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1、TSA联合基因工程腺病毒 H101治疗人食管癌裸鼠皮下移植瘤的研究冯婷1刘霞1 董子明#1#通讯作者：男 54岁 教授 博士研究生导师 研究方向：病理与病理生理学Email：dongziming（1郑州大学基础医学院病理生理教研室 河南 郑州 450052）摘要 目的：研究TSA药物对基因工程腺病毒 H101杀伤食管癌 EC9706细胞作用的影响，探讨HDAC抑制剂在腺病毒载体基因治疗中应用的可能性和作用机制。方法：先成瘤后治疗组，构建裸鼠食管癌移植瘤模型，待肿瘤长出1W后，分组：TSA治疗组（瘤内注射1.0mol/LTSA /只/次），H101治疗组（瘤内注射50108 vp/d），TSA联
2、合H101治疗组即先注射TSA，第二天注射H101，注射剂量同上。另设空白对照组，以上治疗持续两周，治疗结束取瘤组织检测。先处理后成瘤组分别采用浓度为4.0mol/LTSA体外处理EC906细胞48h，浓度200108 vp/dH101处理EC9706细胞48h，及二者联合处理EC9706细胞48h，同样设置空白对照组，将处理后的细胞种植于裸鼠皮下构建裸鼠食管癌移植瘤模型。待瘤体长出2周后，取瘤组织用 Real Time PCR、Western-bioting和免疫组化法检测 CAR在移植瘤中的表达，测量肿瘤体积。结果：无论是先处理后成瘤组还是先成瘤后治疗组，TSA组和TSA联合H101治疗组
3、均可上调裸鼠食管癌移植瘤组织中CAR蛋白的表达，相比与对照组和H101治疗组均有明显差异(P0.05)。而对人食管癌 EC9706细胞裸鼠皮下移植瘤大小影响TSA联合H101治疗组与TSA组、H101单独治疗组相比均有明显差异(P0.05)。各治疗组与空白对照组相比，差异均有统计学意义(P0.05)。结论：TSA能增强H101治疗人食管癌裸鼠皮下移植瘤，其作用机制是TSA上调了食管癌CAR蛋白的表达。关键词：柯萨奇-腺病毒受体（Coxsackie and adenovirus receptor，CAR)；TrichostatinA（TSA)；基因工程腺病毒； EC9706； 裸鼠中图分类号：R
4、735.1；R730.231 文献标识码： A TSA combined genetically engineered adenovirus H101for treatment of tumor tissue of nude mice transplanted with humanesophageal cancer cells fengting1 liuxia1 dongziming1#Department of Pathophysiology, College of Basic Medical Sciences, Zhengzhou University, Zhengzhou 450052,
5、 ChinaABSTRACT Objective：the study is to observe TSA drug for the effect of genetic engineering adenovirus H101 killing esophageal cancer EC9706 cell ,and discuss the action mechanisms and the possible applications of HDAC inhibitor in adenovirus vectors for gene therapy .Methods: the first examinat
6、ion is treatment after growing tumour . the examination following is building nude model of transplanted tumor in esophageal cancer ,and grouping when the tumor growing one week .TSA treatment group (injection TSA 1.0mol/LTSA / only / time);H101 treatment group(injection H101 50 108 vp / d); TSA and
7、 H101 treatment group, the fist to inject TSA , and the next day to inject H101,the injection dosage as above. another group is matched group. Obtaining tumor tissue after treating two weeks. the section examination is treatment before growing tumour .one group is utilizing the concentration of 4.0m
8、ol/LTSA to treat EC906 cells 48h, tne second group is utilizing the concentration of 200 108 vp/dH101 to treat EC9706 cells, 48h, tne third group is the two drugs injoined to treat EC9706 cells 48h, another group is matched group . the treated cells grown undern skin of nude mice to built xenograft
9、model of esophageal cancer . After two weeks ,obtaining the tumor tissues and using Real Time PCR, Western-bioting and immunohistochemistry to detect expression of CAR in the tumor and measure tumor volume.Results:. Whether the first examination of tumor or the section examination ,compareing the ma
10、tched group and only H101 treatment group ,TSA treatment group and TSA associating with H101 treatment group able to rise the expression of CAR protein in esophageal cance xenograft tissue in nude mice(P 0.05). but the TSA combined H101 group to the human esophageal cancer EC9706 cells in nude mice
11、, compared with H101 or TSA group ,was all significant difference (P 0.05), Each treatment group and blank control group, the differences were statistically significant (P 0.05).Conclusion : TSA can enhance the H101 treating nude mice subcutaneou transplanted tumor of human esophageal carcinoma . Mo
12、reove, the combined TSA and H101 drug has a best therapy .The mechanism possiblly is TSA increasing the expression of CAR protein in esophageal carcinoma . KEY WORDS：Coxsackie and adenovirus receptor，CAR； TrichostatinA（TSA)；Genetically Modified Adenovirus；Nude随着基因治疗理论和技术的发展，腺病毒作为溶瘤病毒或基因治疗的载体已应用于恶性肿瘤
13、的治疗，复制选择性腺病毒(Replication-selective adenoviruses)以其独特的优势成为肿瘤病毒治疗研究最为广泛的病毒热点之一，通过遗传工程改造后使其能够通过特异性在肿瘤细胞中复制、裂解肿瘤细胞，而对正常的细胞无杀伤力。目前已成功构建了多种溶瘤腺病毒1-2。H101就是其中一种溶瘤病毒药物，它是利用了基因重组删除了人5型腺病毒E1B部分基因片段所构建的。但在很多研究中表明：H101作为单一的治疗剂效果并不明显，而且在不同肿瘤中治疗效果存在显著差异3-4。临床研究表明，造成这种差异的原因是受到组织器官表达柯萨奇病毒腺病毒受体的影响。而组氨酸去乙酰化酶（Histone d
14、eacetylase，HDAC)是最近研究最多的抗肿瘤药物，它可以调节肿瘤的分化、迁移、转移和血管生成。已有研究表明，它的抑制剂TSA对肿瘤组织CAR的表达有影响。那么TSA药物联合H101药物能否提高溶瘤效应？我们用TSA、H101、以及TSA联合H101分别治疗人食管癌裸鼠皮下移植瘤，在动物体内来验证TSA能否可以增强基工程腺病毒H10以治疗人食管癌裸鼠皮下移植瘤，其作用机制是TSA上调食管癌柯萨奇-腺病毒受体（CAR）的表达。1 材料与方法 1.1 材料 食管癌细胞由郑州大学基础医学院病生教研室提供，RPMI-1640培养基购自美国HyClone公司；胎牛血清购于杭州赛乐生物科技有限公司
15、；胰蛋白酶购于美国Hykelone公司；免疫组化SP试剂盒购于北京中杉金桥公司；RT-PCR试剂盒（TaKaRa公司）；总RNA提取试剂Trizol购自Invitrogen公司；琼脂糖（BIO BASIC公司）；兔抗人CAR 和Action单克隆抗体购自美国Santa Cruz，TSA 购买Sigma（USA）公司，BALB/C裸小鼠，雌性，鼠龄4W，体质量18g-22g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。1.2 实验方法1.2.1食管癌EC9706细胞的培养：食管癌EC9706细胞于RPMI-1640培养液（含10胎牛血清，青霉素100u/ml，链霉素100u/ml），37、5%CO2孵箱
16、内贴壁培养。1.2.2 食管癌移植瘤模型的建立和分组：先成瘤后治疗组：培养EC9706细胞，经胰酶消化后离心，用PBS液清洗2次；调整细胞浓度为1107ml,接种于裸鼠左上肢皮下，于肿瘤长至8 mm 7 mm后分为4组。A组：腹腔注射PBS代替药物。B组：腹腔注射H10150108 vp/d/只/次。C组：1.0mol/LTSA /只/次。D组：联合应用TSA和H101，先注射TSA，第二天注射H101，注射剂量分别同B组、C组。以上各组治疗连续2 W，治疗结束，取瘤组织。先处理细胞后成瘤，分为4组，每组5只。A组 ：细胞不作任何处理。 B组： 采用浓度为200108 vp/dH101处理细胞
17、48h。C组：采用浓度为4.0mol/LTSA的处理细胞48h. D组：TSA和H101联合处理细胞，TSA作用细胞24h后，再用H101，浓度同 B、C组。然后将各组细胞分组种植于裸鼠左上肢皮下构建裸鼠食管癌移植，待肿瘤长出2周后，取瘤组织。1.2.3 裸鼠移植肿瘤体积测量:裸鼠处死后 ,剥离肿瘤 , 用游标卡尺测量肿瘤最长径及最短径 (mm) ,肿瘤体积 V (mm ) = 最长径 最短径2/6.1.2.4 免疫组化检测CAR的表达: 严格采用免疫组化 SP法试剂盒进行检测,随机挑选裸鼠制作组织切片；将封闭好的切片用 PBS洗涤3 min 3次；用 5%的正常羊血清于室温下封闭非特异性抗原
18、 15 min；弃去多余的血清,滴加适当稀释的一抗 (1：50)，在湿盒内4 冰箱过夜，隔日室温复温1h后用 PBS洗涤3 min 3次 ,滴加适当二抗（1:200）孵育30min。阴性对照用PBS代替一抗。显色、脱水、封片。1.2.5：免疫组化结果判断：采用高清晰图像处理系统，随机取5个高倍视野进行定量分析，对免疫组化检测CAR蛋白阳性信号面积，求出CAR的表达量5。1.2.6 RT-PCR检测CARmRNA的表达：取 2535mg移植瘤加入1 mL Trizol,用研磨器研磨成匀浆，室温放置15min，严格参照Trizol试剂盒说明书从分组并处理好的组织中提取总RNA。以随机六合引物1l做
19、逆转录引物， 2lRNA在AMV的作用下合成cDNA第一链后以-actin为内参照进行PCR反应, -actin，F：5-AAATCTGGCACCACACCTT-3，R：5-TAGCACAGCCTGGATAGCAA-3，产物大小为170bp。CAR, F：5-TTCAGGTGCGAGATGTTA-3, R：5- GAATGATTACTGCCGATG-3，产物大小为460bp（引物序列设计合成均由上海生工完成）。所有操作严格按照RT-PCR试剂盒说明书进行，PCR反应条件：9530s， 5430 s, 741 min，30个循环，最后72C延伸10min。PCR 产物各2l在1.5%琼脂糖凝胶中
20、电泳。凝胶成像仪扫描后分析条带峰面积来检测CARmRNA的表达水平。每组至少重复3次。1.2.7 Western-bloting/检测CAR 的表达：参照分子克隆实验指南提取肿瘤组织总蛋白，测定浓度后，在标准蛋白曲线下算出50g 蛋白上样量，以B-actin为内参照，western-blot检测各组肿瘤细胞表面CAR蛋白表达。50g上样量蛋白分别用8%、12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行垂直电泳分离后，用“三明治法”转移至PVDF膜上，用含50g/L牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）摇床封闭三小时，加入兔抗人CAR单克隆抗体4冰箱过夜。用TBST洗涤3次后加入1：
21、5000稀释的二抗孵育1小时后化学发光法进行X线胶片曝光显影。以-actin抗体作为上样对照。结果用Gel-Doc图像分析软件检测各条带的灰度值，将各处理组的灰度值与对照组灰度值比较分析。每组至少重复3次。1.3统计学处理 应用SPSS 11.0统计软件进行统计学处理，计量资料采用均数标准差（S）表示；两组均数的比较用t检验（t-test）；两组以上均数的比较用方差分析（ANVOA）；以=0.05为显著性标准。 2结果2.1 裸鼠食管癌移植瘤各组生长情况先成瘤后处理组各治疗组裸鼠移植瘤体积均小于空白对照组，TSA和H101治疗组两组之间瘤体积差别不大。TSA和H101联合治疗组裸鼠移植瘤体积减
22、小最明显，与其它各组差异明显。见图1和图2。 A空白对照组 B H101治疗组C TSA治疗组 D TSA和H1O1联合治疗组 A空白对照组 B H101治疗组C TSA治疗组D TSA和H1O1联合治疗组图1各组裸鼠成瘤大体照片 图2 取出的各组瘤组织A空白对照组 B H101治疗组 C TSA治疗组 D TSA和H1O1联合治疗组 各组裸鼠移植瘤终体积数据经统计分析，各治疗组与空白对照组相比，差异均有统计学意义（P0.05）,治疗组组内两两比较结果显示，TSA、H101单独治疗组分别与联合治疗组有明显差异（P0.05）结果见图3。结果显示，TSA和H101联合组肿瘤体积明显缩小，二者联合治
23、疗组效果最显著。*与空白对照组相比P0.05，#与各组间相比P0.05图3 各组裸鼠治疗前后肿瘤体积的比较先处理后成瘤组各处理细胞组与空白对照组相比，肿瘤体积均小于空白对照组，TSA和H101处理组之间瘤体积差别不大。TSA和H101联合处理组裸鼠移植瘤体积减小最明显，与其它各组差异明显。见图4和图5。 图4各组裸鼠成瘤大体照片 图5 取出的各组瘤组织各组间肿瘤标本的平均重量相比较，各处理组与空白对照组相比，差异均有统计学意义（P0.05）,处理组内两两比较结果显示，TSA、H101单独处理细胞组分别与联合处理细胞组有明显差异（P0.05）,结果见图6-1和图6-2，结果显示，TSA和H101
24、联合处理组肿瘤重量下降明显，以二者联合处理组效果最显著。*与空白对照组相比P0.05，#与各组间相比P0.05图6-1各组间肿瘤标本的平均重量比较 图6-2 各组肿瘤的抑制率2.2免疫组化裸鼠食管癌移植瘤组织中CAR蛋白表达情况裸鼠移植瘤组织免疫组化 SP法染色后 ,可看到 TSA组和TSA、H101联合组CAR蛋白在移植瘤细胞的表达主要表现为胞膜着色为黄色，对照组和H101组几乎不着色，可见经过TSA作用后移植瘤细胞中的CAR蛋白的水平得到有效上调。见彩图7。由图8-1和8-2可知，无论是先成瘤后治疗还是先处理细胞后成瘤，相比于对照组，TSA和TSA、H101 联合组CAR的表达量差异均有统
25、计学意义（P0.05）。TSA、H101单独作用相比，CAR蛋白的表达量其差异有统计学意义（P0.05）。 A B C D 图7 人食管癌裸鼠移植瘤组织中CAR蛋白的表达。A:空白对照组CAR表达阴性（sp 400） B:H101治疗组CAR表达阴性（ sp400） C:TSA治疗组CAR表达阳性（sp 400） D:二者联合治疗组CAR表达阳性（sp 400） *与空白对照组相比P0.05，#与H101组相比P0.05 *与空白对照组相比P0.05，#与H101组相比P0.05图8-1先成瘤后治疗各组CAR蛋白的表达 图8-2先处理细胞后成瘤各组CAR蛋白的表达2.3移植瘤组织 R-T PC
26、R鉴定CAR mRNA的表达情况无论是先成瘤后治疗还是先处理细胞后成瘤，相比于对照组，TSA和TSA、H101 联合组 CAR mRNA的表达量差异均有统计学意义（P0.05），TSA、H101单独作用相比，CAR mRNA的表达量其差异有统计学意义（P0.05）。见图9-1和9-2。图9-1 RT-PCR检测移植瘤组织 CARmRNA表达Figure6 RT-PCR detection of CAR mRNA expression in transplanted tumor masslane A：control group lane B:H101cured group lane C：TSA
27、cured group lane D:TSA and H101 combined curement group图9-2 RT-PCR检测移植瘤组织 CARmRNA表达Figure7 RT-PCR detection of CARmRNA expression in transplanted tumor masslane A：control group lane B：H101treated group lane C ：TSA treated group lane D :TSA and H101 combined treatment group2.4 Western-bloting检测CAR 蛋白
28、表达情况无论是先成瘤后治疗还是先处理细胞后成瘤，相比于对照组，TSA和TSA、H101 联合组CAR的表达量差异均有统计学意义（P0.05）。与TSA、H101单独作用组相比，CAR蛋白的表达量其差异有统计学意义（P0.05）。这与R-T PCR鉴定结果趋势相一致。见图10-1和10-2。图10-1 Western-bloting检测移植瘤组织 CAR表达Figure8 Western-bloting detection of CAR expression in transplanted tumor masslane A：control group lane B:H101cured group
29、 lane C：TSA cured group lane D:TSA and H101 combined curement group图10-2 Western-bloting检测移植瘤组织 CAR表达Figure9 Western-bloting detection of CAR expression in transplanted tumor masslane A：control group lane B：H101treated group lane C ：TSA treated grouplane D :TSA and H101 combined treatment group3 讨论目
30、前，病毒溶瘤作用的研究越来越受到重视，随着人们对病毒认识的不断加深和 DNA 重组技术的发展，人们通过基因工程改造使病毒具有更高的安全性和抗癌活性。复制选择性腺病毒(Replication-selective adenoviruses)即溶瘤腺病毒就是一种通过遗传工程改造使其改造后能通过特异性在肿瘤细胞中复制、裂解肿瘤细胞，而对正常的细胞无杀伤力的溶瘤病毒，H101就是利用基因工程技术对人 5型腺病毒Ad5进行基因重组得到的一种溶瘤腺病毒，能直接在肿瘤细胞中复制、包装，导致肿瘤细胞最终裂解。但是临床试验研究表明，单一的使用疗效不佳，其原因在于病毒的转导效率低下。腺病毒要感染靶细胞，病毒衣壳蛋白
31、的fiber蛋白首先要和靶细胞表面的CAR受体结合，完成病毒-细胞的识别(identification)过程，这一步至关重要，多数肿瘤细胞特别是恶性肿瘤细胞CAR往往低表达甚至缺如，这就间接地导致腺病毒基因治疗效果下降甚至无效6-7。TSA是HDAC抑制剂的代表药物之一，HDAC抑制剂由于抑制了HDAC的活性，使靶细胞中组蛋白高度乙酰化，通过乙酰化修饰改变了DNA链间与组蛋白的结合状态，使染色体结构变得疏松，从而通过抑制转录因子与DNA的结合而改变基因的转录。TSA作为一类抗肿瘤药物，在血液病肿瘤和实体肿瘤中均具有强大的抗肿瘤活性，以前认为TSA的抗瘤作用主要是通过抑制肿瘤细胞生长和诱导其凋亡
32、而实现的8。但最新研究显示TSA可以上调一系列黏附分子的表达包括CAR。CAR最早是作为细胞表面的病毒受体为人们所认识，1997年发现的柯萨奇腺病毒受体(Coxsackie adenovirus receptor，CAR )是 Ad5和 Ad2的受体，CAR在不同组织来源肿瘤细胞中的表达水平很不相同，即使在同一组织来源的肿瘤细胞中差异也很明显, 这种差异有可能影响了腺病毒的转导效率,从而影响以腺病毒为载体的基因治疗药物在不同肿瘤类型甚至同种肿瘤的不同个体中的疗效。CAR作为一种粘附分子已被证实与肿瘤的运动和侵袭力相关，所以，我们推测上调细胞表面的CAR表达水平对治疗肿瘤有疗效，那么TSA联合溶
33、瘤腺病毒H101治疗肿瘤能否提高疗效？因此在本实验中，我们选择TSA、H101及两者联合治疗人食管癌裸鼠皮下移植瘤，结果显示各组裸鼠移植瘤终体积数据经统计分析，各治疗组与空白对照组相比，差异均有统计学意义（P0.05）,治疗组组内两两比较结果显示，TSA、H101单独治疗组分别与联合治疗组有明显差异（P0.05），而肿瘤组织CAR的表达情况显示无论是先成瘤后治疗还是先处理细胞后成瘤，相比于对照组，TSA和TSA、H101 联合组CAR的表达量差异均有统计学意义（P0.05）。与TSA、H101单独作用相比，CAR蛋白的表达量其差异有统计学意义（P0.05）。所有结果显示TSA和H101两者联合
34、治疗效果明显提高。这对指导腺病毒治疗食管癌等恶性肿瘤提供了一个新的思路。参考文献：1 Wang Y, Hallden G，Hill R, et al. E3 gene manipulations affect oncolytic adenovirus a ctivity in immunocompetent tumor modelsJ.Nat Biotechnol,2003,21(11):1328-13352 WakayamaM, AbeiM, Kawashim a R, et al. E1A, E1B double- restricted adenovirus with RGD-fiber
35、modification exhibits enhanced oncolysis for CAR-deficient biliary cancersJ.Clin Cancer Res,2007,13(10)：3043-30503夏忠军 ,常建华 ,张力 ,等.基因工程腺病毒 (H101) 瘤内注射联合化治疗头颈部及食管鳞癌的三期临床研究J. 癌症 ,2004，23（12）：1666-16704徐瑞华 ,袁中玉 ,管忠震 ,等. 瘤内注射 E1B缺失腺病毒治疗恶性肿瘤的二期临床研究 J . 中国癌症杂志 ,2004,14(1)：12-185孙淼淼，张红，曹学全，等.肝素酶特异性RNAi对人食管癌
36、移植瘤组织中Hpa基因表达的影响J.郑州大学学报：医学版，2007，42（1）：12-146 范良生，陈刚，马丁.柯萨奇-腺病毒受体在肿瘤发生发展机制中的研究进展. 癌症,2009,28(3):333-3367 Manabu Y, Asami I, Kenji K, et al Expression of coxsackie and adenovirus receptor reduces the lung metastaticpotential of murine tumor cells.J Int. J. Cancer: 2007,121, 16901696. 8 Kitazono, M., Goldsmith, M. E., Aikou, T., Bates, S., and Fojo, T. Enhancedadenovirus transgene in malignant cells treated with the histone deacetylase inhibitorFR901228. Cancer Res., 61: 63286330, 2001.
