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1、内容目录,糖化血红蛋白标准化,糖化血红蛋白（GHB）,检测方法及产品示例,常用检测方法之比较,1,2,3,4,糖化血红蛋白（GHb）,GHb是指结合了任何形式碳水化合物的血红蛋白，血红蛋白与糖基发生非酶促，形成了不可逆的复合物。,成人血红蛋白分三种，HbA为主要成人Hb,非糖化Hb,糖化Hb,血红蛋白,1%,1%,4%-6%,糖化血红蛋白的形成,血红蛋白HbA由两个亚基和两个亚基组成，和亚基上都有糖化位点，其中亚基第1位缬氨酸主链氨基糖化率最高。,根据糖种类，糖基化血红蛋白可分为葡萄糖糖化、果糖糖化及乳糖糖基化血红蛋白等。人体内游离的葡萄糖含量远高于其他糖类物质， 亚基的氮端缬氨酸主链氨基的糖
2、化概率最高，因此体内大部分糖基化血红蛋白为 亚基氮端缬氨酸与葡萄糖的加合物，该物质被命名为HbA1c。,HbA1c糖基化位点结构图,亚基,亚基,血红素,血红素,血红素,血红素,检测方法学分类,1、亲和层析2、免疫法3、酶法4、显色法,根据Ghb和非GHb带电不同,01,基于Hb上糖基化基团的结构特点,1、离子交换层析2、电泳法3、等电点聚焦法,02,检测方法：离子交换层析,主要有高效液相色谱法( high performance liquid chromatography，HPLC) 和手工微柱法。此方法是基于血红蛋白 链N 末端缬氨酸糖化后所带电荷不同而建立。在中性pH条件下，HbA1c 携
3、带的正电荷相对较少，因此可通过离子交换层析法将其与其他组分分离。,检测方法：毛细管电泳法,毛细管电泳能分离检测糖化血红蛋白和血红蛋白的变异体，样品用量少、操作简便、重复性好、省时、高效。完全自动化操作，简单易用，在减少人为误差的基础上，重复性也得到了极大提高。,SEBIA全自动高压液相毛细管电泳仪,检测方法：琼脂凝胶电泳法,Hb于酸性缓冲液条件下(pH6.0)，在琼脂糖凝胶上的电泳迁移取决于Hb在凝胶上的吸附情况及其所带的电荷。HbA0因其末端的缬氨酸残基对凝胶的负电荷有高度的亲和力，因此它的迁移速率减慢。HbA1c因它所连接的糖的阻断作用，不可再与凝胶结合，利用HbA1c和HbA0对凝胶的亲
4、和力不同，导致的电泳迁移速率也不同，通过电泳将各成分分开。,SEBIA蛋白质电泳仪,检测方法：等电点聚集法,在聚丙烯酞凝胶中加入载体两性介质（如ampholin）的薄板上形成一个由阳极到阴极逐渐增加的pH梯度。溶血液中各个组分将移动到各自等电点的pH位置上，这样就得到比一般电泳法更好的分划效果和比较集中的色带。,GE Ettan IPGphor 3等电聚焦电泳仪,检测方法：亲和层析法,由交联了间氨基苯硼酸的琼脂糖珠作为分离载体。当总的GHb通过载体时，硼酸可与整合在血红蛋白分子中的葡萄糖顺位二醇基发生可逆性结合，使糖化的Hb选择性地结合于凝胶柱上，其他非糖化Hb等随缓冲液流出；然后用另一种含糖
5、或多羟化合物的缓冲液将GHb洗脱下来，利用两部分Hb本身的颜色，在415nm条件下测定并计算出亲和色谱所测的GHb。,伯乐In2it糖化血红蛋白仪,Alere Afinion AS100 Analyzer,糖化血红蛋白检测标准化主要有高效液相色谱法( high performance liquid chromatography，HPLC) 和手工微柱法。不能发现血红蛋白变异体，新一代的试剂盒依然会受到少见变异体的分析干扰。H2O2在过氧化物酶的作用下与相应的色原耦联，发生颜色变化，根据其变化程度可得H2O2浓度，进而得知样本中GHb的含量。变异体被共洗脱时易被干扰 ，仪器昂贵，维护成本较高行、
6、快速准确、试剂稳定。工作流程复杂，需要特定的仪器，设备成本高能够发现血红蛋白变异体，样品用量少、操作简便、重复性好、省时、高效在中性pH条件下，HbA1c 携带的正电荷相对较少，因此可通过离子交换层析法将其与其他组分分离。糖化血红蛋白（GHB）毛细管电泳能分离检测糖化血红蛋白和血红蛋白的变异体，样品用量少、操作简便、重复性好、省时、高效。在聚丙烯酞凝胶中加入载体两性介质（如ampholin）的薄板上形成一个由阳极到阴极逐渐增加的pH梯度。在中性pH条件下，HbA1c 携带的正电荷相对较少，因此可通过离子交换层析法将其与其他组分分离。Alere Afinion AS100 AnalyzerBay
7、er 拜安时手持式糖化检测仪2004 年，GE Healthcare 在其离子交换操作手册中，详细介绍了Mono S HPLC 方法用于检测HbA1c的操作步骤。SEBIA全自动高压液相毛细管电泳仪在中性pH条件下，HbA1c 携带的正电荷相对较少，因此可通过离子交换层析法将其与其他组分分离。全血经溶血处理后，用特异蛋白内切酶将酶解消化成果糖氨基酸，再经果糖氨基酸氧化酶作用下产生过氧,检测方法：免疫法,化学发光法：又叫离子捕获法，采用离子捕捉免疫分析法，应用抗原抗体反应原理，联合荧光标记物，通过连接带负电的多阴离子复合物，吸附到带正电的纤维表面，经过一系列彻底清洗等步骤后，测定荧光强度变化率，
8、计算浓度。,检测方法：免疫法,比浊法：又有胶乳凝集法和免疫比浊法两种。可实现和自动化分析仪很好地结合起来，具有快速、准确、特异性强、重复性好、灵敏度高、线性范围宽等优点，可以使用自动化分析仪进行批量检测。,检测方法：免疫法,免疫层析法：免疫层析法操作简便易行、快速准确、试剂稳定。更易于实现POC检测，有助于医生即时获悉患者血糖水平，并及时给予患者医疗指导，以避免糖尿病诊断和治疗的延误，未来有着较为广阔的应用前景。,Bayer 拜安时手持式糖化检测仪,检测方法：酶法,全血经溶血处理后，用特异蛋白内切酶将酶解消化成果糖氨基酸，再经果糖氨基酸氧化酶作用下产生过氧化氢（H2O2），H2O2的浓度与血液
9、中GHb的含量呈正比。 H2O2在过氧化物酶的作用下与相应的色原耦联，发生颜色变化，根据其变化程度可得H2O2浓度，进而得知样本中GHb的含量。,积水医疗酶法生化试剂,糖化血红蛋白检测标准化,瑞典Mono S 方法,日本JDS/JSCC 方法,美国NGSP方法,对不同的HbA1c检测方法采用统一参考标准(采用HPLC Bio-Rex 70 阳离子交换柱)进行校准，使不同方法所测结果具有可比性,2000 年，JSCC 启用KO500 阳离子HPLC ，与JDS 合作设计了新的HbA1c检测校准物，通过新校准品校准后的KO500 HPLC HbA1c检测法，成为JDS/JSCC 的参考标准化方案,
10、2004 年，GE Healthcare 在其离子交换操作手册中，详细介绍了Mono S HPLC 方法用于检测HbA1c的操作步骤。证实Mono S 5/50 GL 柱检测精度上具有优越性。,IFCC法：2007 年国际临床化学联合会(IFCC) 重新明确了HbA1c 的命名、性质、单位: 全称为 链血红蛋白链N 末端脱氧果糖基血红蛋白; 特别强调HbA1c 测定的是“物质分数”，而不是“质量分数”; 推荐使用( mmol /mol) 作为HbA1c 的单位，此建议为HbA1c 结果数据提供了非常明确的计量单位，可溯源到溯源链的最高等级国际单位制。,糖化血红蛋白检测标准化,2004 年，Ho
11、elzel 等发表了关于HbA1c检测的IFCC 标准法与美国、日本、瑞典3 个国家标准法之间的比较研究报告。,三种国标法的基本原理是通过蛋白质表面净电荷的差异对Hb 进行分离，并未对HbA1c具有特异性，其结果的溯源仅来自于HPLC 分离的色谱图的峰值，三者所测得“HbA1c波峰”可能包含其他无法分离开来的非糖化Hb 成分，其测定结果都略高于IFCC 检测值，这同样使得这三种方法对同一样品所测得的数据不同。,HbA1c常用检测方法之比较,HbA1c常用检测方法之比较,检测方法学分类,1、亲和层析2、免疫法3、酶法4、显色法,根据Ghb和非GHb带电不同,01,基于Hb上糖基化基团的结构特点,
12、1、离子交换层析2、电泳法3、等电点聚焦法,02,检测方法：离子交换层析,主要有高效液相色谱法( high performance liquid chromatography，HPLC) 和手工微柱法。此方法是基于血红蛋白 链N 末端缬氨酸糖化后所带电荷不同而建立。在中性pH条件下，HbA1c 携带的正电荷相对较少，因此可通过离子交换层析法将其与其他组分分离。,糖化的血红蛋白被绑定在硼酸基团树脂时，非糖化的血红蛋白组分直接流出分析柱HbA1c常用检测方法之比较在中性pH条件下，HbA1c 携带的正电荷相对较少，因此可通过离子交换层析法将其与其他组分分离。在中性pH条件下，HbA1c 携带的正电
13、荷相对较少，因此可通过离子交换层析法将其与其他组分分离。2013年 （3240家）最小的Hb变异体分析干扰，操作简单、快速、特异性强，化学发光法：又叫离子捕获法，采用离子捕捉免疫分析法，应用抗原抗体反应原理，联合荧光标记物，通过连接带负电的多阴离子复合物，吸附到带正电的纤维表面，经过一系列彻底清洗等步骤后，测定荧光强度变化率，计算浓度。2000 年，JSCC 启用KO500 阳离子HPLC ，与JDS 合作设计了新的HbA1c检测校准物，通过新校准品校准后的KO500 HPLC HbA1c检测法，成为JDS/JSCC 的参考标准化方案糖化血红蛋白（GHB）Alere Afinion AS100
14、 Analyzer更易于实现POC检测，有助于医生即时获悉患者血糖水平，并及时给予患者医疗指导，以避免糖尿病诊断和治疗的延误，未来有着较为广阔的应用前景。基于Hb上糖基化基团的结构特点不能发现血红蛋白变异体HbA0因其末端的缬氨酸残基对凝胶的负电荷有高度的亲和力，因此它的迁移速率减慢。可实现和自动化分析仪很好地结合起来，具有快速、准确、特异性强、重复性好、灵敏度高、线性范围宽等优点，可以使用自动化分析仪进行批量检测。当总的GHb通过载体时，硼酸可与整合在血红蛋白分子中的葡萄糖顺位二醇基发生可逆性结合，使糖化的Hb选择性地结合于凝胶柱上，其他非糖化Hb等随缓冲液流出；检测方法：离子交换层析HbA
15、1c因它所连接的糖的阻断作用，不可再与凝胶结合，利用HbA1c和HbA0对凝胶的亲和力不同，导致的电泳迁移速率也不同，通过电泳将各成分分开。对不同的HbA1c检测方法采用统一参考标准(采用HPLC Bio-Rex 70 阳离子交换柱)进行校准，使不同方法所测结果具有可比性检测方法：等电点聚集法在聚丙烯酞凝胶中加入载体两性介质（如ampholin）的薄板上形成一个由阳极到阴极逐渐增加的pH梯度。,在中性pH条件下，HbA1c 携带的正电荷相对较少，因此可通过离子交换层析法将其与其他组分分离。GHb是指结合了任何形式碳水化合物的血红蛋白，血红蛋白与糖基发生非酶促，形成了不可逆的复合物。不能发现血红
16、蛋白变异体，新一代的试剂盒依然会受到少见变异体的分析干扰。在聚丙烯酞凝胶中加入载体两性介质（如ampholin）的薄板上形成一个由阳极到阴极逐渐增加的pH梯度。GE Ettan IPGphor 3等电聚焦电泳仪根据标记方法不同，可以应用多个检测平台，可实现全自动和POC检测检测的是总糖化血红蛋白，而不是 HbA1c,不能发现血红蛋白变异体。然后用另一种含糖或多羟化合物的缓冲液将GHb洗脱下来，利用两部分Hb本身的颜色，在415nm条件下测定并计算出亲和色谱所测的GHb。对不同的HbA1c检测方法采用统一参考标准(采用HPLC Bio-Rex 70 阳离子交换柱)进行校准，使不同方法所测结果具有
17、可比性Bayer 拜安时手持式糖化检测仪SEBIA全自动高压液相毛细管电泳仪Bayer 拜安时手持式糖化检测仪基于Hb上糖基化基团的结构特点糖化的血红蛋白被绑定在硼酸基团树脂时，非糖化的血红蛋白组分直接流出分析柱基于Hb上糖基化基团的结构特点检测方法：等电点聚集法基于Hb上糖基化基团的结构特点SEBIA蛋白质电泳仪完全自动化操作，简单易用，在减少人为误差的基础上，重复性也得到了极大提高。,检测方法：亲和层析法,由交联了间氨基苯硼酸的琼脂糖珠作为分离载体。当总的GHb通过载体时，硼酸可与整合在血红蛋白分子中的葡萄糖顺位二醇基发生可逆性结合，使糖化的Hb选择性地结合于凝胶柱上，其他非糖化Hb等随缓冲液流出；然后用另一种含糖或多羟化合物的缓冲液将GHb洗脱下来，利用两部分Hb本身的颜色，在415nm条件下测定并计算出亲和色谱所测的GHb。,伯乐In2it糖化血红蛋白仪,Alere Afinion AS100 Analyzer,
