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1、2014-10,疑难血型鉴定与疑难配血,山西省血液中心太原市红十字血液中心 张德梅,疑难血型疑难配血,主要内容,血型-血液中各种成分的遗传多态性标志-血型包括红细胞血型、白细胞血型、血小板血型、血清蛋白型等-稀有血型-按美国稀有血型供者库规定，在人群中的频率1者，称稀有血型；在人群中的频率1/万者，称极稀有血型-我国对稀有血型尚无明确标准，一般认为Rh阴性就属稀有血型。,疑难血型-疑难血型是一种血型难以检定或判定的现象-在血型分类中没有疑难血型，文献中也查不到疑难血型的定义。-一份样本的血型检定是否疑难，除了样本本身的特殊性外，还与实验室设备，技术人员水平和经验等多种因素有关。-临床输血中，一
2、般只涉及ABO和RhD血型，不涉及其他血型系统的疑难血型。,ABO血型：根据红细胞膜上有无A抗原或/和B抗原，将血型分为A型、B型、AB型及O型四种。A型人血清中含抗B抗体，B型人血清中含抗A抗体，O型人血清中含抗A和抗B抗体，AB型人血清中不含ABO抗体。正定型：采用抗A和抗B试剂血清以凝集实验来检定红细胞上有无对应的A抗原或B抗原。反定型：采用A型试剂红细胞和B型试剂红细胞检测血清中有无相应的抗A抗体和抗B抗体。同时从正定型和反定型两项实验来检定样本的ABO血型。,O型红细胞的作用可以提示抗-H(如孟买型)、某些IgM类不规则抗体，冷凝素或自身抗体。,ABO血型检定方法-玻片法 简单、快速
3、，基本没有实验条件的限制-试管法 准确可靠-微板法 适用于大批量样本实验不同的方法用途不同，实验条件不同,玻片法:把混合物均匀涂开，使其覆盖面积大约20mm20mm。缓慢连续倾斜转动玻片或纸片1分钟5分钟，观察结果。试管法：细胞的浓度2%-5%、最佳离心力（既不能大也不能小）结果观察：上清液有无溶血现象，细胞扣有无凝集块。微板法：细胞的浓度2%-5%、离心力（既不能大也不能小）结果观察：上清液有无溶血现象，细胞扣有无凝集块。,用洗涤充分的红细胞-可以去除红细胞上黏附的蛋白的干扰-可以去除样本血浆中含对试剂成分反应的物质。试管方法为经典方法离心机离心力校正。,疑难血型的特点-正定型凝集弱于2+或
4、反定型弱于1+（正常凝集3+4+）-正反定型不一致- 抗-A，B与抗-A/抗-B的凝集强弱不平行或凝集呈mf。,干扰血型正确检定的常见因素生理因素-年龄-ABO亚型-先天无抗体-冷凝集素,实验技术原因-样本混淆-静脉输液处采样 -试剂质量问题或漏加试剂 -实验操作不规范,临床治疗-大量输液-静脉输入高分子药物 静脉输入高分子药物如甘露醇、右旋糖酐，羟乙基淀粉等，可导致红细胞呈钱串状，干扰结果判定。-近期输过异型红细胞（包括宫内输血）或异型血浆-异基因造血干细胞移植,疾病原因-白血病或某些其他造血系统恶性疾患，白血病血型“变异” 变少不变多，疾病缓解后，血型抗原恢复。 -肝脏疾病、结核病等血浆蛋
5、白紊乱干扰ABO正定型呈钱串样。-丙球蛋白过低血症-真性红细胞增多症、多发性骨髓瘤等-不规则抗体-感染 革兰阴性（G）菌感染,启动疑难血型分析思路推荐方法：三步法 参考输血免疫学实验技术人卫社第一步：排除人为因素或操作失误。首先需要排除在技术上可能发生的错误，规范地做重复试验 -重新采集血样-核对试剂、器材 核对试剂-复检ABO血型,第二步：了解临床资料，分析可能的原因-病人年龄小于1岁或大于60岁吗？-病人的丙球蛋白浓度减低吗？-病人的诊断是白血病、肠道阻塞、胃癌、结肠或直肠癌瘤吗？-病人做过骨髓移植手术吗？-病人是一位经产妇吗？-病人近期输过血吗？,第三步：排除不可能的原因，归纳不能排除的
6、原因，设计验证试验。举例说明红细胞抗原减弱或丢失-ABO亚型-正定型ABO抗原减弱红细胞额外反应-亚型抗体-自身抗体-获得性B抗原（类B）混合凝集（mf）,红细胞抗原减弱或丢失,-ABO亚型实验结果：正定型与反定型不一致，正定型被检红细胞凝集弱解决办法-加抗-AB、抗A1、抗-H（抗-AB、-H与抗-A或抗-B的凝集强弱不一致）,-吸收/放散试验-高效价的人源血清-血型物质检测-DNA鉴定亚型统计？,2.正定型ABO抗原减弱实验结果：正定型与反定型不一致，或正定型被检红细胞凝集弱，或正定型呈mf样。提示：临床诊断白血病或其他造血系统恶性疾患（如MDS），一般反定型不受干扰，（不会增强或出现额外
7、反应）偶见RhD抗原减弱者。一般病情缓解后血型抗原强度恢复,解决办法-抗原-抗体增强技术（4孵育1小时替代离心看结果）-加抗-AB-吸收/放散试验-血型物质检测-DNA鉴定与亚型的区别,红细胞额外反应,1.亚型抗体实验结果：抗-A w+，抗-B 0，AC 2+，BC 4+，OC 0，正定型被检红细胞凝集弱解决办法-加抗-AB、抗A1、抗-H-吸收/放散试验-血型物质检测-DNA鉴定,2.不规则抗体实验结果：抗-A 4+，抗-B 0，AC 0，BC 3+，OC 2+，临床提示：有输血史或妊娠史解决办法：-加-H和抗-AB-抗体筛选与鉴定,3.自身抗体实验结果：抗-A +，抗-B +，AC +，B
8、C +，OC +，直抗 +。临床提示：AIHA，自身红细胞被自身抗体致敏后在含蛋白的ABO定型血清中可能发生非特异性凝集解决办法：-37盐水洗涤红细胞至直抗阴性后检定血型。-红细胞经甘氨酸/HCl或二磷酸氯喹放散至直抗阴性后检定血型。,2.红细胞额外反应-获得性B抗原（类B）临床提示：细菌感染（尤其是肠道细菌感染），以前为O型或A型。实验结果：解决方法-用酸化（pH 6.0）抗-B检测（无凝集）-吸收放散实验，吸收抗-B的能力弱，区别于亚型*临床追踪，感染控制后“类B”现象消失,混合凝集（mf）,混合凝集（mf）：部分红细胞凝集（大凝集块）部分红细胞均匀分布（背景浑浊）-近期输异型血-造血干细
9、胞移植,ABO血型不同的造血干细胞移植后，如果植入存活，受者逐渐转变为供者血型的过程中，可能呈嵌合体状态。如果供者O型，受者非O型，受者的A或B抗原逐渐减弱，抗体逐渐被检出。是移植物存活的指标之一。,三个月内输异型血，一般直接抗人球蛋白试验（DAT）阳性血型鉴定：毛细管离心法（分离年轻和衰老红细胞）DNA鉴定（供者白细胞在受者外周血中存活期短，一般不干扰受者DNA鉴定）,RhD误定-D抗原阳性误定阴性，D抗原阴性误定阳性-特例弱D-D抗原遮断,解决疑难血型攻略采用最经典的试管方法用洗涤充分的红细胞制备悬液增加高效价人源抗血清检测增加抗-AB、抗-H和抗A1检测吸收放散实验DNA检测直抗试验*。
10、,血型检定，抗体筛查和交叉配血三步也是确保安全有效输血的三关，交叉配血是最后一关，也是“三关”中最重要的一关。只要交叉配血真正相合（相容），将血液输给患者才是安全的。,主侧配血-患者血清与供者红细胞配血次侧配血-供者血清与患者红细胞配血-全血要求交叉配血-血浆则只要求ABO同型输注。-不含血浆的红细胞只要求主侧配血,一般情况下，只要ABO、RhD血型检定正确 供/受者ABO、RhD同型配血，多数情况是相合的如果不相合，则视为“疑难配血”一般只有配血相合，才能输血配血不相合，不能输血特殊情况例外,交叉配血的方法聚凝胺配血？抗球蛋白试剂配血？卡式配血？,AABB推荐方法The Antiglobul
11、in Test Other Methods to DetectAntigen-Antibody ReactionsSolid-Phase Red Cell Adherence TestsColumn Agglutination TechnologyEnzyme-Linked Immunosorbent Assay,全国临床检验操作规程第二篇临床血液学检验第六章血型血清学检查p246-271第七节交叉配血试验p262一、 交叉配血方法p262-264（一）盐水介质配血法（二）酶技术配血法（三）抗人球蛋白配血法 (四) LISS 配血法 (五)微柱凝胶卡配血法 详见本章第四节第六部分。第四节血清学
12、常用检查 六、凝聚胶试验P258第八节 微柱凝胶试验 可用于交叉配血p265,抗球蛋白试验(也成Coombs试验），它是以抗人球蛋白试剂作为连接桥，使不完全抗体致敏的红细胞连接并发生凝集。,微柱凝胶实验（简称 MCGT） 1986 年法国的Yves Lapierre 首先发明此方法, 1994年获美国FDA批准使用 -凝胶过滤技术和免疫学的产物 -是抗人球蛋白试验的技术延伸原理：一定浓度的凝胶如筛子，把产生凝集的细胞团块阻挡于凝胶顶部，没有产生凝集的单个细胞则能够通过离心沉降于微管底部。,微柱凝胶实验,4+ 3+ 2+ 1+ +/- - 溶血 双群,；,阳性,阴性,微管凝胶检测技术的关键是凝胶
13、，通过凝胶的浓度来控制凝胶间隙的大小；凝胶试剂中已经加好了抗球蛋白，从而简化了操作过程，只需加入样本即可；高敏感性、高特异性和可重复性等优点；假阴性？假阳性？质量的可靠性?LISS的应用？,聚凝胺是一种由四个铵聚合而成的高阳离子聚合体。红细胞血型抗原与相应的抗体在低离子介质中快速孵育致敏后，加入带正电荷的聚凝胺大分子聚合物后，中和红细胞表面唾液酸所带的负电荷，减弱红细胞间的静电斥力，缩短红细胞间的距离，促使红细胞凝集或聚集。它可使正常红细胞聚集，而在加入柠檬酸盐时又可使聚集的红细胞散开。当红细胞上有IgG抗体结合时，聚凝胺所造成的凝集是不可逆的，加入柠檬酸盐时不会散开，呈现出肉眼可见的凝集现象
14、。,凝聚胺不是一个特异性的试验,如果凝聚胺结果阳性， 必须用抗球蛋白试验做确认。用凝聚胺试验技术交叉配血，出现不配合时，要用抗人球蛋白试验重复。结果不一致，以抗人球蛋白试验结果为准。参考文献：中国输血丛书输血免疫血液学实验技术，人民卫生出版社，2011，：75-76,任何一种实验方法都不可能百分之百准确无误，都有假阳性或假阴性。假阴性可能导致患者被输入并非真正相合的红细胞，从而导致患者发生免疫学反应，（急性或迟发生性溶血性输血反应，或红细胞输进体内后寿命缩短）。假阳性则造成人力和资源的浪费。,聚凝胺试剂漏检抗体举例,骨髓瘤患者有多次输血史，因抗筛阳性送检（抗球蛋白卡法）。血型鉴定： B型,Cc
15、DEe 直抗：1+抗筛结果： 抗体鉴定是-Jka抗体，提供Jka抗原阴性血液。,抗球蛋白试剂漏检抗体举例,溶血性贫血患者有多次输血史，因抗筛（卡式）阴性，凝聚胺配血不合送检。血型鉴定： O型,CcDEE 直抗：1+ 抗筛 阴性对照 阳性对照 盐水 0 0 0 0 0 poly 2+ 0 2+ 0 3+ AHG 0 0 0 0 3+ MGT 0 0 0 0 3+在聚凝胺介质中试验反应结果符合抗-e格局抗体鉴定证明是-e，提供e抗原阴性血液。,不同的情况采取不同的检测技术-常规-急诊-输血无效-输血反应建立适合本实验室的免疫血液学检测技术-医院实验室-血站实验室,盐水法：IgM抗体、ABO血型的复
16、核；凝聚胺试验和抗人球蛋白试验：IgG抗体筛查抗人球蛋白试验仍然不可替代，遇到异常的实验结果时，应以抗人球蛋白法为准。,主侧配血不相合的原因 1.患者血清的原因-针对供者红细胞的同种抗体。-自身抗体-冷凝集素：实验操作在37进行。-血清（浆）蛋白紊乱（A/G倒置、M蛋白等）：假凝集，红细胞膜完整，加生理盐水稀释后散开 2. 供者红细胞的原因（很少见）-直抗阳性：该红细胞不宜用于输血，换一袋,主侧配血不相容的原因和对策,次侧配血不相合的原因 1. 供者血清的原因-针对患者红细胞的同种抗体；-自身抗体；-冷凝集素；-血清（浆）蛋白紊乱。解决办法：更换一袋血 2. 患者红细胞的原因-全凝集或多凝集；
17、-黏附免疫球蛋白或抗体。,常见的疑难配血-产生了不规则抗体的患者*选择不含与抗体特异性对应的抗原的供者红细胞输血 -有自身抗体的患者例如：AIHA患者，如果DAT+、IAT-，一般不干扰主侧配血；如果DAT+、IAT+，血清中存在游离的自身抗体，则主侧配血总是不合。,AIHA患者的配血？自身抗体存在，配血总是不相容，单纯自身抗体导致配血不相容不是输血禁忌。但是如果被自身抗体掩盖的同种抗体漏检，则可能发生严重的溶血性输血反应。AIHA患者如果抗体筛查阴性，选择ABO、RhD同型血输注；如果含不规则抗体，则选择ABO、RhD同型，不规则抗体对应抗原阴性的红细胞输注，配血并无临床意义。,感谢大家的耐心！,Tel：13834532717,
