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1、,第五章 分子荧光分析法,1.分子荧光分析分析法的基本原理（了解）,3.影响荧光强度的因素（熟悉）,2.分子荧光分析仪器的结构及类型及新技术（了解）,4.分子荧光分析法的基本概念、荧光光谱、 激发光谱、定量分析的依据（掌握）,发光分析法：物质吸收一定能量后跃迁到激发态，激发态以辐射的形式释放能量返回低能态或基态的现象所建立的分析方法。,光致发光：以光能激发而产生的发光,荧光和磷光,光照、加热、化学反应、生物代谢等,荧光分析法：利用物质的荧光谱线位置及其强度，对物质进行定性和定量分析的方法。,定性鉴别：由于不同的物质其组成与结构不同，所吸收光的波长和发射光的波长也不同。,定量分析：如果该物质的浓
2、度不同，它所发射的荧光强度就不同。,1. 根据发光物质分类：分子荧光与原子荧光,2. 根据激发光的波长范围分类： 紫外-可见荧光、红外荧光、X射线荧光,荧光分析法分类,荧光分析法特点： 灵敏度高、选择型好、样品用量少、操作简便,第一节 基本原理,一、分子荧光的产生,1.电子激发态的多重度,电子激发态的多重度：M=2S+1 S为电子自旋量子数的代数和(0或1)；,大多数有机分子的基态处于单重态；,2.激发态基态的能量传递途径,电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量；,非辐射能量传递过程,振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高 振动能级至低相邻
3、振动能级间的跃 迁。发生振动弛豫的时间10 -12 s。,内转换：同多重度电子能级中,等能级间的无辐射能 级交换。,通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激发单重态的最低振动能级。,非辐射能量传递过程,外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生 相互作用而转移能量的非辐射跃迁； 外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。,系间跨越：不同多重态,有重叠的转动能级间的 非辐射跃迁。 改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋轨道耦合进行,辐射能量传递过程,发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长； 2 2 1,荧光：10-710 -9 s,第一激发单重态的最低振动能级基态；,磷光：10-410s；第一激发三
4、重态的最低振动能级基态；,二、激发光谱与荧光(磷光)光谱,固定荧光波长(选最大激发光波长),化合物发射的荧光(磷光)强度与激发光波长的关系曲线 （图中曲线I ） 。,选最强荧光强度的激发光波长ex为测定波长，以提高灵敏度。,1.荧光(磷光)的激发光谱曲线,2.荧光光谱(或磷光光谱),固定激发光波长(选最大激发波长), 化合物发射的荧光(或磷光强度)与激发光波长关系曲线(图中曲线II或III)。,2. 三维荧光光谱,I F f (ex 、em),蒽的激发光谱,固定发射波长、扫描激发波长,I F f (ex 、em),蒽的发射光谱,固定激发波长、扫描发射波长,VB1和VB2的三维荧光光谱,3. 荧
5、光光谱的特征,a. Stokes位移:荧光光谱的波长比激发光谱的长,b. 发射光谱的形状与激发波长无关,c. 与激发光谱呈镜像关系,通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。,镜像规则的解释,基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似；,基态上的零振动能级与第一激发态的二振动能级之间的跃迁几率最大，相反跃迁也然。,200,250,300,350,400,450,500,荧光激发光谱,荧光发射光谱,nm,蒽的激发光谱和荧光光谱,三、荧光的产生与分子结构的关系,1.分子产生荧光必须具备的条件,荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数有关，如外转换过程速度
6、快，不出现荧光发射。,（1）具有强的紫外-可见吸收的特征结构(共轭大键)（2）具有一定的荧光量子产率（）,（1）具有强的紫外-可见吸收的特征结构(共轭大键)（2）具有一定的荧光量子产率（）,2.化合物的结构与荧光,（1）跃迁类型：* 的荧光效率高，系间跨越过程的速率常数小，有利于荧光的产生；,（2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移,（3）取代基效应：芳环上有供电子基，使荧光增强 吸电子基，使荧光减弱甚至熄灭,2.化合物的结构与荧光,（4）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。,四、荧光强度
7、与荧光物质浓度的关系,稀溶液,五、影响荧光强度的因素,2. 溶剂的影响 除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成都将使化合物的荧光发生变化。,3. 溶液pH 对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制。,1. 温度的影响 荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去激活的几率减少，增加荧光效率，从而增加荧光强度。,H值,pH13,弱酸、弱碱,蓝色荧光,4. 散射光：,瑞利散射光：选择适当的荧光测定波长或选用滤光片可消除,拉曼散射光：选择适当激发波长的方法消除,一部分光由于光子与物质分子的相互碰撞，使光子的运动方向发生改变而向不同方向散射。,硫酸奎宁在不同激发波长下的荧光(a)与拉曼光
8、谱(b),荧光光谱,拉曼光谱,瑞利光320nm,拉曼光360nm,拉曼光400nm,荧光448nm,激发320nm,激发350nm,瑞利光350nm,5. 荧光熄灭,荧光熄灭（荧光猝灭）：由于荧光物质分子与溶剂分子或其它溶质分子碰撞而引起荧光强度降低或荧光强度与浓度不呈线性关系的现象。,荧光熄灭剂：引起荧光熄灭的物质。,如卤素离子、重金属离子、氧分子及硝基化合物、羰基、羧基化合物均为常见的荧光熄灭剂。,荧光自熄灭：荧光物质浓度超过1g/L时，增加荧光分子间碰撞几率而产生的荧光熄灭现象。,荧光熄灭法：利用荧光物质荧光强度的减弱与荧光熄灭剂的浓度呈线性关系测定荧光熄灭剂含量的方法。,(浓度限量1g
9、1mg/ml),930型荧光计光路示意图,激发滤光片,发射滤光片,第二节 荧光分析仪器,一. 主要组成及部件的功能,荧光分光光度计工作原理基及仪器结构框图,光源,氙灯,激发单色器,样品池,光电倍增管,数据处理仪器控制,发射单色器,问题：荧光分光光度计与紫外-可见分光光度计有何异同点？,荧光分析仪器的主要部件,激发光源：汞灯、卤钨灯、氙灯、分光系统：滤光片（两个）、单色器（光栅）样器池：低荧光材料或石英材料，四面透光检测器：紫外-可见（光电倍增管）显示系统：指针式、数字式及计算机显示,二、荧光分析仪器的类型,1.荧光光度计,2.荧光分光光度计,荧光分光光度计,荧光分光光度计结构示意图,分光系统：
10、光栅用途：测定激发光谱、荧光光谱及定量分析。,最大激发波长exmax和最大荧光波长emmax是鉴定物质的依据和定量测定时最灵敏的条件。,激发单色器,发射单色器,荧光分光光度计与紫外分光光度计的区别,入射光与吸收光同方向,入射光与荧光垂直方向,两种光源(紫外+可见),一种光源(紫外),空白溶液(F=0)荧光对照品溶液(F=100%或50%),空白溶液(T=100%),紫外无吸收两面透光,低荧光材料四面透光,紫外-可见分光光度计:,荧光(磷光)分光光度计:,紫外-可见分光光度计测量池(吸收池),荧光分光光度计样品池,I0,It,I0,It,IF,p,第三节 定性和定量分析,定量依据：F=Kc,定性
11、依据荧光光谱和激发光谱,一、定性分析,二、定量分析,1. 标准曲线法,直接荧光标准曲线法,2.直接比较法,第四节 荧光分析新技术,激光荧光分析,时间分辨荧光分析,一、荧光新技术,三维荧光分析,核酸分子荧光探针,薄层扫描法中的荧光扫描法,荧光分析的应用,1.有机化合物的荧光分析,研究对象：芳香族及具有芳香结构的化合物,有机化合物：多环胺类、萘酚类、具有芳环或芳杂环结构的氨基酸类及蛋白质药物：生物碱类；甾体类；抗生素类(青霉素、四环；维生素类(维生素A、B1、B2、B6、B12等)中草药：有效成分（芳香性结构的大分子杂环类）,荧光试剂,荧光胺,荧光条件： ex=275、390nm， em=480n
12、m,适用：脂肪族和芳香族伯胺,邻苯二甲醛(OPA),适用：伯胺类、-氨基酸（除半胱氨酸、脯氨酸及羟脯氨酸）荧光条件： ex=340nm， em=455nm (2-巯基乙醇存在，pH910的缓冲溶液),2.无机化合物的荧光分析,测定方法：与具有电子共轭结构的有机化合物形成荧光配合物研究对象阳离子：Al、Au、B、Be、Ca、Cd、Cu、Eu、Ga、Gd、Ge、Hf、Mg、Nb、Rh、Ru、S、Sb、Se、Si、Sn、Ta、Tb、Th、Te、W、Zn、Zr阴离子：CN-、F-与Al、Zr离子强烈配合原有荧光配合物的荧光减弱甚至熄灭,课后练习,名词解释：荧光与磷光、振动弛豫溶液荧光光谱有哪些特征？能
13、够发射荧光的物质分子应同时具备哪些条件？为什么荧光分析法适用于稀溶液的测定？,填空题,1荧光是 物质分子接受光子能量被激发后，从激发态的 返回基态时发射出的光,2荧光和磷光的区别在于荧光是从单线激发态开始的，磷光是由 。,3荧光发射光谱也称荧光光谱，其发射波长总是 激发波长。,4能够发射荧光的物质应具备的条件是 、 。,5影响荧光强度的外部因素有 。,选择题,1荧光物质的激发光谱与紫外吸收光谱的形状：（ ）A完全一样 B基本相似C肯定不一样 D难以说清,B,2对荧光测定最有干扰的是：（ ）A波长比入射光长的瑞利光 B波长比入射光长的拉曼光 C波长比入射光短的瑞利光 D波长比入射光短的拉曼光,B,3下列对荧光的叙述正确的是：（ ）A从第一电子激发态的不同能级发出光量子回到基态 B从激发三线态的不同能级发出光量子回到基态C从第一电子激发态的最低振动能级发出光量子回到基态 D从激发三线态的最低振动能级发出光量子回到基态,C,1. 体系间跨跃是因为激发态分子和溶剂分子发生碰撞而交换能量所致。( ),判断题,2. 荧光光谱的形状不仅与物质的性质有关，而且还与激发波长有关。 （ ）,3. 一般而言，分子的共轭越多，刚性平面性越好，荧光效率越高。,4.在用荧光分光光度计测定时，仪器刻度一定要用对照品溶液进行校正。,(),(),
