组织、石蜡包埋样本培养的细胞 原代细胞 细胞系：贴壁细胞、悬浮细胞,一、新鲜实体组织样本的制备 酶消化法。 常用的酶类试剂：胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胶原蛋白酶等 机械法。1、剪碎法 2、网搓法 3、研磨法 化学处理法。 常用试剂：0.2%EDTA 0.25%胰酶+0.2%EDTA注意：除消化过程外，其余步骤最好在4度环境下操作，提高 细胞活性。,标本制备,标本制备,二、全血标本的制备 “ABC”溶血（Beckman） 取肝素钠抗凝的外周血100ul，荧光标记完成后，依次加入A液600ul，轻轻振荡15s；B液260ul, 轻轻振荡15s；
3、C液100ul, 振荡10s，免洗上机检测。 “ACK”溶血（自配） 以1：3的比例取肝素钠抗凝的外周血与ACK溶血剂混匀，室温放置10min，离心去上清，再加入溶血剂溶血，反复23次，至红细胞完全溶解。细胞重悬后，再进行荧光标记。,标本制备,三、外周血单个核细胞的制备（1）取外周血2ml，肝素抗凝，生理盐水稀释成4ml，混匀；（2）沿试管壁缓缓加入4ml淋巴细胞分离液Ficoll，勿用力过大；（3）离心2000r/min，20min，离心后分层，上层为血浆层，中层 为分离液层，底层为红细胞层；（4）用吸管将上层与中层之间的单个核细胞层吸出，用生理盐水 洗两遍，PBS重悬；（5）荧光标记。,四
4、、贴壁细胞单细胞悬液的制备 （1）将培养细胞用0.04EDTA或0.25胰酶消化37分钟， 至光镜下见到贴壁细胞变圆还没有漂浮为止，弃消化 液，加PBS； （2）用吸管将细胞从瓶壁上轻轻吹打下来，移入离心管中； （3）离心，1000r/min，5min； （4）加PBS洗两遍； （5）PBS重悬，将细胞吹打均匀； （6）荧光标记。,标本制备,标记方法,直接免疫荧光法 特点：操作简单、省时；特异性强；结果判断较简单。间接免疫荧光法 特点：适用范围广；抗体相对便宜；操作费时；易产生非特异性染色，结果不易判断。（建议只用于单标检测）直接、间接混合染色法 染色原则：一般情况下先间接后直接，特殊情况下可
5、先直 接标记。,推荐！,对照设置,阴性对照 调节荧光探测器放大倍数，确定带测标本的基础荧光域值。常用的有：同型对照、封闭抗体对照、阴性细胞对照阳性对照 检测抗体特异性或确定实验方法的稳定性、准确性。空白对照 确定待测标本的基础荧光域值或检测染色方法是否成功。 补偿对照 多色荧光标记时，用于荧光光谱重叠的调节。,同型对照（Isotype Control）,用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面的Fc受体而产生的背景染色与染色的单克隆抗体 相同种属来源 相同免疫球蛋白及亚型 相同荧光素标记 相同剂量和浓度 由未免疫动物血清纯化而来,双色标记荧光补偿,口诀：横平竖直,荧光补偿对照,注意事项,样本的采
6、集、储存样本的染色全血样本的溶血效果流式实验对照的设置,样本的采集,手术切除的新鲜标本取材时，要避免出血或组织坏 死。深低温保存，以免组织发生自溶，DNA降解，造成检测结果的误差。采集静脉血样本时，要避免发生溶血。收集培养的细胞时，要注意选择消化的方法和试剂。,样本的储存,原则：时间越短越好肝素抗凝的外周血和骨髓：室温 72小时EDTA抗凝的标本：室温 24小时ACD抗凝的外周血：室温 72小时ACD不推荐用作骨髓穿刺液的抗凝粒细胞、血小板功能检测：即刻检测单核细胞表面抗原分析： 1小时，4嗜酸性粒细胞表面抗原分析： 24小时，4淋巴细胞免疫表型与DNA含量的分析： 72小时,样本的染色,影响
7、抗原抗体反应的因素 电解质、反应温度与时间 、PH值（7.27.4）流式抗体的选择 根据流式细胞仪的类型选择抗体 抗体应用级别、滴度和使用量的选择 根据抗原表达量选择抗体,溶血，即裂解红细胞。它是流式细胞术分析白细胞的先决条件。溶血不好，白细胞群不能很好分开，溶血好坏直接影响检测结果。因此，必须对溶血过程进行严格控制。,全血样本：溶血效果很重要,影响溶血的因素：采血过程 溶血剂的使用 实验操作过程,结语,流式细胞术的样本制备没有一个黄金标准最佳样本制备方法需要根据具体情况独立设定评估,常用的荧光染料,荧光染料 激发波长 (nm) 发射波长(nm) 用途 颜色 FITC 488 525 免疫荧光
8、 绿色 PE(RD1) 488 575 免疫荧光 橙色 ECD 488 620 免疫荧光 橙红 PeCy5 488 675 免疫荧光 红 PI 488 620 DNA染色 橙红 PECy7 488 755 免疫荧光 深红 PerCP 488 670 免疫荧光 深红,参考书籍,实用流式细胞术彩色图谱王书奎主编 流式细胞术基本原理与实用技术梁智辉主编临床流式细胞分析 王建中主编流式细胞术 杜立颖主编,实验：人外周血T淋巴细胞亚群的 检测与分析,淋巴细胞,单核细胞,粒细胞,这三群细胞分别由具有不同功能的细胞组成这些细胞数量不等，甚至非常稀少这些细胞表达不同的标记物，是用来区分它们的基础,1.取新鲜抗
9、凝血100ul，置于FCM测量管中；2.直接标记法：加入带荧光标记抗人的单克隆抗体 10ul，充分混匀，4闭光孵育2030min; 3.加入溶血剂A液600ul, 轻轻振荡15s, 加入溶血剂B液260ul, 轻轻振荡15s， 加入溶血剂C液100ul, 振荡10s,上机检测。 ACK溶血剂:加入2mlACK溶血剂，充分混匀，反应5min, 1000r/min离心5min，去上清；重复一遍，用PBS洗涤1遍，收集细胞上机检测。,实验步骤,ABC溶血剂配方,A: 0.12%甲酸 (超纯水配置)B:碳酸钠 6.0g/L ; 氯化钠14.5 g/L ; 硫酸钠 31.3g/L (超纯水配置)C:多聚
10、甲醛 10.0g/L( PBS配置),ACK溶血剂配方,150mM(8.025g)NH4Cl 10mM(1.01g) KHCO30.1mM(0.0372g)Na2EDTA调PH至7.2-7.4，定容至1000ml无菌滤膜滤过，4保存,实验分组,A:同型对照管或空白对照(调节电压)B: 单标补偿管(电压不变,调节荧光补偿)C: 双标样本检测管,荧光补偿,“A门”内CD3/CD4的表达,“A门”位置变化引起的改变,“A门”位置变化引起的改变,小鼠脾细胞CD3+/CD4+的表达,思考题、实验报告,1、同型对照、空白对照、补偿对照各有什么 意义？2、多色荧光标记时如何设置对照？3、样本处理过程中要注意哪些事项。实验报告：请根据你科研的需要设计一个完整的流式实验。内容包括：实验原理、材料与方法、实验步骤、实验结果等。,Thank you！,
