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1、微生物菌种分离筛选与育种,发酵工程的生产水平由生产菌种的性能、发酵条件、提取工艺和生产设备。其中生产菌种是最重要的，生产菌种最初都来源于自然界（土壤、空气、江、河、湖、海）。,一个菌种能否满足工业生产的实际需要，是否有工业生产价值极为重要。,工业生产对生产菌种自身的特性提出了许多要求，这些要求是评价生产菌种优劣的标准和菌种选育工作的研究目标。 一般来说，优良的生产菌种应该具备如下的基本特性：,具有在较短的发酵周期内产生大量发酵产物的能力。在发酵过程中不产生或少产生与目标产品性质相近的副产物及其他产物。生长繁殖能力强，生长速率快。,能够高效地将原料转化为产品。有广泛利用不同来源原材料的能力，并对
2、发酵原料成分波动敏感性较小。对需要添加的前体物质有耐受能力，并且不能将这些前体物质作为一般碳源利用。,发酵过程中产生的泡沫要少。具有抗噬菌体感染的能力。遗传特性稳定，保证发酵过程能够长期、稳定地进行，同时有利于实施最佳的工艺控制。,以上是对优良菌种特性的要求，也是菌种选育工作研究和需要解决的问题。生产菌种选育方法： 自然选育、诱变选育、抗噬菌体菌种选育、杂交育种、原生质体融合技术、基因工程技术等。,第一节 自然选育,自然选育: 不经人工处理，利用微生物自然突变进行菌种选育的过程。自然突变原因： 1.多因素低剂量的诱变效应， 2.互变异构效应。,多因素低剂量的诱变效应： 是指自然界中低剂量的宇宙
3、射线、各种短波辐射、诱变物质和微生物自身代谢产生的诱变物质等作用引起的突变。互变异构效应： 指四种碱基第六位上的酮基或氨基的瞬间变构，会引起碱基的错配。,例如胸腺嘧啶（T）和鸟嘌呤（G）可以酮式或烯醇式出现，胞嘧啶（C）和腺嘌呤（A）可以氨基式或亚氨基式出现。平衡是倾向于酮式或氨基式的，因此DNA双链中以AT和GC碱基配对为主。但在偶然的情况下，当T以烯醇式出现时的一瞬间，DNA链正好合成到这一位置上，与T配对的就不是A，而是G；若C以亚氨基式出现时的一瞬间，新合成的DNA链这一位置上，与C配对的就不是G，而是A。,据统计，这种碱基错误配对引起自然突变的几率为10-510-9。,自然突变结果：
4、 1.菌种退化-产物产量或质量下降； 2.菌种进化-对生产有益的突变。 注意： 在工业生产中，由于各种条件因素的影响，自然突变是经常发生的，也造成了生产水平波动，所以要注意从高水平的生产批次中，分离高生产能力的菌种再用于生产。,自然选育是一种简单易行的选育方法。但是自然选育的效率低，因此经常与其它育种方法交替使用，以提高育种效率。自然选育程序:取样菌悬液稀释平板分离单菌落能力检测菌种。,第二节 诱变选育,微生物有一套严密的代谢机制。其过程是被严格调控的，所有的代谢产物都不会过量积累。因此从自然环境中分离的菌种生产能力有限，一般不能满足生产的实际需要。 诱变育种是提高菌种生产能力，使所需要的代谢
5、产物过量积累的有效方法之一。,31 诱变育种的原理,诱变育种的理论基础是基因突变，突变主要包括染色体畸变和基因突变两大类。 染色体畸变：是指染色体或DNA片段发生缺失、易位、逆位、重复等。 基因突变：是指DNA中的碱基发生变化即点突变。,诱变育种： 是利用物理、化学诱变剂处理微生物细胞，提高基因突变频率，再通过适当的筛选方法获得所需要的高产优质菌种的育种方法。 常用的诱变剂-物理、化学和生物的三大类，见下表。,22 诱变育种的基本方法,诱变育种-诱变和筛选诱变-包括出发菌株选择、诱变剂种类和剂量选择，以及合理使用方法。筛选-初筛和复筛，测定菌种的生产能力。,1）出发菌株的选择,诱变出发菌株要有
6、目标产物的生产能力；其它生产性能如生长繁殖快、营养要求低、产孢子多且早；对诱变剂敏感，则变异幅度大；产量、形态、生理等方面情况。另外，可选择已经过诱变处理的菌株，这样的菌株对诱变剂的敏感。,2）诱变剂的使用方法,诱变的方法：单一诱变和复合诱变。单一诱变：指只用一种诱变剂处理菌种。复合诱变：指两种以上诱变剂处理菌种。复合诱变处理包括同一诱变剂多次处理、两种以上诱变剂同时、先后处理或多次处理。,3）诱变剂剂量选择,对不同微生物使用的剂型、剂量不同，诱变剂的剂量与致死率有关，而致死率又与诱变率有一定的关系。因此，用致死率作为诱变剂剂量选择的依据。,一般来说，诱变率随诱变剂剂量的增加而提高，但达到一定
7、程度以后，再提高剂量反使诱变率下降。 近年来已将处理剂量从过去的致死率9999.9%降至7080，甚至更低。,23 突变菌株的筛选,诱变后，正向突变的菌株通常较少，菌种性能有可能发生各种各样的变异，如营养、抗性、代谢、形态、生长繁殖和温度等。这些变异菌种可用各种方法筛选。 通过初筛和复筛后，还要经过发酵条件优化研究，确定最佳发酵条件，使高产菌株生产能力充分发挥出来。,1）营养缺陷型突变菌株的筛选,营养缺陷型突变菌株的诱变育种具有重要的理论研究和工业应用价值，已广泛地在氨基酸、核苷酸生产中广泛应用。 在营养缺陷型突变菌株中，生物合成途径中某一步发生了酶缺陷，合成反应不能完成，末端产物不能积累，因
8、此末端产物的反馈调节作用被解除。只要在培养基中限量加入所要求的末端产物，克服生长障碍，就能使中间产物积累。,2）抗反馈阻遏和抗反馈抑制突变菌株的筛选,末端产物的反馈调节在生物合成途径中是普遍存在的，除了采用筛选营养缺陷型突变菌株来降低末端产物的浓度外，更加有效的办法是筛选抗阻遏和抗反馈抑制突变株。这两种突变均是由于代谢失调，它们有共同的表型，即在细胞中已经有了大量的末端产物时，仍不断合成这一产物。,3）组成型突变株的筛选,在酶制剂的发酵生产中，常采用在发酵过程中分批限量加入诱导物的方法，提高诱导酶的活性。为解除对诱导物的依赖，可通过诱变改变菌种的遗传特性，筛选组成型突变株。突变发生在调节基因或
9、操纵基因，都可获得组成型突变株。筛选的方法是设计某种有利于组成型菌株生长，并限制诱导型菌株生长的培养条件，造成组成型菌株生长的优势或适当的分辨两类菌落的方法，选出组成型突变菌株。,4)抗性突变株的筛选,抗生素抗性突变。抗噬菌体菌株的选育。条件抗性突变。 敏感突变。,第三节 杂交育种,杂交育种：是将不同菌株的遗传物质进行交换、重组，使不同菌株的优良性状集中在重组体中，克服长期诱变引起的生活力下降等缺陷。 通过杂交还可以扩大变异范围，改变产品的产量和质量，创造出新品种。,3.1 细菌的杂交育种,细菌的杂交可以通过细菌接合、F因子转导、R因子转移、转化和转导等方法促使基因重组。,3.2 放线菌的杂交
10、育种,放线菌的杂交包括混合培养法、平板杂交法和玻璃纸转移法三种： 金霉素、新霉素、红霉素和新生霉素等抗生素产生菌的杂交育种中，都有成功的报道。,3.3 霉菌的杂交育种,1准性生殖 准性生殖是指真菌不通过有性生殖的基因重组过程。 准性生殖过程包括异核体形成、二倍体形成和体细胞的重组。,3.4 酵母的杂交育种,酵母菌是双单性微生物，存在着单倍体和二倍体生活史； 酵母杂交育种有三种杂交方式：即孢子与孢子、单倍体细胞与孢子、以及细胞间杂交。,第四节 原生质体融合技术,对微生物育种来说，有性重组的局限性很大，迄今发现有杂交现象的微生物并不多，这就妨碍了基因重组在微生物育种中的应用。 原生质体融合技术提供
11、了充分利用遗传重组杂交的方法。,原生质体融合技术首先是在动植物细胞融合研究的基础上发展起来的，然后才应用于真菌、细菌和放线菌。由于这一技术可以打破种属间的界限，提高重组频率，扩大重组幅度，而倍受关注。,4.1 原生质体融合的优越性,原生质体融合方法: 首先用酶分别酶解两个出发菌株的细胞壁，在高渗环境中释放出原生质，将它们混合，在助融剂或电场作用下，使它们互相凝集，发生细胞融合，实现遗传重组。,4.2 原生质体融合方法,原生质体融合技术包括: 原生质体制备，原生质体融合，原生质体再生和融合子筛选等步骤。,1）原生质体制备,使用各种酶分别酶解两个出发菌株的细胞壁，释放出原生质体;为防止原生质体内部
12、渗透压过高而破裂，必须将原生质体释放到高渗溶液中。 各种微生物细胞壁组成不同，须采用不同的原生质体制备方法。,革兰氏阳性枯草杆菌和巨大芽抱杆菌的细胞壁溶菌酶； 黄色短杆菌的原生质体制备是先加青霉素培养1.5h后，再用酶消化； 革兰氏阴性细菌则要采用EDTA加溶菌酶，或甘氨酸一溶菌酶一EDTA，或在含青霉素培养基培养等条件下制备原生质体；,链霉菌一般在含甘氨酸的培养基中培养后，用溶菌酶消化； 酵母的原生质体制备是首先接种在疏基乙醇和EDTA的溶液中培养，再用细胞壁溶解酶消化获得。或者用蜗牛酶或纤维素酶消化时，添加疏基乙醇来提高原生质体的形成率。 几丁质酶、蜗牛酶、纤维素酶、硫酸脂酶多用于制备霉菌
13、的原生质体。,2) 原生质体融合和再生,两个出发菌株制备的原生质体可以通过化学因子或电场诱导的方法进行融合。 化学因子诱导：采用聚乙二醇（PEG）4000和6000作为融合剂，并加Ca2+和Mg2+等阳离子。 电融合过程是原生质体在电场中极化成偶极子，并沿电力线方向排列成串，再加直流脉冲击穿原生质体膜，导致原生质体融合。,融合后的原生质体具有生物活性，但由于缺少细胞壁，不是正常的细胞，不能在普通培养基上生长。所以要涂布在高渗培养基上令其再生。可以增加高渗培养基的渗透压或添加蔗糖来增加再生率。,3) 融合子的检出,融合子是在选择性培养基上检出，即通过两个遗传标记互补确定的，如利用营养缺陷型互补，
14、在基本培养基上识别融合子。 当亲株没有或很少标记的情况下，可利用灭活的原生质体（单亲株或双亲株灭活均可）融合，筛选有生物活性的重组子。,此外可以利用荧光染色，将两个亲株用不同的荧光色素染色并融合后，在落射荧光装置的立体显微镜下观察融合子；如在一个个体上观察到双亲的两种荧光色素，即为融合子。,通过上述方法产生的融合子如果产生了杂合双倍体或单倍重组子，其遗传性状比较稳定。但也可能产生的融合子是一种短暂的融合，会再次分离成亲本类型。所以还要再进行多次筛选，找到稳定的融合子。,第五节 基因工程技术,基因工程或DNA体外重组技术：将外源DNA通过体外重组后，导人受体细胞，使其在受体细胞中复制、转录、表达
15、的技术。 基因工程菌产生的主要程序包括：目的基因的克隆，DNA重组体的体外构建，重组 DNA导人宿主细胞以及基因工程菌的选择。,第六节 菌种保藏,菌种的保藏方法很多，其基本原理是：根据微生物的生理生化特性，人为地创造条件，使微生物处于代谢不活泼，生长繁殖受到抑制的休眠状态，以减少菌种的变异。一般可以通过降低培养基营养成分、低温、干燥和缺氧等方法，达到防止突变、保持纯种的目的。 菌种保藏的方法很多，一种好的保藏方法除了能长期保持菌种原有的优良性状不改变外，还应简便、经济，以便在生产上能广泛使用。,6.1 斜面保藏法和穿刺保藏法 6.1.1 斜面保藏法 6.1.2 穿刺保藏法6.2 沙土管干燥保藏法6.3 真空冷冻干燥保藏法 6.4 液氮保藏法 6.5 悬液保藏法6.6 低温保藏法,完,
