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1、1,Mesenchymal Stem Cells and Acute Lung Injury,间质干细胞及急性肺损伤,2,ARDS was first recognized in the 1960s1 as a clinical syndrome of severe acute respiratory failure presenting with hypoxemia and bilateral pulmonary infiltrates, most often in the setting of pneumonia, sepsis, or major trauma.,ARDS最初在1960年
2、，被人们认识为严重急性呼吸衰竭的临床综合征；血氧不足和双边肺浸润，通常继发于肺炎、败血症、或严重的的创伤；,3,distinction between (ALI) and ARDS relates to the severity of hypoxemia, with the former having a PaO2/FiO2 of less than 300, the latter with a PaO2/FiO2 of less than 200. lung endothelial injury, alveolar epithelial injury, the accumulation of
3、 protein-rich fluid 、cellular debris in the alveolar space,急性肺损伤(ALI)和ARDS的区别主要指血氧不足严重程度，前者有PaO2 /FIO2小于300;后者PaO2 /FIO2不足200;ALI / ARDS的发病机制涉及肺血管内皮损伤, 肺泡上皮损伤,富含蛋白质液体的增加和肺泡腔内的细胞残骸.,4,流行病学,2005年,大约200000名患者在美国发展为ALI / ARDS,估计有40%的死亡率。采用肺保护性通气时代,死亡率下降大约25%。 In 2005, approximately 200,000 pts in the Un
4、ited States ALI/ARDS, with an estimated mortality of 40%. In the era of lung protective ventilation, mortality has declined to approximately 25%.,5,大量的临床试验,药物治疗吸入表面活性剂（ inhaled surfactant ）、一氧化氮（ nitric oxide ）、前列环素（ prostacyclins）,糖皮质激素（ glucocorticoids）,抗氧化剂（antioxidants）, 酮康唑（ketoconazole）并非ALI治疗
5、标准； ALI肺泡的病理生理，任何单一分子不可能逆转综合症的过程，使临床获益； reverse the course of this syndrome 、provide substantial clinical benefit.,6,细胞为基础的疗法 cell-based therapies 能产生炎症分子 molecules调节炎症反应 modulate inflammatory cascades 增强修复 enhance repair 间充质干细胞可能是理想的选择 Mesenchymal Stem Cells,7,间充质干细胞:一般属性,间充质干细胞(msc) self-renewing
6、isolated from bone marrow differentiate into muscle, bone, fat, fibroblasts, and cartilage. 能重建造血的环境 reconstitute a hematopoietic environment , regenerate bone tissue，起初被称为成纤维细胞的集落形成单位，(CFU-F)。这些细胞随后被称为骨髓基质细胞,并最终被命名为间充质干细胞。,8,最近一项研究表明，仍然不知道间充质干细胞是否来自中胚层,或者神经上皮,或来自不同来源的发展阶段。普遍认为间充质干细胞不仅可以从骨髓中分离，同样也可以
7、在脂肪,脐带血,胎盘组织、肌腱和骨骼肌分离。,9,国际上细胞治疗提出标准：1.粘附整形能力；2.能够表达CD105、CD73 CD90；不能表达CD45、 CD34、CD14 CD11b,CD79a、CD19和人类白细胞抗原(HLA)II；3.体外能分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞的能力。,10,基于分化能力，研究人员已经研究了这些细胞的可能修复受损肌肉、骨骼能力。然而，间充质干细胞拥有多种其他性能。,11,1.间充质干细胞能够产生各种各样的分子,包括造血因子,趋化因子和血管生成素。2.由于间充质干细胞存在骨髓中，他们有强大的免疫调节作用。3.间充质干细胞可以基因治疗的载体,并帮助诱导同种异
8、体骨髓移植耐受性。4.间充质干细胞被发现对疾病潜伏期模型中有利效果，例如从克罗恩病创伤性脑损伤。5.在过去的十年中,一些调查人员报告，动物模型中间充质干细胞可以减轻一些不同类型的肺部疾病。,12,间充质干细胞在肺部疾病,在博来霉素暴露小鼠肺纤维化的模型。分离小鼠的干细胞并且静脉注射，随后7天博来霉素诱导小鼠肺损伤，可以在博来霉素诱导肺损伤的区域发现外源性间充质干细胞存在，并且这些细胞具有上皮细胞的特征，博来霉素肺损伤小鼠后立即采用干细胞治疗显著降低肺内胶原蛋白沉积，减少基质蛋白酶2和9表达。,13,在肺移植中 抗炎作用的程度效果是处于惊人较低水平，随后报道中干细胞可以阻断博来霉素诱导增加白介素
9、1(IL)产生。博来霉素处理的小鼠前之前是否存在白消安诱导骨髓抑制，骨髓抑制增加了初始损伤和降低生存率。,14,受到绿色荧光蛋白(GFP)标记的间充质干细胞治疗的博来霉素受伤后6小时的小鼠，改善了生存率，与绿色荧光蛋白(GFP)标记的间充质干细胞能够表达成纤维细胞、肌纤维细胞以及I型和II型肺泡上皮细胞有关 .,15,同样试验，来自脐带的干细胞，静脉注射入博来霉素小鼠诱导小鼠体内，2周后在肺部发炎的部分发现干细胞存在， 干细胞能够减少胶原蛋白及细胞信号转导分子Smad2浓度，表明这些细胞已经具有抗纤维化属性。,16,在支气管肺的发育不良动物模型中，长期氧过多暴露老鼠气管内注入干细胞，发现能够显
10、著降低细胞凋亡、髓过氧化物酶活性和胶原沉积，以及炎性分子il - 6、肿瘤坏死因子(TNF)。此外,少数细胞分化成II型肺泡上皮细胞。同样试验也提示可以提高存活率及运动耐量改善, 和减少肺泡和肺血管损伤,以及肺动脉高压。类似试验间充质干细胞气管内给药，能够降低野百合碱诱导的大鼠肺动脉高压,改进血管内皮功能。,17,在由辐射引起的老鼠肺气肿模型中，报道称,间充质干细胞减少肺气肿形成，此外干细胞可以分化成II型肺泡上皮细胞。因此干细胞在肺部疾病的模型中有治疗作用，因为他们的抗炎特性,他们会特别适用于急性肺损伤。,18,干细胞在急性肺损伤和脓毒症的动物模型：有利的证据,脂多糖(LPS)被广泛用于急性
11、肺损伤的动物模型。通过气道给予脂多糖，48小时候诱发产生大量中性粒细胞聚集达到峰值，与微血管通透性增加有关。一些调查人员已经研究了在脂多糖诱导急性肺损伤中，干细胞作用。研究表明，经鼻腔注入脂多糖，干细胞4小时后在外周血中显著增加。,19,他们通过向受到辐照骨髓抑制小鼠，通过骨髓重建鼻内植入免疫荧光标记干细胞，3周后在肺部发现大量免疫荧光标记的干细胞。其中一些细胞表达细胞角蛋白,上皮细胞标记,而其他细胞表达CD34,内皮细胞的标记。,20,这些结果表明内源性干细胞可能在脂多糖诱导的急性炎症反应修复中起着重要的作用。一些试验中，低于致死剂量的辐照引起骨髓抑制，鼻腔内的脂多糖产生类似的组织学损伤和支
12、气管肺泡灌洗(BAL)中性细胞增多，一周后产生肺气肿表现。这些病变可以通过骨髓重建修复，表明缺乏内源性干细胞可能会破坏正常的修复过程。,21,在脂多糖植入的气管内小鼠体内，静脉注射干细胞30分钟，3天后可以发现显著减少肺泡灌洗液中总细胞和中性粒细胞计数。组织学分析证实明显减少炎症浸润,小叶间隔增厚,间质水肿。此外使用荧光标记干细胞,研究人员表明许多标记细胞在损伤肺部发现。,22,腹腔内注射脂多糖1毫克/公斤(使用剂量导致最小的死亡率),1小时后静脉注入干细胞细胞或成纤维细胞。组织学分析显示,干细胞,而不是成纤维细胞,可以显著降低肺部中性粒细胞在6、24和48小时后。,23,间充质干细胞小鼠气管
13、内的给药， 随后4小时5毫克/公斤脂多糖气管内给药，（可以产生显著的死亡率剂量）干细胞治疗后的小鼠改善生存相对于PBS-治疗后老鼠:80%和42%在48小时内,80%对18%在72小时。,24,干细胞减少肺损伤的严重程度通过肺水含量、湿/干比和BAL蛋白质浓度衡量。在48小时内组织学分析显示更少的出血和水肿。无活性的干细胞和成纤维细胞没有复制这种效果，表明未分化,有活性干细胞可以改善脂多糖诱导的急性肺损伤。,25,在肠杆菌肺炎模型中，这项工作得到进一步证实大肠杆菌诱导小鼠肺炎中。4个小时后,这些小鼠气管内注入干细胞、PBS,或成纤维细胞。通过BAL中性粒细胞计数衡量，干细胞显著降低了肺部炎症。
14、,26,最近研究了盲肠的结扎和穿刺(CLP)脓毒症小鼠模型。6个小时后，干细胞或盐水输注静脉注射。所有小鼠每天均有广谱抗生素治疗。,27,调查人员发现，干细胞治疗后小鼠肺泡灌洗液细胞计数和白蛋白减少。组织学证实28小时后减少炎症性肺部浸润,间质水肿。干细胞治疗的好处并不局限于肺部，因为干细胞治疗小鼠肾脏细胞凋亡减少,改善血清肌酐。脓毒症导致严重的全身性损伤,动物模型28小时45%的死亡率。干细胞治疗改善死亡率降低50%。,28,给予静脉注射(IV)干细胞或控制细胞(热-死亡细胞或皮肤成纤维细胞)前24小时或1小时后脓毒症小鼠模型中，每天广谱抗生素治疗。4天后显示干细胞治疗后显著生存率，干细胞治
15、疗后老鼠也有降低血清肌酐和肾小管损伤评分,改善肝脏糖原存储,并降低转氨酶,淀粉酶、和脾细胞凋亡。表明多系统性有益。大部分的这些效应观察，是在小鼠接受干细胞治疗前24小时。,29,干细胞在急性肺损伤和脓毒症动物模型:潜在的机制,在过去的几年里,调查人员检查了干细胞如何发挥他们的治疗效果在急性肺损伤和脓毒症模型中, 并且发现越来越多的潜在机制。第一位考虑原因为肺泡水肿液管理和去除。,30,内皮渗透性、上皮通透性和肺泡液体间隙,在肺泡水肿形成通过的肺泡内皮蛋白质通透性的增加，以及上皮屏障破坏，肺泡液体清除率下降。最近几组报道,干细胞能够减少急性肺损伤内皮通透性。肺泡灌洗液中白蛋白和蛋白质含量通常用作
16、的肺内皮通透性指标。,31,研究发现在脂多糖注入气管内3天后肺泡灌洗液中白蛋白、总蛋白和免疫球蛋白M(IgM)增加。肺损伤后干细胞静脉注射30分钟，可以减轻蛋白含量。血管生成素可能维持血管内皮细胞处于静止状态，同时可以被证明能减少渗透性,促进内皮细胞的存活。,32,在未损伤老鼠中干细胞可以进一步促进血管生成素减少BAL蛋白,白蛋白,IgM的水平由此推断干细胞静脉注射入肺循环中，可以促使血管生成素在血管内皮细胞中起作用，减少炎性细胞浸润,降低血浆蛋白漏到肺泡腔。,33,最近报道,静脉输液干细胞注入脓毒症小鼠体内28小时可以减少肺泡灌洗液中白蛋白，表明干细胞细胞减少脓毒症内皮通透性一些学者在相关肺
17、炎模型中进一步检测了干细胞效果，他们报道称,老鼠给与大肠杆菌气管内注射，18小时后肺泡灌洗液中白蛋白明显增加，但是损伤后4小时，气管内注射干细胞(但不包括成纤维细胞)，可以白蛋白明显减少。,34,正如前面指出的,测量肺泡灌洗液蛋白质可以评估肺血管内皮通透性、上皮通透性,肺水含量。肺泡上皮细胞通常形成一个比内皮细胞更紧密的屏障,急性肺损伤中失去完整性具有重要意义。一些试验试图研究干细胞对肺泡上皮细胞的影响。,35,当暴露在强效的炎性细胞因子(IL-1b,TNF-a,和干扰素(IFN), 上皮细胞层蛋白质渗透率增加大约500%。但是当植入同种异体干细胞，蛋白质渗透性减少到控制水平。这些发现表明在急
18、性肺损伤炎症反应中干细胞提高关键肺泡上皮的屏障功能,36,肺泡液体清除率是肺上皮细胞的清除任何原因肺泡液体,肺水肿能力。ALI / ARDS中通常是肺泡液体清除率受损与恶化的结果。很多情况下可以减少肺泡液体清除率,包括高潮气量、细菌,和促炎细胞因子 研究发现发现气管内注入干细胞在急性肺损伤4小时后减少多余的肺水。,37,一个体外肺灌注的试验，用来测试干细胞在急性肺损伤中效果。在这个模型中,脂多糖导致肺泡液体清除率明显减少,从每小时大约20%到接近每小时0%。成纤维细胞滴注肺受伤1小时后，肺泡液体清除率没有影响。然而,滴注人类干细胞后肺泡液体清除率至基线水平。,38,因此,得出结论干细胞似乎改善
19、内皮/上皮通透性和以及肺泡液体清除率。,39,移植,干细胞最初注意到分化为骨,脂肪,肌肉,和软骨，研究人员发现在1990年代末,在一定条件下,这些细胞可以发展为一个非中层表型。标记的干细胞融入博来霉素损伤后肺组织，表现出肺泡的二型肺细胞的形态学和分子特征。,40,静脉注射脂多糖和静脉注入干细胞24小时后，大量标记干细胞在肺实质被发现。然而,2周后,很少有标记的细胞存在,这表明大量存在的干细胞在急性肺损伤中只是一种短暂的现象。,41,对小鼠每日雾化脂多糖7天,第一天灌注入干细胞。其中一些动物中,细胞可以表达Ang-1，输液后14天,标记细胞出现在肺内，但是这些细胞没有进一步的特征 。综上所述,数
20、据表明,干细胞可以分化为成熟的肺细胞，在急性肺损伤可能发生在低水平,但不太可能产生的有益效果。,42,免疫调节,干细胞一直以来证明能够抑制记忆T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞,单核细胞的分化和功能。研究表明脓毒症模型中气管内的注入干细胞可以使肺泡灌洗液中促炎细胞因子TNF-a和巨噬细胞炎性蛋白(MIP)2水平降低。同时有一个相应的增加抗炎细胞因子il - 10、IL-1ra IL-13。,43,这些研究结果表明,在急性肺损伤中，干细胞可以促使肺环境从促炎到抗炎转变。研究表明静脉注射干细胞可以延缓脂多糖诱导的急性肺损伤中血清促炎因子IFN-g IL-1b MIP-1a,KC(引发的小鼠相同器
21、官)。脓毒症小鼠动物模型中，可以静脉注射干细胞可以减少血清TNF-a和lL - 6,但在受伤 24小时后增加Il - 10 。,44,他们还发现,干细胞治疗可以减少过氧物酶在脂多糖诱导小鼠脓毒症的肝脏和肾脏中水平,表明中性粒细胞入侵减少和器官损伤有关。然后,他们进行了一系列实验来帮助阐明分子信号驱动这些影响。干细胞治疗可以改善缺乏成熟的T细胞和B细胞基因敲除的小鼠，以及NK细胞缺陷老鼠的生存率。,45,接下来他们耗尽小鼠单核细胞和巨噬细胞发现干细胞治疗不再有效, 这表明这些细胞通过干细胞治疗施加有益的影响。体外实验中脂多糖刺激小鼠动物模型，干细胞被证明增加环氧酶的表达和活性，其次是增加前列腺素
22、E2(PGE2)的水平。干细胞与巨噬细胞一起培养,脂多糖模型中发现增加il 10。在一系列的实验中,这种效果产生被证明依靠TLR4,MyD88 TLR4 NF-kB,TNF-a和TNF受体存在,46,在额外的实验中,他们发现,巨噬细胞反应通过EP2 PGE2和EP4受体由此得出结论脓毒症中重组巨噬细胞分泌il 10激活干细胞,这减少了中性粒细胞迁移并且在组织中帮助减轻组织损伤。,47,据报道, 脂多糖诱导脓毒症24小时后,小鼠静脉治疗，多能干细胞(伤后6小时)减少血清促炎的细胞因子,il - 6、IL-1b KC，和趋化因子配体5( CCL5)。血清il - 10也减少了,在原先实验中这种现象
23、相反 。目前尚不清楚为什么il 10在一个实验中增加，在另一个实验中减少,这可能与技术差异，干细胞在损伤后注入的时间有关。,48,抗菌效果,这一直令人困惑的是干细胞除了可以有效的抗炎效果，然而却显著改善由细菌引起的败血症小鼠生存率。一些令人兴奋的最近的实验表明,这似乎是由于干细胞减少细菌的负担能力。试验发现，脓毒症小鼠模型中静脉注射脂多糖6小时后，生存率极大改善。他们比较损伤后28小时脾脏细菌菌落数,干细胞治疗后菌落数下降一个数量级别 。,49,下一步他们分离了小鼠腹膜内和脾脏的总细胞数量或CD11b1片段(单核细胞/巨噬细胞和中性粒细胞)，损伤后24小时。他们发现干细胞治疗后总细胞数和CD1
24、1b1分数增加了革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌的噬菌作用的能力。额外的实验表明,干细胞本身很少从事吞噬作用,表明他们必须间接调节宿主的吞噬细胞能力,50,最近报道,干细胞具有额外的抗菌性。这些研究人员首先发现,干细胞(比较成纤维细胞)减少大肠杆菌体外的生长 。,51,干细胞条件培养基对革兰氏阴性细菌生长没有影响,除非这些细胞原先被大肠杆菌细胞刺激,表明这种诱导产生抗菌物质。他们筛选细菌刺激的干细胞的培养基发现大量的人类(LL-37)。合成LL-37减少大肠杆菌和铜绿色假单胞菌的生长，当与LL-37抑制性抗体同时培养时,受刺激的干细胞失去了抗菌活性。当老鼠大肠杆菌气管内注射，的然后用干细胞治疗4小时
25、后,肺泡灌洗液显示超过一个数量级减少细菌。同时使用LL-37抗体，效果却明显下降。,52,总的来说,结果表明细胞对细菌起到直接的作用和积极调节宿主的噬菌作用的能力。未来的实验应该帮助阐明的确切的细胞和分子途径噬菌作用,和可能识别额外的直接的抗菌效果。,53,其他可能的机制,最近的一些研究也揭示了干细胞和组织细胞之间全新的互动机制。一些研究者通过使用溴化乙锭改变DNA来减弱A549细胞线粒体功能。随后这些细胞同干细胞一起培养后，A549细胞获得了线粒体功能，这些线粒体DNA同干细胞DNA相互匹配。延时的显微镜检提示干细胞可以逐渐向A549细胞细胞质扩展，并且通过这种扩展线粒体大量转运。然而这份报
26、告并未确定线粒体的超微结构的机制转移。,54,最近显示体外骨髓间充质向心脏肌细胞线粒体转移。电子显微镜显示了极薄的结构称为纳米管，线粒体似乎通过纳米管转运。线粒体是否通过囊泡、纳米管或一些其他机制转运，观察发现干细胞能通过直接转移他们的线粒体，积极的挽救缺乏免疫力的细胞，显示另一个潜在的有益的体内作用，因为线粒体缺陷是的许多器官损害模型的共同特性。,55,微泡被多种类型的细胞释放,其中包括干细胞,同时微泡最近被认为是一个重要的通信机制。胚胎干细胞已被证明通过微囊泡重组造血祖细胞的DNA。间质干细胞似乎同样释放微泡。,56,最近研究表明，间质干细胞可以诱导微泡增加肾小管上皮细胞在体外的增殖,使得
27、可以抵抗肾小管上皮细胞凋亡。接下来研究表明，在严重免疫缺陷小鼠,间质干细胞及微囊泡有类似的保护作用，抵抗甘油所致的急性肾损伤。在体内及体外试验中，核糖核酸酶可以消除这种这种积极效果，提示这种效应是由间质干细胞DNA所产生的。基因芯片分析显示，间质干细胞微泡与MRNA转录、增殖、免疫细胞的监管有关，,57,最近试验表明,间质干细胞所诱导的微泡含有小分子核糖核酸。微泡或线粒体转移具体在急性肺损伤模型中扮演角色，仍然没有确定。,58,前瞻研究,对MSC生物学功能还有待发现。这些细胞通过令人印象深刻的和不断增长的机制发挥广泛效果。未来的工作将进一步阐明移植、免疫调节、抗菌效果,线粒体转移,遗传信息的相
28、关的贡献。一些额外的基本问题仍然存在。缺乏可靠的细胞表面标记极大地限制了这些细胞的体内研究。没有专门提供干细胞基因敲除的老鼠、没有具体干细胞的启动因子或免疫组织化学标记,如何在体外骨髓寻找干细胞成为一个重要问题。,59,同样重要的是，旁分泌因子和细胞接触独立通路与细胞接触依赖机制的关系在体内可以获得多少益处。干细胞越来越多广泛应用于临床。目前干细胞正在研究用于急性心肌细胞梗塞,扩张性心肌病、克罗恩病、慢性阻塞性肺疾病、中风、多发性硬化症、移植物抗宿主病,急性I型糖尿病糖尿病、糖尿病足溃疡、肝硬化和免疫重建综合症在人类免疫缺陷病毒,60,目前所有安全记录是令人放心的。然而,尚未有足够干细胞临床试验，应用于急性肺损伤或脓毒症,尽管本文中概述的有前途的工作。很可能这一点很快就会改变。最近的评述中，可能的临床试验的进一步将被讨论发现。,个人观点供参考，欢迎讨论！,
