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1、培养基的制备与灭菌,目的要求基本原理实验器材基本步骤,目的要求,掌握培养基的配制原理及方法学习高压蒸汽灭菌的基本原理及方法学习干热灭菌的操作技术,基本原理（一）,培养基的配制：培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质。不同种类的培养基中，一般应含有碳源、氮源、能源、无机盐、生长因子和水六大营养要素。,由于微生物营养类型复杂，不同微生物对营养物质的需求也不一样，因此，微生物培养基种类繁多。例如按培养的微生物不同可分为牛肉膏蛋白胨培养基（培养细菌）、高氏一号合成培养基（培养放线菌）和马丁氏培养基（培养真菌）等；按物理状态不同可分为固体培养基、半固体培养基和液体培养基等。配制固体
2、培养基时需加入1.5 %2.0 %的琼脂作凝固剂。 不同的微生物对培养基 pH要求不同，霉菌和酵母菌的培养基 pH一般是偏酸性的，而细菌和放线菌的培养基 pH一般为中性或微碱性。,实验器材,仪器或其他用具：搪瓷杯，试管，三角瓶，烧杯，量筒，玻棒，电磁炉、培养基分装器，高压蒸汽灭菌锅，精密pH试纸（pH 5.59.0），牛角匙，棉花（或橡胶塞），牛皮纸，记号笔，纱布，棉绳等。 溶液或试剂：牛肉膏，蛋白胨，可溶性淀粉，葡萄糖，NaCl，K2HPO4，KNO3，MgSO47H2O，FeSO47H2O，琼脂，孟加拉红，链霉素，1mol/L NaOH，1mol/L HCl等。,操作步骤,称量 溶化 调p
3、H 过滤 分装 加塞 包扎 灭菌 搁置斜面 无菌检查,称量：按培养基配方比例依次准确地称取所需药品逐一放入搪瓷杯中,溶化：在电炉上加热溶解。,注：琼脂要在沸水中溶解，用玻棒不断搅拌，直至完全溶解（分装试管）。也可先将一定量的液体培养基分装于三角烧瓶中，然后按1.5 %2.0 %的量将琼脂直接加入各三角烧瓶中，在高温灭菌时即被溶化(分装三角瓶)。,分装：液体培养基分装试管高度以1/4左右为宜；固体培养基分装试管高度一般不超过1/5，灭菌后制成斜面 。,加 塞,包 扎,高压蒸汽灭菌,摆 斜 面,搁置斜面：最好待培养基冷至50-60时摆斜面，以免形成大量冷凝水。搁置时要调整斜面的倾斜度，以斜面的长度
4、不超过试管总长的一半（图示）为宜。可以成扎摆放，凝固前切莫移动试管。,试管斜面的搁置与其长度的示意图,无菌检查：将灭菌的培养基放入37温箱中培养过夜，以检查灭菌是否彻底。,基本原理（二）,灭菌：是指采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施。微生物实验要求在无菌条件下进行，为此，实验用的器皿、培养基等都要预先包装并经灭菌后才可使用。微生物实验中常用的灭菌方法有干热灭菌、高压蒸汽灭菌、紫外线（UV）灭菌和过滤除菌等，可根据具体情况选用不同的灭菌方法。,高压蒸汽灭菌：是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅内的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸汽急剧地将
5、锅内的冷空气从排气阀中驱尽（即排气），然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌锅内的压力，从而使沸点增高，得到高于100的温度，导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。一般采用0.103 MPa的蒸汽压力，此时温度是121.1，维持1520 min。当灭菌物品中有易破坏的成分时，可采用较低温度115（蒸汽压力0.075 MPa）下维持30 min左右.,手提式高压蒸汽灭菌锅,图示 手提式灭菌锅结构1、安全阀；2、压力表；3、放气阀；4、软管；5、螺栓6、灭菌桶；7、筛架；8、水,锅内加适量水,装入待灭菌物品,插入排气软管；加盖，旋紧螺栓,加热，排气,升压保压：排气后，继续加
6、热使锅内蒸汽压缓慢上升。当锅内压力到达0.103MPa时，调节热源开关，使锅内压力维持所需灭菌温度，同时计算灭菌时间。一般培养基和玻璃器皿的灭菌需维持20min。降压：达到规定的灭菌时间后，关闭热源，锅内压力自然降至零压后，打开排气阀排气。 取料：开启锅盖和取出灭菌物品时，锅体表面的温度仍然很高，逸出的蒸汽也很烫。故取物品时要防止手及其他部位的皮肤烫伤。,基本原理（三）,干热灭菌：一般在电热干燥箱中利用热空气进行灭菌。与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度高（160 170），时间长（1.5 2h ）。但干热灭菌温度不能超过180，否则包器皿的纸或棉塞就会烤焦，甚至引起燃烧。干热灭菌仅适用于对空的玻
7、璃器皿或金属器具的消毒灭菌,操作步骤,玻璃器皿清洗 烘干 包装 放入干燥箱 165 ，2h 关电源，冷却,器皿包扎,移液管的包扎及移液管筒,干热灭菌,干热灭菌：165 ，1.52.0h,实验安排,牛肉膏蛋白胨培养基高氏一号培养基（同上）马丁氏培养基（同上）,3个组：各配1000ml，分装三角瓶（200ml/瓶）,1个组：配1000ml，分装三角瓶（150ml/瓶）,2个组：各配500ml，分装三角瓶（150ml/瓶）,实验安排（ 4人/组）,一、器皿包扎和灭菌 （1）培养皿12只（6只1包） （2）1mL移液管6支 （3）干热灭菌（160 ，2h）二、制备无菌水 （1）250mL三角瓶：内装玻璃珠和90mL水 （2）试管6支：分装9mL水/支 （3）牛皮纸包扎，高压蒸汽灭菌(121 ,20min),
